Endothelzellen Schlauchbildung Assay für die

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Gene oder Signalwege, die an der Angiogenese beteiligt sind, mithilfe einer schnellen und quantitativen In-vitro-Methode zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem primäre oder immortalisierte endotheliale Zellen am Tag vor dem Assay zunächst serumfrei kultiviert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die endothelialen Zellen 30 Minuten mit Calcine zu inkubieren und anschließend die Zellen mit PBS zu waschen.

Anschließend werden die Endothelzellen abgelöst, filtriert, um Zellklumpen zu entfernen, und gezählt. Im letzten Schritt werden die Endothelzellen mit konditioniertem Medium, das mögliche angiogenetische Faktoren enthält, gemischt und auf festem Basalmembran-Extrakt verteilt. Abschließend werden die Röhrennetzwerke mittels Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht und können anschließend mit speziellen Computerprogrammen quantifiziert werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden zur Untersuchung der Angiogenese liegt darin, dass sie einfach einzurichten ist, relativ kostengünstig, innerhalb weniger Stunden Tubuli bildet und quantifizierbar ist, was die Technik demonstriert. Ist Erica Bullwinkle eine Doktorandin in der Biologieabteilung der American University? Verwenden Sie das geeignete Medium, um drei B 11-Zellen zwei Tage vor Beginn des Assays in ein neues Gefäß zu überführen. Für optimale Ergebnisse sollten die Zellen im zweiten bis sechsten Passagenstadium verwendet werden.

Anschließend die Zellen 24 Stunden lang in supplementiertem DMM kultivieren. Wenn die Zellen bereit sind, werden sie serumfrei gehalten. Dazu das Medium durch Medium mit reduziertem Serumanteil ersetzen und die serumfrei gehaltenen Zellen weitere 24 Stunden kultivieren.

Für optimale Ergebnisse ist es wichtig, beim Hersteller zu überprüfen, ob die Konzentration der BME-Stammlösung 10 Milligramm pro Milliliter beträgt. Tauen Sie das Wachstumsfaktor-verminderte BME im Kühlschrank auf. Da BME bei warmer Temperatur erstarrt, wird es vor der Verwendung kalt gehalten.

Tauen Sie anschließend das für den Assay benötigte Medium zum Nachweis mittels Fluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie auf und geben Sie Calcein AM in das Medium mit einer Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter. Inkubieren Sie die mit Calcein AM markierten Zellen etwa 30 bis 45 Minuten im Dunkeln. Danach entfernen Sie das Medium und waschen die 3T3-B11-Zellen mit DPBS. Danach lösen Sie die Zellen durch Zugabe von einem Milliliter Trypsin-EDTA. Nach Abschluss der Trypsinierung.

Suspendieren Sie die Zellen in einem Endvolumen von 10 Milliliter. In supplementiertem DMM entfernen Sie Zellklumpen, indem Sie die Zellen durch einen 100-Mikrometer-Zellsieb filtrieren. Nach der Zellzählung suspendieren Sie die Zellen in der korrekten Endkonzentration, um den Röhrenbildungs-Assay zu beginnen.

Eine 24-Well-Platte und Einmilliliter-Spitzen für 20 bis 30 Minuten vor dem Beladen vorbereiten. Dadurch wird verhindert, dass das BME vorzeitig gerinnt. Wenn Sie bereit sind, 250 Mikroliter BME mit reduziertem Wachstumsfaktor in jedes Well einer 24-Well-Platte zu pipettieren, den Pipettierkolben nicht bis zum letzten Anschlag niedrücken, um Blasenbildung zu vermeiden.

Beim Pipettieren nach dem Befüllen der Vertiefungen überprüfen, ob ausreichend BME in der Mitte der Vertiefung verbleibt. Wenn sich der Meniskus bildet, bilden die Zellen lediglich eine Monoschicht, falls die Matrix zu dünn ist. Anschließend die Platte 30 Minuten lang inkubieren, um das BME zu verfestigen.

Nachdem das BME erstarrt ist, mischen Sie etwa 300 Mikroliter konditioniertes Medium mit 10 Mikrolitern der resuspendierten drei B 11-Zellen und portionieren Sie die Zellsuspension in die Vertiefungen der Platte. Nach dem Einbringen der Platte in den Inkubator bilden sich innerhalb von zwei bis vier Stunden Röhren; je nach Konzentration des angiogenen Faktors im konditionierten Medium kann die maximale Röhrenbildung zwischen drei und zwölf Stunden auftreten. Der Zeitpunkt des Assays muss für die jeweiligen Versuchsbedingungen optimiert werden.

Die Röhren beginnen oft innerhalb von 18 Stunden zu degenerieren, und die endothelialen Zellen werden zum Zeitpunkt der maximalen Röhrenbildung Apoptose durchlaufen. Aspirieren Sie das Medium vorsichtig aus der Vertiefung, um das Röhrennetzwerk nicht zu stören. Waschen Sie anschließend jede Vertiefung mit einem Milliliter DPBS, um eine sofortige Visualisierung zu ermöglichen.

Geben Sie ein Milliliter frisches DPBS in jede Vertiefung und nehmen Sie das Röhrennetzwerk mit einem konfokalen Mikroskop auf, um ein Röhrennetzwerk für die spätere Visualisierung zu fixieren. Fügen Sie 4 % Parafomaldehyd zu jeder abgesaugten Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Entfernen des Paraformaldehyds waschen Sie zweimal mit DPBS und geben dann ein Milliliter frisches DPBS in jede Vertiefung. Diese Bilder zeigen, dass angiogene Faktoren, die entweder von Maus-Keratinozyten oder Fibroblasten sezerniert werden, in der Lage sind, die Röhrenbildung zu induzieren.

Im Laufe der Zeit wandern Endothelzellen und beginnen innerhalb von ein bis zwei Stunden nach der Aussaat, kleine Ausläufer zu bilden. Die maximale Röhrenbildung wurde nach vier bis sechs Stunden erreicht. Nach 24 Stunden blieben einige Ausläufer erhalten, doch viele Zellen gingen in die Apoptose über und die Röhren begannen sich zu lösen.

Die Zellanzahl hat einen erheblichen Einfluss auf die Röhrenbildung. Wenn eine unzureichende Anzahl von Zellen ausgesät wird, bilden sich nur wenige Röhren und das Netzwerk ist minimal; je mehr Zellen ausgesät werden, desto umfangreicher wird das Röhrennetzwerk. Bei zu hoher Konzentration beginnen die Zellen jedoch zu agglomerieren oder Monolagen zu bilden, wodurch Unterschiede zwischen Behandlungsgruppen überdeckt werden. Die Zellen sollten mindestens zwei Passagen durchlaufen haben, um eine ausreichende Röhrenbildung sicherzustellen.

Die Wachstumsrate von drei B 11 ist so schnell, dass 25 % der Zellen bei einer Teilung am einen Tag am folgenden Tag einen konfluenten Kolben ergeben. Hier wird ImageJ mit dem Angiogenese-Plugin auf ein Calcein-AM-gefärbtes Röhrennetzwerk angewendet, um die Gesamtanzahl der Knoten, Röhren im Netzwerk in Kombination und die Verschmelzung im Netzwerk zu detektieren. Zusätzlich kann dieses Programm verwendet werden, um Knoten, Röhren oder Netzwerk einzeln zu detektieren, die quantifiziert werden können.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine in vitro Angiogenese schnell und zuverlässig durchführt und dabei häufige Fehlerquellen vermeidet.