Name: Eine schnelle und spezifische Mikroplatten-Assay zur Bestimmung der Intra-und extrazelluläre Ascorbat in kultivierten Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Lernen Sie einen schnellen Mikroplatten-Assay zur Bestimmung intra- und extrazellulärer Ascorbatspiegel in kultivierten Zellen. Diese kostengünstige Methode ermöglicht spezifische metabolische Analysen.

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Wir sind dankbar, dass Dr. Stephen Robinson und Frau Hania Czerwinska (Monash University) für die großzügige Versorgung der Astrozyten-Kulturen.

1. Bestimmen Intrazelluläre Ascorbat in kultivierten Zellen <ol><li> Zellkultur-und Ernte <ol><li> Wachsen Suspension (z. B. Mensch erythroleukemia, K562) oder adhärenten Zellen (zB primäre Astrozyten) mit Standard-Kulturverfahren 19-21,32,38. Hinweis: Um sicherzustellen, Zellen enthalten Ascorbat, laden kultivierten Zellen mit Ascorbat entweder als Ascorbat oder DHA 33,39. </li></ol></li><li> Neues Ascorbat haltigen Zellextrakt <ol><li> Inkubation eine entsprechende Anzahl von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gewaschen Aussetzung oder adhärenten Zellen mit 450 ul eiskaltem Zellpermeabilisierung Buffer [CPB; 0,1% (w / v) Saponin in PBS; 4 ° C]. Hinweis: Bestimmen der Anzahl von Zellen erforderlich ist, um einen Absorptionswert im linearen Bereich des Tests zu erhalten (siehe unten) empirisch durch den Endverbraucher. Hinweis: Gewebeextrakte können auch verwendet werden (siehe Diskussion für weitere Details). </li><li> Agitate Zellen auf Eis für 10 Minuten, um eine gründliche zelluläre Lyse zu gewährleisten. </li><li> Erstellen einer geklärten Ascorbat enthaltenden intrazellulären Extrakt durch Entfernen von Zelltrümmern durch Zentrifugieren des rohen Lysats bei 16.000 × g für 5 min in einer Mikrozentrifuge gekühlt (4 ° C). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig 4 x 100 ul Aliquots von jeder Probe, und fügen Sie eine horizontale Abfolge von Wells in einer 96-Well-Flachbodenplatte, die entweder 25 ul / Vertiefung PBS (&quot;-AO&quot;) oder nur 25 ul / Vertiefung von 45,5 U enthält / ml Stammlösung von L-Ascorbat-Oxidase (AO) in PBS (&quot;+ AO&quot;). Hinweis: Diese sollten parallel mit der Vorbereitung der Standards durchgeführt werden (siehe unten). </li></ol></li><li> Ascorbat Standard-Kurve Bau (muss für jeden Test neu gebaut werden) <ol><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM Ascorbinsäure in eiskaltem PBS. Hinweis: Überprüfen Sie, ob die Konzentration von Ascorbat spektrophotometrisch mit einer Quarz-Küvette mit einer 1cm Weglänge bei 265 nm (Extinktionskoeffizient = 14,5 mM -1 cm -1) 40. </li><li> Sorgfältig bereiten eine Reihe von Ascorbat Standards zwischen 0 und 20 uM. </li><li> Parallel zu Schritt 1.2.4, entfernen Sie vorsichtig 4 x 100 ul Aliquots von jedem Standard und fügen Sie zu einer horizontalen Folge von Vertiefungen in einer 96-Well-Flachbodenplatte, die 25 ul / Vertiefung enthält PBS (&quot;AO-&quot;) oder eine 45,5 U / ml Stammlösung von AO in PBS (&quot;+ AO&quot;). Hinweis: 100 ul der oben Ascorbat Standards 0-2 nmol Ascorbat enthalten. Bitte beachten Sie, dass der Zweck der AO für den Beitrag der nicht-Ascorbat Reduktions Reduktion Ferricyanid steuern. </li></ol></li><li> Bestimmen intrazellulären Ascorbat - Schritt 1: selektiv zu entfernen, Ascorbat und quantitativ oxidieren Ascorbat mit Ferricyanid <ol><li> Orbital mischen die 96-Well-Platte bei 550 Upm bei Raumtemperatur für 5 min in der Dunkelheit durch Abdecken der Platte in Folien. Hinweis: Tseinen Schritt sollten alle Ascorbat in den &quot;+ AO&quot; Brunnen DHA zu oxidieren. Die &quot;-AO&quot; Brunnen sollte davon unberührt. </li><li> Dann werden 50 ul 3,5 mM Kaliumferricyanid in PBS zu allen Vertiefungen (hierin als &quot;Ferricyanid&quot; bezeichnet). Die endgültige [Ferricyanid] = 1 mm. Hinweis: Verwenden Sie eine multipipettor. </li><li> Die Platte Orbital mischen bei 550 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur für weitere 5 min im Dunkeln. Anmerkung: Dieser Schritt ist bei der Reduktion von Ferricyanid von Ascorbat in einem stöchiometrischen Verhältnis von 2 Molekülen Ferricyanid pro 1 Molekül Ascorbat oxidiert reduziert Cyanoferrat führen. </li><li> Sofort werden 25 ul einer frisch aufgebaut Lösung mit 50% (v / v) Essigsäure und 30% (w / v) Trichloressigsäure (TCA). Hinweis: Verwenden Sie eine multipipettor. </li></ol></li><li> Bestimmen intrazellulären Ascorbat - Schritt 2: Quantifizierung der Menge des gebildeten Blutlaugen 37 <ol><li> 100 l Ferrocyanidtest Bestimmung Lösung 37 bis Each gut. Hinweis: Eine funktionierende Lösung ist unmittelbar vor Gebrauch hergestellt werden: 2 ml 3 M Na-Acetat (pH 6,0); 0,5 ml Eisessig (~ 17,4 M Essigsäure); 2 ml 0,2 M Zitronensäure; 2 ml von 3,3 mM FeCl 3 in 0,1 M Essigsäure; 1 ml 30 mM Ferene-S. Das