Die Analyse der RNA-Prozessierung Reaktionen mit Handy Free Systems: 3 'Ende Spaltung von prä-mRNA-Substrate
3. Mai 2014
RNA-Polymerase II synthetisiert eine Vorläufer-RNA, die über das 3'-Ende der reifen mRNA erstreckt. Das Ende der reifen RNA cotranscriptionally über die Endonuklease-Aktivität der Spaltungskomplex erzeugt wird, an einer Stelle, die durch RNA-Sequenzen bestimmt. Hier haben wir detailliert die Methode, um Spaltungsreaktionen in vitro zu studieren.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die dreifache primäre mRNA-Spaltung erfolgreich in vitro zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein transkriptionell aktiver nukleärer Extrakt aus in Suspension gezüchteten Zellen hergestellt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, radioaktiv markierte RNA-Substrate mittels In-vitro-Transkription herzustellen.
Der dritte Schritt besteht darin, die markierten RNA-Substrate mittels Gelelektrophorese zu reinigen. Der letzte Schritt ist die Zusammensetzung der Spaltungsreaktion, einschließlich des nukleären Extrakts und des markierten RNA-Substrats. Letztlich können die Ergebnisse mittels vertikaler radioaktiver Gelelektrophorese drei-primäre mRNA, nicht gespaltene Substrate und das gespaltene Produkt nachweisen.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, obwohl sie bereits seit den 1980er Jahren durchgeführt wird, da ihre Durchführung aufgrund zahlreicher spezifischer und herausfordernder Schritte im Verfahren nicht einfach ist. Zellen gewaschen, pelletiert und bereit zum Lysevorgang vorliegen lassen. Um mit diesem Protokoll zu beginnen, Puffer mit frischem DTT zum Zellpellet hinzufügen.
Geben Sie das Fünffache des geschätzten CPV hinzu und verwenden Sie eine Pipette, um das Pellet aufzulösen; lassen Sie die Suspension anschließend auf Eis abkühlen. Nach 10 Minuten die Zellen bei vier Grad Celsius in einem Schwenkkorbzentrifugenröhrchen zentrifugieren. Vorsichtig den Überstand absaugen.
Das Pellet hat etwas Lösung aufgenommen und sich vergrößert. Geben Sie dann ein CPV Puffer A hinzu und lösen Sie das Pellet vorsichtig mit einer Pipettenspitze auf. Gießen Sie die Suspension in einen vorgekühlten Homogenisator und lysieren Sie die Zellen mit fünf bis zwölf Hubbewegungen eines engen Stößels.
Entnehmen Sie eine kleine Aliquotprobe, geben Sie Trypanblau hinzu und überprüfen Sie die Zellen, um den Grad ihrer Lyse zu bestimmen. Falls erforderlich, setzen Sie die Homogenisierung der Zellen fort, bis 90 % lysiert sind, übertreiben Sie es jedoch nicht. Überführen Sie nun das Lysat in ein ultraklares Ultrazentrifugenröhrchen.
Notieren Sie das Gesamtvolumen und zentrifugieren Sie wie zuvor. Aspirieren Sie den trüben Überstand und bewahren Sie ihn auf Eis auf. Für die Analyse des Zytosols achten Sie darauf, das Pellet nicht aufzuwirbeln.
Es enthält die Kerne. Zentrifugieren Sie das Pellet anschließend 15 Minuten lang mit hoher Geschwindigkeit. Entfernen Sie das kleine Volumen des verbleibenden Überstandes und vereinigen Sie es mit der Zytosol-Fraktion.
Bestimmen Sie dann das PACT-Kernvolumen. Geben Sie eine volumenäquivalente Menge Puffer C zum Pellet. Lösen Sie anschließend das Pellet mit der Pipette in einem Down-Homogenisator auf.
Verwenden Sie fünf bis zehn kräftige Stößelstöße, um den Pellet wieder aufzuschwemmen. Suspendieren Sie den Pellet. Überführen Sie das Homogenat in ein gekühltes Röhrchen und mischen Sie es durch Inversion für 30 Minuten.
Bei vier Grad Celsius kann ein Rührer verwendet werden. Falls das Volumen ausreichend groß ist, überführen Sie das Lysat in ein UltraClear-Ultrazentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es bei vier Grad Celsius 30 Minuten lang. Bei etwa 25.000 ×g ist der Überstand das nukleäre Extrakt.
Befolgen Sie die Textanleitung, um die Dialyse von nur einem Mikrogramm Template abzuschließen. Bereiten Sie die Sonde durch In-vitro-Transkription unter Verwendung eines Kits mit einem SP6- oder T7-kompatiblen Promotor vor. Verwenden Sie beim Beladen der Gele drei Mikroliter Marker und alle 25 Mikroliter der Reaktionsansätze für jedes RNA-Substrat.
Vermeiden Sie zudem Kreuzkontaminationen, indem Sie die Gelen mit Transkripten ähnlicher Größe räumlich voneinander trennen. Führen Sie das Gel so durch, dass eine 600 Nukleotide lange Sonde etwa zwei Stunden lang bei 25 Watt läuft. Um die Position der Banden im Gel zu markieren, beleuchten Sie den belichteten Film mit einer Leuchtplatte und legen das eingeschweißte Gel darauf.
