Die Analyse der RNA-Prozessierung Reaktionen mit Handy Free Systems: 3 'Ende Spaltung von prä-mRNA-Substrate In-vitro-
3. Mai 2014
RNA-Polymerase II synthetisiert eine Vorläufer-RNA, die über das 3'-Ende der reifen mRNA erstreckt. Das Ende der reifen RNA cotranscriptionally über die Endonuklease-Aktivität der Spaltungskomplex erzeugt wird, an einer Stelle, die durch RNA-Sequenzen bestimmt. Hier haben wir detailliert die Methode, um Spaltungsreaktionen in vitro zu studieren.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Spaltung von drei prime-mRNAs in vitro erfolgreich zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst transkriptionell aktiver Kernextrakt aus Zellen hergestellt wird, die in Suspension gezüchtet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, radioaktiv markierte RNA-Substrate mittels in vitro Transkription herzustellen.
Der dritte Schritt besteht darin, die markierten RNA-Substrate gelaufzureinigen. Der letzte Schritt besteht darin, die Spaltungsreaktion zusammenzusetzen, einschließlich des Kernextrakts und des markierten RNA-Substrats. Letztendlich können die Ergebnisse drei Prime-mRNA, UNC-gespaltene Substrate und gespaltenes Produkt durch vertikale radioaktive Gelelektrophorese zeigen.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, obwohl sie seit den 1980er Jahren durchgeführt wird, ist sie nicht einfach auszuführen, da es viele spezifische Schritte während des Verfahrens gibt, die eine Herausforderung darstellen. Haben Sie die Zellen gewaschen, pelletiert und bereit zum Lyse. Um dieses Protokoll mit dem Zellpellet zu beginnen, fügen Sie Puffer mit frischem DTT hinzu.
Geben Sie fünf Volumina des geschätzten CPV hinzu und verwenden Sie eine Pipette, um das Pellet aufzubrechen und die Suspension auf Eis abkühlen zu lassen. Nach 10 Minuten schleudern Sie die Zellen bei vier Grad Celsius in einem schwingenden Eimer herunter. Durch die Zentrifuge wird der Überstand vorsichtig abgesaugt.
Das Pellet hat etwas Lösung aufgenommen und ist aufgequollen. Fügen Sie dann einen CPV Puffer A hinzu und brechen Sie das Pellet vorsichtig mit einer Pipettenspitze auf. Die Suspension wird in einen abgekühlten Homogenisator gegossen und mit fünf bis 12 Hüben eines festen Stößels die Zellen zerkleinert.
Entfernen Sie ein kleines Aliquot, tragen Sie Trianblau auf und überprüfen Sie die Zellen, um die Vollständigkeit ihrer Lyse zu bestimmen. Homogenisieren Sie die Zellen bei Bedarf weiter, bis sie zu 90 % lysiert sind, aber übertreiben Sie es nicht. Übertragen Sie nun das Lysat in ein ultraklares Ultrazentrifugenröhrchen.
Nehmen Sie die Gesamtlautstärke auf und drehen Sie sie wie zuvor. Saugen Sie den trüben Überstand an und bewahren Sie ihn auf Eis auf. Und achten Sie bei der Zytosolanalyse darauf, das Pellet nicht zu stören.
Er enthält die Kerne. Schleudern Sie anschließend das Pellet 15 Minuten lang mit hoher Geschwindigkeit herunter. Entfernen Sie das kleine Volumen des verbleibenden Überstands und poolen Sie es mit der Zytosolsammlung.
Bestimmen Sie dann das PACT-Kernvolumen. Geben Sie ein Volumenäquivalent von Puffer C zum Pellet. Entfernen Sie dann das Pellet mit der Pipette in einem sauberen Homogenisator.
Verwenden Sie fünf bis 10 enge Stößelhübe zur Wiederbelebung. Suspendieren Sie das Pellet. Das Homogenat in ein gekühltes Röhrchen umfüllen und 30 Minuten lang durch Inversion mischen.
Bei vier Grad Celsius darf eine Rührplatte verwendet werden. Wenn das Volumen groß genug ist, geben Sie das Lysat in ein UltraClear-Ultrazentrifugenröhrchen und schleudern Sie es bei vier Grad Celsius 30 Minuten lang herunter. Bei etwa 25.000 g ist der Überstand der Kernextrakt.