endgültige Volumen dieser Arbeitslösung sollte 7,5 ml betragen. </li><li> Orbital mischen der Platte im Dunkeln bei 550 UpM für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Lesen der Absorptionswerte der Vertiefungen bei 593 nm (das heißt das Absorptionsmaximum des Fe (II) (Ferene-S) 3-Komplex). </li><li> Berechnen Sie die Menge der intrazellulären Ascorbat als nmol Ascorbat pro Million Zellen zunächst Subtraktion der A 593 nm Werte für die &#39;+ AO&#39; Brunnen aus den entsprechenden &#39;- AO &quot;Brunnen für jede Probe und dann Interpolation von der Ascorbat Standardkurve (siehe Schritt 1.3 ). Bei der Konstruktion der Standardkurve zeichnen dieses &quot;Differenzwert&quot; für jeden Standard gegen die Höhe der ascorbaß pro Vertiefung. </li></ol></li></ol> 2. Bestimmung von Ascorbat-Ausstrom aus kultivierten Zellen <ol><li> Zellkultur-und Ernte <ol><li> Wachsen Aussetzung oder adhärenten Zellen, wie oben (siehe Schritt 1.1). Hinweis: Durchführung der unter-Assay in einer 24-Well-Format plat mit Federung und adhärenten Zellen für beste Ergebnisse. </li><li> Resuspendieren Suspensionszellen oder lagern adhärenten Zellen mit 400 &amp;mgr; l vorgewärmtem HEPES-gepufferte Salzlösung, mit oder ohne Calcium und Magnesium, und enthaltend 5 mM D-Glucose (HBS / D, pH 7,3, 37 ° C) in Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Füge das gleiche Volumen an HBS / D angegeben zellfreien Vertiefungen auf jeder Platte mit 24 Vertiefungen untersucht werden. Hinweis: Letztere wird als zellfreie Kontrollen für die Baseline-Reaktion dienen (siehe unten). </li></ol></li></ol> 3. Bestimmen Sie die Anzahl der Ascorbat freigegeben <ol><li> Sollten die folgenden Stammlösungen vorher vorbereitet werden: 120U / ml AO in HBS / D (frisch zubereiten); 2,4 mM Ferene-S in HBS / D; 120 uM FeCl 3 und 600 uM Na-Citrat in HBS / D (unmittelbar vorzubereiten aus mehr konzentrierte Stammlösungen). </li><li> Um die Reaktions ferrireduction (Endvolumen pro Vertiefung sollte 600 ul sein) zu starten, fügen Sie die folgenden Mengen an Reagenzien an einzelnen Wells bereits 400 ul HBS / D enthält: <ol><li> Dann werden 50 &amp;mgr; l AO (120 U / ml) oder HBS / D in Vertiefungen in dreifacher Ausfertigung gepaart. Die endgültige Konzentration sollte AO 10 U / ml. Hinweis: Label gepaart Brunnen als &quot;- AO&quot; und &quot;+ AO&quot;. </li><li> Mische die Platten sanft orbitalen Mischen für 5 min bei 37 ° C. </li><li> In 50 ul von 2,4 mM Ferene-S in alle Vertiefungen. Die endgültige Ferene-S-Konzentration sollte 200 &amp;mgr; m sein. Mische die Platten wie oben für 5 min bei 37 ° C. </li><li> In 50 ul frisch zubereitet 120 uM Eisen-III-Citrat. Die endgültige Eisen und Citrat-Konzentrationen sollten 10 uM Eisen und 50 uM Citrat sein. Gut mischen. </li></ol&gt; </li><li> In drei dreifach Steuer Brunnen, saugen Sie den darüberliegenden Medium, und fügen Sie 600 ul HBS / D mit 0,1% Saponin. Hinweis: Diese werden als &quot;100% Zell-Lyse&quot; Steuerelemente für ein Laktat-Dehydrogenase (LDH)-Freisetzungstest parallel durchgeführt werden (siehe unten) zu dienen. </li><li> Inkubation für 60 min im Dunkeln bei 37 ° C. </li><li> Am Ende des Ascorbat-Efflux-Assay, schnell absaugen 500 ul von jedem gut, und fügen Sie in einer 24-Well-Platte entsprechend gekennzeichnet Brunnen. Hinweis: für Suspensionszellen, zunächst zu entfernen, die Zellen durch Zentrifugation bei 4 ° C. </li><li> Add 300 ul-Aliquots des Überstandes auf eine 96-Well-Platte und dann bei 593 nm abgelesen. </li></ol> 4. Bestimmung der extrazellulären Ascorbat <ol><li> Lesen Sie die Absorptionswerte der Wells bei 593 nm auf. </li><li> Berechnen der Menge des extrazellulären Ascorbat als Ascorbat nmol pro mg Protein (oder pro Million Zellen), die zur Bestimmung der intrazellulären Ascorbat beschriebenin Schritt 1.5.4. Hinweis: Der Anwender sollte Bedingungen zu optimieren, so dass Ascorbat Freigabe nicht durch intrazelluläre Ascorbat begrenzt. </li></ol> 5. Bestimmung der LDH-Freisetzung <ol><li> Mit den restlichen 200 ul der extrazellulären Lösung von jeder Probe die Durchführung einer LDH-Freisetzungstest 32,41, um das Ausmaß der zellulären Lyse zu bestimmen. Hinweis: berechnet in% des Gesamt lösbare LDH. Bestimmen lösbare LDH aus den Proben, die mit 0,1% Saponin behandelt wurden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In der vorliegenden Arbeit werden zwei schnelle, spezifische und relativ empfindliche kolorimetrische Mikrotiterplatten-Assays zur Bestimmung von Ascorbat aus den intra-und extrazellulären Kompartimenten in kultivierten Zellen. Die Tests können mit Zugang zu Standard-Labor-Ausrüstung und Reagenzien durchgeführt werden. Die nur moderat kostspielig Reagens für den Assay erforderlich ist, AO, was wesentlich ist, da es einen hohen Grad an Spezifität gegenüber Analyt-L-ascorbat verleiht. Die Te...