Richten Sie die Auto-Rad-Markierung und die sichtbare Markierung auf dem Film aus. Markieren Sie anschließend die Bandpositionen mit einem schwarzen Stift, um die Bänder zu entfernen. Wickleln Sie das Gel aus und schneiden Sie mit einer sauberen Klinge die Bandabschnitte aus. Überführen Sie jeden Abschnitt in ein eigenes Röhrchen und eluieren Sie die RNA gemäß Standardverfahren.
Nachdem alle Reagenzien vorbereitet wurden, erhitzen Sie die markierte RNA auf 80 Grad Celsius für zwei Minuten. Überführen Sie die RNA anschließend auf Eis, fügen Sie 10 % PVA hinzu und zentrifugieren Sie sie kurzzeitig mit hoher Geschwindigkeit, um Blasen zu entfernen. Danach bereiten Sie die Master-Mixes für jede Reaktion vor. Für jede Reaktion geben Sie 5,25 µL Master-Mix 1 ab.
Fügen Sie anschließend 6,25 µL der nuklearen Extraktmischung hinzu. Dann geben Sie 1 µL des markierten RNA-Substrats hinzu, das insgesamt auf 50 am verdünnt wurde. Jede Reaktion verwendet weniger als fünf am markierte RNA.
Nun das Reaktionsgemisch vorsichtig wirbeln und kurz zentrifugieren. Die Reaktion bis zu zwei Stunden bei 30 Grad Celsius ablaufen lassen. Eine Zeitreihe der Reaktion liefert die besten Ergebnisse. Nach dem Verdau der Proteine in der Reaktion mit Proteinase K und anschließender Reinigung der Reaktion mittels der Phenol-Chloroform-Methode die Produkte auf einer 6 %igen PAGE-Gel, drei Mikroliter Marker oder fünf Mikroliter pro Reaktionsprodukt pro Lane, auflaufen lassen.
Laufen Sie dann das Gel und bauen Sie die Gel-Apparatur anschließend sorgfältig auseinander. Um das Gel zu sammeln, drücken Sie Filterpapier fest darauf und drehen es um. Drücken Sie das Glas fest, um sicherzustellen, dass das Gel vollständig vom Papier erfasst wird.
Danach das Filterpapier langsam zusammen mit dem daran haftenden Gel abziehen. Die freiliegende Seite des Gels in Plastikfolie einwickeln und das Wickel mit Klebeband an der gegenüberliegenden Seite des Filterpapiers befestigen. Zum Abschluss das Gel für 15 Minuten in einen Trockner geben, wobei das Filterpapier der Vakuumseite zugewandt ist.
Analysieren Sie das Gel später, indem Sie es einem Film oder einem Phospho-Imager aussetzen. Das gespaltene RNA-Substrat ist das am langsamsten wandernde Band an der Oberseite des Gels.
Das spezifische gespaltene Produkt, das durch einen fetten Pfeil markiert ist, wandert im Gel mit der erwarteten Größe schneller. Dieses Produkt fehlt in der Kontrolle mit einer Punktmutation in der Pollier-Sequenz. Die Quantifizierung der Spaltungsaktivität erfolgte anhand einer DS-Metrik-Darstellung.
Vergleich des Verhältnisses von gespaltener zu gespaltener, auf gespaltene RNA normalisierter RNA gegenüber der Kontrolle. Mithilfe dieses Verfahrens können weitere Methoden wie ein Polyadenylierungs-Assay durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu klären, beispielsweise die Aktivität der PolyA-Polymerase. Dieser Assay wird durchgeführt, indem die Reaktionsbedingungen verändert werden, zum Beispiel durch Zugabe von Magnesium und Entfernen von EDTA.
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Übersicht
Diese Studie konzentriert sich auf die Untersuchung der drei-prime-mRNA-Spaltung in vitro, einem entscheidenden Prozess bei der RNA-Reifung. Die Methode beinhaltet die Verwendung eines transkriptionell aktiven nukleären Extrakts und radioaktiv markierter RNA-Substrate zur Analyse der Spaltreaktionen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- RNA-Biologie
- Molekularbiologie
- Biochemie
Hintergrund
- Die RNA-Polymerase II synthetisiert eine Vorläufer-RNA, die über das 3'-Ende der reifen mRNA hinausgeht.
- Der Spaltkomplex bestimmt die Stelle, an der die reife RNA gebildet wird.
- Kotranskriptionelle Prozesse sind essentiell für die Reifung der RNA.
- Das Verständnis von Spaltreaktionen kann Einblicke in die Mechanismen der RNA-Verarbeitung liefern.
Zweck der Studie
- Untersuchung der 3'-mRNA-Spaltung in vitro.
- Verständnis der Rolle von nukleären Extrakten bei der RNA-Verarbeitung.
- Analyse der Spaltprodukte mittels Gelelektrophorese.
Verwendete Methoden
- Herstellung eines transkriptionell aktiven nukleären Extrakts aus in Suspension wachsenden Zellen.