Führen Sie die Dialyse gemäß dem Textprotokoll mit nur einem Mikrogramm Schablone durch. Bereiten Sie die Sonde durch In-vitro-Transkription mit einem Kit mit einem SP 6- oder T 7-kompatiblen Promotor vor. Verwenden Sie beim Laden der Seite drei Mikroliter Marker und alle 25 Mikroliter der Reaktion für jedes RNA-Substrat
.Verhindern Sie auch Kreuzkontaminationen, indem Sie die Spuren von Transkripten ähnlicher Größe voneinander abhalten. Lassen Sie das Gel so laufen, dass eine 600-Nukleotid-Sonde etwa zwei Stunden später mit 25 Watt läuft. Um die Position der Gelbänder zu markieren, beleuchten Sie die belichtete Folie mit einem Leuchtkasten und legen Sie das eingewickelte Gel darauf.
Richten Sie die Auto-Rad-Markierung und die belichtete Markierung auf der Folie aus. Markieren Sie dann die Bandpositionen mit schwarzem Marker, um die Bänder zu entfernen. Packen Sie das Gel aus. Und mit einer sauberen Klinge werden die Bandenabschnitte des Gels herausgeschnitten, jeder Abschnitt in ein eigenes Röhrchen übertragen und die RNA nach Standardverfahren eluiert.
Nachdem alle Reagenzien vorbereitet wurden, erhitzen Sie die markierte RNA zwei Minuten lang auf 80 Grad Celsius. Übertragen Sie dann die RNA in den Eiswirbel, das 10%ige PVA, und drehen Sie es dann einige Minuten lang mit hoher Geschwindigkeit herunter, um Blasen zu entfernen, und fahren Sie dann mit der Herstellung der Mastermixe für jede Reaktion fort. Geben Sie für jede Reaktion 5,25 Mikroliter Mastermix eins ab.
Fügen Sie als nächstes 6,25 Mikroliter der Kernextraktmischung hinzu. Fügen Sie dann einen Mikroliter markiertes RNA-Substrat hinzu, das auf insgesamt 50 ano molar verdünnt ist. Jede Reaktion verwendet weniger als fünf anomolare markierte RNA.
Wirbeln Sie nun die Reaktionsgemische vorsichtig vor und schleudern Sie sie schnell herunter. Lassen Sie die Reaktion bis zu zwei Stunden bei 30 Grad Celsius stattfinden. Die Einnahme eines Zeitverlaufs der Reaktion liefert die besten Ergebnisse Nach der Verwendung von Proteinase K zur Verdauung des Proteins in der Reaktion und der anschließenden Reinigung der Reaktion Mit der Phenol-Chloroform-Methode lassen Sie die Produkte mit einer Seitenladung von 6 %, drei Mikrolitern Marker oder fünf Mikrolitern pro Reaktionsprodukt und Bahn laufen.
Lassen Sie dann das Gel laufen und zerlegen Sie das Gelgerät später vorsichtig. Um das Gel aufzufangen, drücken Sie das Filterpapier fest dagegen und drehen Sie es um. Drücken Sie fest auf das Glas, um sicherzustellen, dass das Gel vollständig vom Papier erfasst wird.
Ziehen Sie dann langsam das Filterpapier mit dem anhaftenden Gel ab. Wickeln Sie die freiliegende Seite des Gels in Plastik ein und kleben Sie die Folie auf das Filterpapier auf der anderen Seite. Zum Schluss legst du das Gel für 15 Minuten in einen Trockner, wobei das Filterpapier zum Vakuum zeigt.
Analysieren Sie das Gel später, indem Sie es einem Film oder Phospho-Imager aussetzen. Das Gespaltene. Das RNA-Substrat ist die am langsamsten wandernde Bande an der Spitze des Gels.
Das spezifische gespaltene Produkt, das durch einen fetten Pfeil gekennzeichnet ist, läuft in der erwarteten Größe schneller im Gel. Dieses Produkt fehlt bei der Kontrolle mit einer Punktmutation in der Pollier-Sequenz. Die Quantifizierung der Spaltungsaktivität wurde mit einem DS-metrischen Diagramm bestimmt.
Vergleicht man das Verhältnis von gespaltener zu gespaltener, RNA, normiert zur Kontrolle der gespaltenen RNA. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie ein Polyadenylierungsassay durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie z.B. die Aktivität der PolyA-Polymerase zu beantworten. Dieser Assay erfolgt durch Ändern der Reaktionsbedingungen, wie z. B. Zugabe von Magnesium und Entfernen von EDTA.