Die Entdeckung der chemischen Natur von Ascorbinsäure (Vitamin C), und seiner Identifikation als der lange gesuchte &quot;Anti-Skorbut-Faktor&quot;, von Albert Szent-Györgyi und andere in Papiere von 1928 bis 1934 veröffentlicht waren ein Wahrzeichen Ereignisse in der Geschichte der Biochemie. Tatsächlich trugen diese Entdeckungen Szent-Györgyi auf, die im Jahr 1937 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin. Die ständig wachsende Palette von Rollen für Ascorbat in Tier-und Pflanzenphysiologie, sowie die menschliche Gesundheit, weiterhin die Themen der aktiven wissenschaftlichen sein Untersuchung und Kontroversen. L-Ascorbat ist eine reichlich vorhandene physiologische Reduktionsmittel und Enzym-Cofaktor in Säugersystemen, und trägt zu zahlreichen gut definierten enzymatischen Reaktionen, die die Hydroxylierung von Kollagen, Carnitin-Biosynthese und Norepinephrin, Tyrosin-Stoffwechsel und Peptidhormon Amidierung 2. Interessanterweise Montage evideNCE legt nahe, dass Ascorbat spielt eine Rolle bei der Stimulierung anderer Eisen-abhängige Dioxygenasen, wie die Prolyl-Hydroxylasen und Asparaginyl bei der Hydroxylierung beteiligt und Ausrichtung der Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIFs) und 1α 2α 3. Ein neuer Bericht legt nahe, dass Ascorbat spielt eine Rolle bei der T-Zellreifung durch Chromatin beeinflusst Demethylierung über seine Tätigkeit bei der Stimulierung der Kern Hydroxylasen, Jumonji C (JmjC) Domain-Proteine; von denen die letztere scheinen Ascorbat für volle Aktivität 4 erfordern. Tatsächlich ist die Stimulierung solcher Enzyme durch Ascorbat scheint durch einen ähnlichen Mechanismus auf die Stimulation auftreten durch Ascorbat der HIF-Hydroxylasen und Kollagen. Unter anderen klassischen Wirkungen beiträgt Ascorbat signifikant die zelluläre Antioxidation als wasserlösliches Kettenabbruch Radikalfänger 5 und dem Recycling von Plasmamembran-α-Tocopherol (Vitamin E) über die Reduktion der α-tocopheroxyl Rest 6, welche ist beim Schutz gegen Membranlipidperoxidation 7 wichtig. Wichtig ist, dass obwohl die meisten Säugetiere sind in der Lage, de novo hepatische Synthese von Ascorbat aus D-Glucose, höhere Primaten, Meerschweinchen und einige Fledermäuse hängen von Nahrungsquellen von Vitamin 8. Dies beruht auf der Inaktivierung des Gens GULO die Orthologe davon unberührt in Säugern codieren, das Enzym γ-Gulono-lacton-Oxidase 9-13. Dieses Enzym ist für die endgültige Reaktion in Ascorbat-Biosynthese aus Glucose 13 erforderlich. Nach Transporter-vermittelte Resorption aus dem Darmlumen in den Menschen, Ascorbat während des Körpers durch das Kreislaufsystem verteilt. Das Vitamin wird in der Regel in seiner reduzierten Form in millimolaren Konzentrationen intrazellulär (mit der Ausnahme von Erythrozyten in dem die Konzentrationen sind in der Regel ähnlich wie der vorherrschende Plasmakonzentration) und in mikromolaren konz gefundenentrations (zB 50-200 uM) in den meisten extrazellulären Flüssigkeiten 14,15. Unter physiologischen Bedingungen, Ascorbat in der Regel eine reversible Ein-Elektronen-Oxidation zum Radikal ascorbyl (AFR, auch als monodehydroascorbate oder semidehydroascorbate bekannt). Während der AFR ist ein relativ stabiles Radikal 16, in der Abwesenheit von seiner schnellen Ein-Elektronen-enzymatische Reduktion zurück zu Ascorbat können zwei AFRS disproportioniert einem Ascorbat und ein Dehydroascorbat (DHA) 9,13,17 fördern. Im Inneren der Zelle, die zwei-Elektronen-Oxidationsprodukt von Ascorbat, DHA, schnell wieder auf Ascorbat durch Glutathion und NAD (P) H-abhängige enzymatische und nicht-enzymatische Reaktionen, 13 reduziert werden. Während es klassisch wird akzeptiert, dass Ascorbat einzige bedeutende Rolle im Eisenstoffwechsel ist die Nahrungsaufnahme von Nicht-Häm-Eisen-18 zu stimulieren, die wir und andere zur Verfügung gestellt haben Beweise strongly darauf hindeutet, dass Ascorbat spielt eine stark erweiterte Rolle im Stoffwechsel von diesem Metall. Zunächst erscheint Ascorbat, die durch Ascorbat-voll-Zellen freigesetzt wird, eine wichtige Rolle bei der Modulation der Aufnahme von Nicht-Transferrin-gebundenem Eisen von 19,20 Zellen zu spielen, und sehr neue Hinweise darauf, dass Ascorbat moduliert auch die Aufnahme von Transferrin-gebundenes Eisen von Zellen 21, von denen die letztere entspricht einer physiologischen Haupteisenaufnahmestrecke 22. Ascorbat ist wichtig für die normale Funktion des zentralen Nervensystems bei Säugetieren 23,24. Zusammen mit der Nebennierenrinde, Hypophyse, Thymus, Retina und Gelbkörper enthält das Gehirn hohen Konzentrationen von Ascorbat im Vergleich zu anderen Körpergeweben 23,25-27. Zusätzlich wird die Belichtung beider 28,29 Astrozyten und Neuronen-ähnliche Zellen 30 zu Glutamat bekannt, die Freisetzung von Ascorbat in den extrazellulären Raum, in dem die Auslösung ascorbatE soll helfen Neuronen schützen vor Glutamat-induzierten neuronalen Dysfunktion 31. Während der genaue Mechanismus der Glutamat-induzierten Freisetzung aus Astrozyten Ascorbat unbekannt ist, haben wir vor kurzem legte Beweise, die die Beteiligung der Zelle Schwellungen, die durch Glutamataufnahme verursacht durch die Astrozyten Glutamat und Aspartat-Transporter (GLAST, auch bekannt exzitatorischen Aminosäuretransporter-Isoform 1 [EAAT1 ] beim Menschen) und damit die Aktivierung des Volumens empfindlichen Osmolyten und Anionen-Kanäle (VSOACs), die durchlässig für kleine organische Anionen wie Ascorbat 32. Die molekularen Identitäten der Kanäle in der Plasmamembran VSOAC Bildung beteiligt noch identifiziert werden 33,34. Obwohl viele Assays zur Bestimmung von Ascorbat in biologischen Proben, die spektrophotometrische, fluorometrische und chromatographische Assays 35,36 umfassen entwickelt wurde, gibt es viel Variabilität in der Spezifität, Empfindlichkeit, interference von chemischen Verunreinigungen, effektive linearen Bereich und die Stabilität der Endpunkt Analyten. Zusätzlich können andere wichtige Faktoren, die die Wahl beeinflussen, sind Assay Schnelligkeit, einfache Handhabung und den Zugang zu relativ spezialisierte Ausrüstung wie einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC)-Gerät. Hier stellen wir eine einfache und sehr spezifische kolorimetrische Mikrotiterplatten-Assay zur Bestimmung der intrazellulären Ascorbat in kultivierten Zellen, sowie einen separaten Assay zur Bestimmung von Ascorbat-Efflux aus kultivierten Zellen. Letztere Assay zielt darauf ab, das Problem der Unterschätzung der Ascorbat Freisetzung aus den Zellen aufgrund der schnellen Wiederaufnahme des frei Ascorbat durch natriumabhängigen Transport Ascorbat (SVCTs) zu umgehen. Obwohl beide Methoden haben in einigen unserer bisherigen Veröffentlichungen 19,20,32,37,38 erschien, bietet diese Handschrift eine explizite Reihe von Anweisungen und Leitlinien für ihre effiziente Ausführung.