- Synthese radioaktiv markierter RNA-Substrate durch In-vitro-Transkription.
- Gelelektrophoretische Reinigung der markierten RNA-Substrate.
- Aufbau von Spaltreaktionen mit nukleärem Extrakt und markierten RNA-Substraten.
Hauptergebnisse
- Es wurde eine erfolgreiche Spaltung dreier mRNA-Substrate beobachtet.
- Die Ergebnisse wurden mittels vertikaler radioaktiver Gelelektrophorese analysiert.
- UNC-gespaltene Substrate und Spaltprodukte wurden identifiziert.
- Die Methodik bietet einen Rahmen zur Untersuchung von RNA-Spaltreaktionen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie beschreibt eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der mRNA-Spaltung in vitro.
- Das Verständnis der Spaltungsmechanismen kann das Wissen über die RNA-Verarbeitung erweitern.
- Die Ergebnisse tragen zum weiteren Gebiet der RNA-Biologie bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der RNA-3'-End-Prozessierung ist entscheidend für die Zielvalidierung bei RNA-basierten Therapeutika, da die präzise Transkript-Reifung die Proteinausprägung und funktionelle Ergebnisse beeinflusst. Dieser in-vitro-Spaltungsassay ermöglicht eine mechanistische Ent风险bewertung, indem er die biochemischen Anforderungen für die korrekte prä-mRNA-Prozessierung isoliert und so die Vorhersagbarkeit der Zielinteraktion stärkt. Die Methode bietet ein quantitatives, reproduzierbares System, um zu bewerten, wie genetische oder pharmakologische Störungen die RNA-Stabilität und -funktion beeinflussen, und unterstützt damit frühe Entscheidungen im Entdeckungsprozess.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von RNA-Verarbeitungsmechanismen, um transkriptspezifische Zielstrukturen, die an der Regulation der Genexpression beteiligt sind, zu validieren.
- Praktischer Wert: Bietet ein kontrolliertes System, um zu bewerten, wie Mutationen in Polyadenylierungssignalen die Spaltungseffizienz und die RNA-Stabilität beeinflussen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Messwerte der Spaltprodukte, um die Standardisierung von Assays zur Untersuchung von Modulatoren der RNA-Verarbeitungsfaktoren zu unterstützen.
- Operativer Wert: Nutzt eine gelförmige Detektion, um die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit über mehrere RNA-Substrate und experimentelle Bedingungen hinweg sicherzustellen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Modellierung krankheitsrelevanter Prozesse, indem RNA-Verarbeitungsdefekte mit abnormen Transkriptisoformen verknüpft werden, die in pathologischen Zuständen beobachtet werden.
- Operativer Wert: Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der mechanistischen Entdeckung zur präklinischen Validierung, indem biochemische Schwellenwerte für die funktionelle RNA-Reifung definiert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein, bei dem die Validierung des RNA-Ziels vor der Identifizierung von Leitverbindungen und der präklinischen Bewertung erfolgt, indem der funktionelle Einfluss der Transkriptverarbeitung auf die Proteinausbeute geklärt wird.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von RNA-regulatorischen Elementen und die mechanistische Entschärfung von Zielstrukturen, die an der mRNA-Reifung beteiligt sind.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte Substratpräparation und quantitative Produktdetektion mittels Gelelektrophorese.
- Analytik: Ermöglicht den Vergleich der Spaltungs-effizienz unter verschiedenen Bedingungen anhand normalisierter Produkt-zu-Substrat-Verhältnisse zur datengestützten Priorisierung von Zielstrukturen.
- Translationale Forschung: Vernetzt mit präklinischen Arbeiten, indem die Verarbeitungskompetenz als Biomarker für die Eignung RNA-basierter Therapeutika definiert wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Plattform zur Bewertung von RNA-gerichteten Wirkmodalitäten über mehrere Programme und Zielklassen hinweg.
Operationelle und Unternehmenswirkung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Validierung von RNA-Zielen, indem die Unsicherheiten bezüglich der Transkriptverarbeitungsmechanismen verringert werden.
- Operativer Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Herstellung nukleärer Extrakte und Quantifizierung markierter Substrate.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem die Genauigkeit der RNA-Verarbeitung mit der erwarteten Proteinausprägung und funktionellen Ergebnissen verknüpft wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem Ziele identifiziert werden, die über robuste und regulierbare Profile der RNA-Reifung verfügen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Molekularbiologie, RNA-Biochemie und radioaktiver Markierungstechniken.
- Benötigt eine Infrastruktur für Ultrazentrifugation, Gelelektrophorese und Autoradiographie zur Herstellung von Kernextrakten und zur Detektion der Produkte.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich Substratdesign, Reaktionsbedingungen und Quantifizierungsmethoden, um Vergleichbarkeit sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn der Assay auf unterschiedliche RNA-Substrate oder krankheitsrelevante Systeme angewendet wird.
- Eingeschränkt durch die technische Komplexität der Isolierung von Kernextrakten und die Notwendigkeit einer sorgfältigen Optimierung, um unspezifische Degradation zu vermeiden.