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Überblick
Diese Studie konzentriert sich auf die Untersuchung der drei Primär-mRNA-Spaltung in vitro, einem entscheidenden Prozess bei der RNA-Reifung. Die Methode beinhaltet die Verwendung eines transkriptionell aktiven nuklearen Extrakts und radioaktiv markierter RNA-Substrate zur Analyse von Spaltungsreaktionen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- RNA-Biologie
- Molekulare Biologie
- Biochemie
Hintergrund
- RNA-Polymerase II synthetisiert präkursorische RNA, die über das 3'-Ende der reifen mRNA hinausgeht.
- Der Spleißkomplex bestimmt die Stelle für die Erzeugung der reifen RNA.
- Cotranskriptionale Prozesse sind wesentlich für die RNA-Reifung.
- Das Verständnis von Spaltungsprozessen kann Einblicke in RNA-Verarbeitungsmechanismen geben.
Zweck der Studie
- Untersuchung der drei Primär-mRNA-Spaltung in vitro.
- Verständnis der Rolle von nuklearen Extrakten in der RNA-Verarbeitung.
- Analyse der Produkte von Spleißreaktionen mittels Gelelektrophorese.
Verwendete Methoden
- Präparation eines transkriptionell aktiven nuklearen Extrakts aus Suspensions-kultivierten Zellen.
- Synthese von radioaktiv markierten RNA-Substraten durch in vitro Transkription.
- Gel-Reinigung der markierten RNA-Substrate.
- Zusammenbau von Spleißreaktionen mit nuklearem Extrakt und markierten RNA-Substraten.
Hauptergebnisse
- Es wurde eine erfolgreiche Spaltung der drei Primär-mRNA-Substrate beobachtet.
- Die Ergebnisse wurden mittels vertikaler radioaktiver Gelelektrophorese analysiert.
- UNC-gespaltene Substrate und gespaltene Produkte wurden identifiziert.
- Die Methodik bietet einen Rahmen für die Untersuchung von RNA-Spaltungsprozessen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie beschreibt eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der mRNA-Spaltung in vitro.
- Das Verständnis der Spleißmechanismen kann das Wissen über RNA-Verarbeitung erweitern.
- Die Ergebnisse tragen zum breiteren Feld der RNA-Biologie bei.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Understanding RNA 3' end processing is critical for target validation in RNA-based therapeutics, where precise transcript maturation influences protein expression levels and functional outcomes. This in vitro cleavage assay enables mechanistic de-risking by isolating the biochemical requirements for accurate pre-mRNA processing, supporting predictive confidence in target engagement. The method provides a quantitative, reproducible system to evaluate how genetic or pharmacological perturbations affect RNA stability and function, informing early discovery decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of RNA processing mechanisms to validate transcript-specific targets involved in gene expression regulation.
- Operational Value: Provides a controlled system to assess how mutations in polyadenylation signals affect cleavage efficiency and RNA stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of cleavage products to support assay standardization for screening modulators of RNA processing factors.
- Operational Value: Uses gel-based detection to ensure reproducibility and scalability across multiple RNA substrates and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by linking RNA processing defects to aberrant transcript isoforms observed in pathological states.
- Operational Value: Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation by defining biochemical thresholds for functional RNA maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, where RNA target validation precedes lead identification and preclinical evaluation by clarifying the functional impact of transcript processing on protein output.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of RNA regulatory elements and mechanistic de-risking of targets involved in mRNA maturation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized substrate preparation and quantitative product detection via gel electrophoresis.
- Analytics: Enables comparison of cleavage efficiency across conditions using normalized product-to-substrate ratios for data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical work by defining processing competence as a biomarker for RNA-based therapeutic suitability.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating RNA-targeting modalities across multiple programs and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in RNA target validation by reducing ambiguity in transcript processing mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized nuclear extract preparation and labeled substrate quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking RNA processing fidelity to expected protein expression and functional outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying targets with robust, regulatable RNA maturation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA biochemistry, and radioactive labeling techniques.
- Dependent on ultracentrifugation, gel electrophoresis, and autoradiography infrastructure for nuclear extract preparation and product detection.
- Necessitates cross-team standardization of substrate design, reaction conditions, and quantification methods to ensure comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to diverse RNA substrates or disease-relevant systems.
- Limited by the technical complexity of nuclear extract isolation and the need for careful optimization to avoid nonspecific degradation.