<table><tbody><tr><td>Nunc 96-Well-Platten mit flachem Boden</td><td>Thermo</td><td>269620</td><td>Jede 96-Well-Platte mit flachem Boden kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Gekühlte Tisch-Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td>Eine ungekühlte Mikrozentrifuge, die in einem Kühlraum auf die Temperatur abgestimmt wurde, kann auch verwendet</td></tr><tr><td>werden Gekühlte Tischzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Swing-bucket</td></tr><tr><td>Bio-Rad Benchmark Plus Mikroplatten-Spektralphotometer</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Jedes Mikroplatten-Spektralphotometer, das bei 593 nm messen kann, kann verwendet werden und wird empfohlen. Wenn ein filterbasiertes Plattenlesegerät verwendet wird, wählen Sie die nächstliegende Wellenlänge und verwenden Sie die Standardkurvenmethode.</td></tr><tr><td>Ependorf MixMate (Mikrotiterplatten-Orbitalmischer)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Dies ist ein sehr vielseitiger und zuverlässiger Mikrotiterplatten-Mischer, der sich sehr gut für diese Assays eignet.</td></tr><tr><td>Allzweckpuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puffer Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS-gepufferte Kochsalzlösung (MBS); 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7,3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBS + 5 mM D-Glukose (MBS/D)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES-gepufferte Kochsalzlösung + 5 mM D-Glukose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5,2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2&bull; 2 H2O, 0,8 mM MgSO4&bull; 7 H2O, 5 mM D-Glukose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7,3)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellpermeabilisierungspuffer (CPB; 0,1 % Saponin in PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allgemeine Chemikalien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure oder Natrium-L-Ascorbat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Zubereitungen mit höchster Reinheit sollten erhalten werden</td></tr><tr><td>Dehydro-L-Ascorbinsäure (DHA)-Dimer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30790</td><td>Wässrige Lösungen ergeben theoretisch 2 Mol DHA-Monomer pro Mol DHA-Dimer</td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>Stammlösungen, hergestellt in DMSO oder Ethanol</td></tr><tr><td>Ascorbatoxidase (AO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0157</td><td>Stammlösungen (120 U/ml) können in PBS oder MBS hergestellt und dann in Aliquoten eingefroren werden</td></tr><tr><td>Kaliumferricyanid (FIC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>455989</td><td>Trihydrat</td></tr><tr><td>Feren-S (3-(2-pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazin-5&prime;,5&prime; </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92940</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-L-glutamat</td><td>Sigma-Aldrich L-glutamin Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 47036 Herstellung einer 0,1%igen Stammlösung <tr><td>Stammlösungen für intrazelluläre Ascorbatbestimmung Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr> 3 <tr><td>M Natriumacetat (pH 6,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 M Zitronensäure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,3 mM FeCl3 in 0,1 M Essigsäure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mM Feren-S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 % (v/v) Essigsäure + 30 % (w/v) Trichloressigsäure (TCA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stammlösungen für den Ascorbat-Efflux-Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AO (120 U/ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,4 mM Feren-S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,12 mM FeCl3 in 0,6 mM Natriumcitrat</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eine schnelle und spezifische mikroplatten-assay zur bestimmung der intra-und extrazelluläre ascorbat in kultivierten zellen

