AFM-basierte Mapping der elastischen Eigenschaften der Zellwände: auf der Tissue-, Handy-und subzellulärer Beschlüsse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die mechanischen Eigenschaften von Pflanzengeweben mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops abzubilden. Bereiten Sie zunächst Objektträger vor, indem Sie ein Tröpfchen mit Arous mit niedriger Schmelztemperatur auf einen geätzten Bereich des Objektträgers pipettieren, um einen dünnen Arous-Film zu bilden. Der zweite Schritt besteht darin, die Probe zu präparieren und zu montieren.

Entferne die Blütenknospen vom Stiel, schneide den Marris-Stiel vom Stiel ab und bette den abgeschnittenen Stiel sofort in die dünne Agros-Folie auf dem Glas ein. Schieben Sie als nächstes und fügen Sie genügend geschmolzenes Montageagros hinzu, um den Riss zu füllen, der beim Einbetten des Maris-Schaftes in die Aros-Folie entstanden ist. Der letzte Schritt besteht darin, das Rasterkraftmikroskop für die Datenerfassung einzurichten.

Letztendlich erzeugen die Datenanalyse und Messungen des scheinbaren Elastizitätsmoduls von Zellwänden eine mechanische Karte der Eigenschaften von Zellwänden gleichzeitig mit subzellulärer Auflösung und über ganze Geweberegionen hinweg. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der bestehenden Methode besteht darin, dass sie die mechanischen Eigenschaften der Zellwand gleichzeitig mit subzellulärer Auflösung und über die gesamte Region des Gewebes messen kann. Das Aros-Medium zum Einbetten von Proben wird aus 0,7 % niedriger Schmelztemperatur hergestellt, Aros aus 10 % Mannitol in Wasser.

Ätzen Sie mit einem starken Metallinstrument, wie z. B. einer Bohrspitze, einen 0,5 x 0,5 Zentimeter großen Bereich in der Mitte eines Mikroskopieglases. Rutsche: Dadurch wird die Oberfläche aufgeraut, um die Haftung des Agros zu erleichtern und sicherzustellen, dass das Agros-Medium am Schlitten haftet oder fixiert. Pipeda Tröpfchen von etwa 20 Mikrolitern Agros-Medien zum Einbetten von Agros-Medien in den geätzten Bereich des Objektträgers.

Dabei entsteht ein dünner Film aus Agros. Lagern Sie den Objektträger in einer feuchten Box und warten Sie, bis die Agros-Medien die Proben von Arabidopsis verfestigt haben. Ana wird für die Rasterkraftmikroskopie zur Präparation von Meristemproben eingesetzt.

Entferne die Blütenknospen eine nach der anderen vom Stiel, indem Du sie mit einer ultrafeinen Pinzette nach unten ziehst. Es ist wichtig, alle blumigen Knospen bis zu den Knospen zu entfernen, die keine Folgen aufweisen, die als P one stage primor bekannt sind. Schneide mit einer Rasierklinge oder der Spitze der Pinzette das Meristem vom Stiel ab.

Der Schnitt sollte parallel zu dem Bereich der Meristemoberfläche erfolgen, der mit dem Rasterkraftmikroskop oder einem FM gemessen werden soll. Der erhaltene Scheitelpunkt sollte zwischen 300 Mikrometern und 600 Mikrometern hoch sein, damit er während des Experiments nicht zerbröckelt. Schieben Sie die Spitze sofort in den dünnen Film aus aros media, der zuvor vorbereitet wurde. Wählen Sie eine Position auf dem Glasobjektträger oder Arous und drücken Sie sanft so, dass das Meristem sowohl direkt mit dem Glasobjektträger in Kontakt steht als auch aus dem Arous herausragt.

Der Agros bricht unter Druck, so dass der Mari-Stiel nun in einem Riss steht. Es ist wichtig, den Marit-Stiel innerhalb weniger Sekunden in den Aros zu positionieren, die auf die Schnitte vom Stiel folgen. Dadurch wird ein Austrocknen des MA-Stängels verhindert.