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Vitamin C (Ascorbat) spielt eine wichtige Rolle bei zahlreichen zellulären Stoffwechsels, von denen viele nur für Licht in den letzten Jahren. Zum Beispiel im Gehirn wirkt Ascorbat in einer neuroprotektiven und neuromodulatorischen Weise, Ascorbat Zyklen zwischen Neuronen und Astrozyten vicinalen beinhaltet - eine Beziehung, die entscheidend für die Homöostase Gehirn Ascorbat zu sein scheint. Darüber hinaus Anzeichen dafür stark darauf hin, dass Ascorbat hat eine stark erweiterte Rolle bei der Regulierung zellulärer und systemischer Eisenstoffwechsel als klassisch anerkannt ist. Die zunehmende Anerkennung der integrale Rolle von Ascorbat in normalen und deregulierte zelluläre Physiologie der Organismen und erfordert eine Reihe von Mitteldurchsatz und hohe Empfindlichkeit analytischer Techniken, die ohne die Notwendigkeit für sehr teure Spezialausrüstung ausgeführt werden können. Hier stellen wir explizite Anweisungen für einen mittleren Durchsatz, spezifische und relativ kostengünstige Mikroassay zur Bestimmung von both intra-und extrazellulären Ascorbat in Zellkultur.

Bestimmung der intrazellulären Ascorbat in kultivierten Suspensionszellen Im ersten Test (Abbildung 1), ist die intrazelluläre Ascorbat bestimmt, nach Ascorbat spezifische (dh, AO-und Kleinschreibung) Reduktion von Ferricyanid zu Ferrocyanid, mit Hilfe der hochempfindlichen Bestimmung von Blutlaugen durch eine zuvor veröffentlichten Verfahren 37. Der Nachweis von Ascorbat auf der kolorimetrischen Chelatisierung von Eisen, die von der Ascorbat-abhängige Reduk...

Ascorbat spielt eine wichtige Rolle in zahlreichen zellulären Stoffwechsels, von denen viele nur für Licht in den letzten Jahren. Hier beschreiben wir einen mittleren Durchsatz, spezifisch und kostengünstig Mikrotiterplatten-Assay zur Bestimmung von intra-und extrazellulären Ascorbat in Zellkultur.

Eine schnelle und spezifische Mikroplatten-Assay zur Bestimmung der Intra-und extrazelluläre Ascorbat in kultivierten Zellen

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die intrazellulären oder extrazellulären Ascorbat-Konzentrationen in kultivierten oder isolierten Zellen zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem Zelllysate oder ganze Zellen mit einer Ascorbat-Oxidase inkubiert werden, um in nachfolgenden Schritten gezielt Ascorbat abzubauen. Bei der ersten Methode werden Zelllysate mit Cyanid inkubiert, wodurch auf ascorbatabhängige Weise Ferrozyanid gebildet wird, was eine direkte Aussage über die Menge an Ascorbat in den Lysaten ermöglicht.Anschließend wird die Menge an im Zellextrakt gebildetem Ferrocyanid bestimmt, indem das Ferrocyanid quantitativ durch zugesetztes dreiwertiges Eisen zu Eisen(III) oxidiert wird, um einen chromogenen Eisen(II)-Ferne-S-Komplex zu bilden, der spektralphotometrisch quantifiziert werden kann. Bei der zweiten Methode werden alle Zellen direkt mit dem Eisen(II)-Chelator Ferne S und Zitrat-Eisen(III) inkubiert. Die Ergebnisse zeigen Unterschiede in den intrazellulären oder extrazellulären Ascorbatkonzentrationen aufgrund der quantitativen und spezifischen Reduktion extrazellulärer Eisenkomplexe, die nachweisbar ist.Spektrometrisch. Der Hauptvorteil der vorliegenden Methode gegenüber bereits etablierten Verfahren wie der HBLC-basierten Detektion besteht darin, dass dieser hochspezifische Mikroplatten-Assay sehr schnell durchgeführt werden kann und alle Proben sowie Standards parallel und nicht seriell verarbeitet werden können. Vor Beginn dieses Verfahrens kultivieren Sie K562-Suspensionszellen und stellen einen zellulären Extrakt in einem Score-BA her.Danach bereiten Sie eine Stammlösung von 10 Millimolar Ascorbinsäure in eiskaltem PBS vor. Bereiten Sie anschließend sorgfältig eine Reihe von Ascorbat-Standardlösungen zwischen null und 20 Mikromolar vor. Entnehmen Sie vorsichtig jeweils vier Aliquote zu je 100 Mikroliter aus jedem Standard und geben Sie diese zu einer horizontalen Reihe von Vertiefungen hinzu.In einer 96-Loch-Platte mit flachem Boden, die pro Loch 25 µL PBS oder eine Stammlösung von 45,5 Einheiten pro Milliliter L-Ascorbat-Oxidase oder AO in PBS enthält, die 96-Loch-Platte mit Folie abdecken und orbital bei 550 min⁻¹ für fünf Minuten bei Raumtemperatur mischen.Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, 50 Mikroliter einer 3,5 Millimolar Kaliumferricyanidlösung in PBS zu allen Vertiefungen hinzufügen, um nach dem Schwenken der 96-Loch-Platte unter denselben Bedingungen wie zuvor eine Endkonzentration an Ferricyanid von einem Millimolar zu erreichen. Unmittelbar danach 25 Mikroliter einer frisch hergestellten Lösung, die 50 % Essigsäure und 30 % Trichloressigsäure enthält, hinzufügen. Als Nächstes 100 Mikroliter einer frisch zubereiteten Pharaoh-Cyanid-Bestimmungslösung in jede Vertiefung der orbitalen Platte geben.Mischen Sie die Platte im Dunkeln 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 550 U/min. Anschließend messen Sie die Absorptionswerte der Vertiefungen bei 593 Nanometern ab. Um den Nachweis zu starten.Oxidieren Sie zunächst das extrazelluläre Ascorbat in ausgewählten Vertiefungen, indem Sie 50 Mikroliter von 120 Einheiten pro Milliliter AO oder HBSD zu paarweise angeordneten Vertiefungen im Dreifachansatz hinzufügen, um eine endgültige AO-Konzentration von 10 Einheiten pro Milliliter zu erreichen. Bezeichnen Sie danach die jeweiligen Paar-Vertiefungen als minus AO und plus AO. Nach dem Mischen der Platten mit sanftem orbitalem Schütteln für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius geben Sie 50 Mikroliter von 2,4 Millimolar Ferne S zu allen Vertiefungen hinzu, um eine endgültige Ferne-S-Konzentration von 200 Mikromolar zu erreichen, und mischen die Platten erneut wie oben beschrieben für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.Fügen Sie anschließend 50 µL frisch zubereiteter 120 µM Ferricitratlösung in alle Vertiefungen ein, um endgültige Eisen- und Citratkonzentrationen von jeweils 10 µM Eisen und 50 µM Citrat zu erreichen. Mischen Sie am Ende des Ascorbat-FLX-Assays gründlich. Aspirieren Sie anschließend schnell das überstehende Medium aus jeder Vertiefung und geben Sie es in entsprechend beschriftete Vertiefungen einer 24-Loch-Platte. Fügen Sie anschließend drei Mikroliter-Aliquote des Überstandes einer 96-Loch-Platte hinzu, um die