Mehrere MA-Stämme können auf diese Weise für die Batch-Bildgebung vorbereitet werden, sofern sie die gleiche Höhe haben und weniger als 500 Mikrometer voneinander entfernt positioniert sind. Bewahren Sie auf dem Objektträger die vorbereiteten Ma-Stängel in der Feuchtbox auf, während Sie weitere Proben präparieren. Bevor Du mit dem nächsten Schritt fortfährst, Entferne mit Filterpapier vorsichtig überschüssiges Wasser an der Grenze zwischen dem Meristem und den Blütenknospen.

Dadurch soll verhindert werden, dass das geschmolzene Agros die Probe aufgrund von Kapillarkräften überflutet. Später sollte der Aros mit einer 20-Mikroliter-Pipette an genügend geschmolzenem Montage-Agros, um den zuvor entstandenen Riss zu füllen und jedes Meristem zu umgeben, das Niveau der Narbe der entfernten Blütenknospe oder des Primor-Gyms erreichen. Um dies zu erreichen, kann es erforderlich sein, an jedem Ende des Risses Agros hinzuzufügen.

Wenn das Agros hinzugefügt wird, wird es schnell in den Riss geflutet. Saugen Sie mit der Pipette einen Teil des geschmolzenen Einbettmaterials an, um sicherzustellen, dass der Me-Stiel der höchste Punkt auf dem Objektträger ist. Dadurch wird der Stiel so fixiert, dass er sich während der Bildgebung von Wurzeln und Hypo-Coddeln nicht bewegen kann.

In dem dünnen Film von agros ist keine Sektion notwendig. Machen Sie auf dem vorbereiteten Objektträger mit einer Mikropinzette eine Rille entweder direkt über einer Ätzung im Glas oder entlang einer Glaslamelle. Positionieren Sie die Wurzel oder Hypo coddle in dieser Rille und stellen Sie sicher, dass sie entlang ihrer Grifflänge mit dem Glas in Kontakt ist. Geschmolzenes Einbettungs-Agros um die Probe herum auf die gleiche Weise zugeben, wie es für die Me-Stem-Probe gezeigt wurde.

Ein JP PK Nano-Zauberer. In dieser Demonstration wird ein FM verwendet. Um diesen Vorgang zu starten, montieren Sie einen Ausleger mit einer runden Vertiefung auf dem A FM. Der Radius bestimmt die X-, Y-, Z-Auflösung und die Eindringtiefe, bei der genaue Messungen archiviert werden können.

Um Messungen im Meso- bis Nanobereich an der Epidermisoberfläche durchzuführen, verwenden Sie eine runde Vertiefung mit einem Radius von 50 Nanometern. Um mesoskalige Messungen durchzuführen, verwenden Sie eine runde Vertiefung mit einem Radius von 0,5 Mikrometern, und um mikroskalige Messungen über zwei bis drei Zellen durchzuführen, verwenden Sie eine runde Vertiefung mit einem Radius von 2,5 Mikrometern, positionieren Sie den Laser an der Spitze des Auslegers. Richten Sie den Laser mit dem Spiegel auf die Mitte des Captors aus.

Positionieren Sie ein sauberes Glas unter dem A-FM-Ansatz mit einem Zielwert für den Sollwert von einem Volt, wählen Sie für die Spektroskopie. Führen Sie eine Eindringung durch, indem Sie den maximalen relativen Sollwert auf zwei Volt, die Ausfahrgeschwindigkeit auf 40 Mikrometer pro Sekunde und die Z-Länge auf fünf Mikrometer einstellen. Wählen Sie im Menü des Kalibrierungsmanagers den linearen Teil der Vorwärtskurve aus, um die Empfindlichkeit anzupassen.

Mit der Taste zum Auswählen des Anpassungsbereichs sollte der relative Sollwert bei 200 Mikrolitern 10%iger Manitollösung von vol auf Meter umgewandelt werden. Richten Sie den Laser unter der Cantilever-Spitze mit dem Spiegel wieder auf die Mitte des Captors aus und kalibrieren Sie die Empfindlichkeit über das Menü des Kalibrierungsmanagers neu, indem Sie den Respekter bewegen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Unbekannt", wählen Sie vier Spektroskopie aus und führen Sie eine Einrückung durch, wie zuvor gezeigt.