Konzentration an extrazellulärem Ascorbat zu bestimmen. Messen Sie die Absorptionswerte der Vertiefungen bei 593 Nanometern in einem Mikroplatten-Spektrophotometer. Berechnen Sie abschließend die Menge an extrazellulärem Ascorbat als m Ascorbat pro Milligramm Protein.Hier ist eine typische Standardkurve für eine Reihe von Ascorbatstandards, null bis 20 Mikromolar oder null bis zwei NMO Ascorbat pro Mulde. Bezüglich der 96-Mulden-Platte, obwohl hier nicht dargestellt, bleibt die Linearität bis zu acht NMO Ascorbat pro Mulde erhalten, was einer Ascorbatkonzentration in der Probe von etwa 80 Mikromolar entspricht. Der Nachweis kann erfolgreich zur Bestimmung von Ascorbatkonzentrationen unterhalb von 0,25 NMO Ascorbat pro Mulde eingesetzt werden.K 5 62-Zellen reichern schnell intrazelluläres Ascorbat aus extrazellulärem Dehydro-L-Ascorbinsäure, jedoch nicht aus Ascorbat an. In diesem repräsentativen Experiment wurden mit PBS gewaschene K 5 62-Zellen 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in PBS mit 500 Mikromolar entweder Ascorbat, Dehydro-L-Ascorbinsäure, Dehydro-L-Ascorbinsäure plus 50 Mikromolar Cyto B, Ascorbat plus fünf Millimolar Cyanid oder Ascorbat plus 50 Einheiten pro Milliliter AO inkubiert. Der intrazelluläre Ascorbatgehalt wurde wie zuvor beschrieben bestimmt.Die Aufnahme von Dehydro-L-Ascorbinsäure durch K562-Zellen erfolgt über einen facilitativen Glukosetransporter (GLUT)-vermittelten Transport. Um die Beteiligung der GLUTs an der Aufnahme von Dehydro-L-Ascorbinsäure zu untersuchen, wurden in diesem repräsentativen Experiment K562-Zellen mit steigenden Konzentrationen von Cyto B oder Dihydro-Cyto B inkubiert, bevor sie mit Dehydro-L-Ascorbinsäure behandelt wurden. Es ist wichtig anzumerken, dass zwar sowohl Cytochalasin B als auch Dihydro-Cytochalasin B mikromolare Konzentrationen benötigen, um bewegliche Prozesse zu hemmen, jedoch allein Cytochalasin B – das sich von Dihydro-Cytochalasin B durch die Anwesenheit einer einzelnen Doppelbindung unterscheidet – den GLUT-abhängigen Transport bereits bei niedrigen mikromolaren Konzentrationen inhibiert.Daher, da die Aufnahme von Dehydro-L-Ascorbinsäure durch Cyto B mit einer IC50 von weniger als 2,5 µmol gehemmt wurde, nicht jedoch durch Dihydro-Cyto B, erfolgt die Aufnahme von Dehydro-L-Ascorbinsäure vermutlich über eine GLUT-vermittelte Transportweise.Alternativ wurden gewaschene Zellen während der Inkubation mit Dehydro-L-Ascorbinsäure steigenden Konzentrationen des GLUT-transportierbaren, aber nicht metabolisierbaren Glucose-Analogs 3-O-Methyl-D-Glucose oder des GLUT-nichttransportierbaren Glucose-Stereoisomers L-Glucose ausgesetzt. Auch hier deuten die Ergebnisse auf eine Beteiligung von GLUT an der Aufnahme von Dehydro-L-Ascorbinsäure hin, da die Hemmung der intrazellulären Ascorbat-Akkumulation nur in Gegenwart des GLUT-transportierbaren Glucose-Analogs auftritt. Bei dem zweiten Testverfahren.Die Rate des Ascorbat-Ausstroms aus kultivierten Zellen kann bestimmt werden. Dieser spezifische Test ist wichtig, da die Freisetzung von Ascorbat aus Zellen für die ascorbatregulierte zelluläre Aufnahme von nicht-transferrin-gebundenem Eisen entscheidend zu sein scheint. Die Aufnahme von nicht-transferrin-gebundenem Eisen wird als relevant für die Pathophysiologie von Eisenüberladungsstörungen wie der Hämochromatose sowie für den Eisenstoffwechsel und die Homöostase zwischen Astrozyten und Neuronen im Säugetiergehirn angesehen.Tatsächlich löst der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter L-Glutamat die Freisetzung von Ascorbat aus Astrozyten auf eine Weise aus, die von der Aufnahme von L-Glutamat über GLAST und vermutlich GLT-1 sowie einer anschließenden zellulären Schwellung abhängt, die die Freisetzung von Ascorbat durch vermutete VSOs auslöst. Analog dazu kann die Freisetzung von Ascorbat aus ascorbatbeladenen Astrozyten durch die exzitatorische Aminosäure L-Aspartat, nicht jedoch durch die nicht exzitatorische Aminosäure L-Glutamin stimuliert werden. Dieser Effekt ist hier dargestellt und zeigt Dosis-Wirkungs-Kurven für die Stimulation der Ascorbatfreisetzung durch Aspartat und Glutamin aus primären Kulturen ascorbatbeladener Maus-Astrozyten, sobald dies beherrscht ist.Diese Technik kann bei korrekter Durchführung in nur zwei Stunden durchgeführt werden.