Wählen Sie den linearen Teil der Vorwärtskurve aus, um die Empfindlichkeit anzupassen, indem Sie die Schaltfläche "Anpassungsbereich auswählen" verwenden, um diesen Vorgang zu starten, positionieren Sie die eingefassten Proben unter dem A FM und fügen Sie den Proben ein 500-Mikroliter-Tröpfchen 10%iger Manitollösung hinzu. Das Plasma der Manitollösung, das die Zellen innerhalb von Minuten mit dem Zielwert für den Sollwert von 20 Nanonewton annähern, mit einem relativen Sollwert von 200 Nanonewton und einer Geschwindigkeit von 40 Mikrometern pro Sekunde und einer Z-Länge von fünf Mikrometern. Passen Sie den relativen Sollwert an, um eine Vertiefung von 100 Nanometern für den 200 Nanometer montierten Ausleger oder 0,5 Mikrometer für den Ein-Mikrometer-Ausleger zu erhalten.

Fünf Mikrometer montierter Cantilever-Force-Mapping-Modus. Wählen Sie einen Bereich aus, der nach Stämmen von 70 x 70 Mikrometern mit einer Auflösung von 64 x 64, nach Hypo-Cos und Wurzeln von 100 x 100 Mikrometern mit einer Auflösung von 64 x 64 gescannt werden soll. Drücken Sie auf Scannen, um die Experimente zu starten, und speichern Sie die Ausgabe.

Beginnen Sie damit, die Datendatei in der Datenanalysesoftware zu öffnen. Wählen Sie dann Stapelverarbeitung aus. Wenden Sie dieselbe Analyse auf alle Kurven einer einzelnen Karte an.

Wählen Sie die Option Höhe für die Biegung des Auslegers korrigieren, um die Eindringtiefe zu extrahieren. Wählen Sie die Modulus-Fit-Funktion von Young aus. Dabei wird davon ausgegangen, dass die Kraft proportional zur Eindruckfläche ist.

Legen Sie die Spitzenform auf parabolisch fest, um davon auszugehen, dass es sich bei der Eindruckform um eine Parabel handelt. Geben Sie den Radius der Spitze an. Wählen Sie anschließend die Rückzugskurve für die Analyse aus.

Die Rückzugskurve wird der xtend-Kurve vorgezogen, da sie weniger empfindlich auf die Topografie reagiert. Stellen Sie das Poso-Verhältnis auf 0,5 ein. Drücken Sie abschließend auf , analysieren Sie die Ausgabe und speichern Sie sie.

In allen Experimenten werden typische A FM junge modulare Karten von floralen Mars-Stängeln, jungen und alten Hypo-Coddles und Wurzel-MA-Stängeln gezeigt. Der Vertrag ist hemisphärisch, aber sein Radius unterscheidet sich, so dass unterschiedliche räumliche Auflösungen erreicht werden können. Diese Karten zeigen typische Ergebnisse für meso- bis nanoskalige Einkerbungen mit einem Radius von 50 Nanometern und 50 Nanometer Tiefeneinkerbungen.

Der Kardiograph zeigt mikroskalige Heterogenitäten in den Oberflächenzellwänden hypokodaler Epidermiszellen. Gezeigt werden auch typische Ergebnisse für mesoskalige Einkerbungen mit einem Radius von 500 Nanometern mit 500 Nanometer Tiefeneinkerbungen für Blütenmeristem, Hypo coddle und Wurzel. Dieser Kardiograph für mikroskalige Zahneinsätze mit einem Radius von 2,5 Mikrometern und Vertiefungen in 500 Nanometern zeigte eine Gewebeerweichung während der Organinitiierung, die einem sichtbaren Wachstum vorausging.

Dieser Scan wurde jedoch abgebrochen, da der Bereich der Probenhöhe den maximalen Z-Bereich des A FM überschritten hatte. Probenbewegungen während des Experiments aufgrund einer unsachgemäßen Fixierung können zu einem verschwommenen Scan führen, wie hier gezeigt. Regionen, die mit Agros bedeckt sind, können auch nicht richtig gemessen werden, wie in diesem Beispiel dargestellt. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.