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Hier beschreiben wir einen phänotypischen Assay, der auf die High-Throughput/High-Content-Screens von klein-interferierender synthetischer RNA (siRNA), chemischer Verbindung und Mycobacterium tuberculosis mutierte Bibliotheken anwendbar ist. Diese Methode beruht auf dem Nachweis von fluoreszierend gekennzeichneter Mycobacterium tuberculosis in fluoreszierend markierten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Glykolyse ist ein definierender metabolischer Marker in mehreren biologischen Systemen. Die Überwachung der Glykolyse durch Messung des extrazellulären Flusses von H+ ist üblich, erfordert jedoch eine Korrektur, um quantitativ und eindeutig zu sein. Hier zeigen wir, wie extrazelluläre Flussdaten gesammelt und korrigiert werden können, um zwischen respiratorischen und glykolytischen Quellen der extrazellulären Versauerung zu unterscheiden.

Messung und Analyse von extrazellulären Säureproduktion zu ermitteln glykolytischen Rate

Es wurde ein Echtzeit-Assay mit hohem Durchsatz entwickelt, um gleichzeitig (1) eukaryotische zellpenetrierende antimikrobielle Wirkstoffe zu identifizieren, die auf einen intrazellulären bakteriellen Krankheitserreger abzielen, und (2) die Zytotoxizität eukaryotischer Zellen zu bewerten. Eine Variation der gleichen Technologie wurde anschließend mit digitaler Dosiertechnologie kombiniert, um einfache, hochauflösende Dosis-Wirkungs-Studien sowie zwei- und dreidimensionale Synergiestudien zu...

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Das Ziel dieses Protokolls ist, spektralphotometrisch Trans-Plasma Membran Elektronentransport Nutzung extrazelluläre Elektronen Akzeptoren überwachen und enzymatische Interaktionen zu analysieren, die mit dieser extrazellulären Elektronen-Akzeptoren auftreten können.

Messung der Trans-Plasma Membran Elektronentransport durch C2C12 Myotubes

Die hier vorgestellte Methode fasst optimierte Protokolle zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen (HSPCs) der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator zusammen, um die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von HSPCs in Echtzeit zu messen.

Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator

Der Stoffwechselstatus menschlicher retinaler Pigmentepithelzellen (H-RPE) spiegelt deren Gesundheit und Funktion wider. Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Untersuchung des Echtzeit-Stoffwechselflusses von H-RPE mittels hochauflösender Respirometrie vorgestellt.

Echtzeitanalyse der Bioenergetik in primären humanen retinalen Pigmentepithelzellen mittels hochauflösender Respirometrie

Lernen Sie einen schnellen Mikroplatten-Assay zur Bestimmung intra- und extrazellulärer Ascorbatspiegel in kultivierten Zellen. Diese kostengünstige Methode ermöglicht spezifische metabolische Analysen.

Eine schnelle und spezifische Mikroplatten-Assay zur Bestimmung der Intra-und extrazelluläre Ascorbat in kultivierten Zellen

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