Eine schnelle und spezifische Mikroplatten-Assay zur Bestimmung der Intra-und extrazelluläre Ascorbat in kultivierten Zellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Bestimmung des intrazellulären oder extrazellulären Ascorbatspiegels in kultivierten oder isolierten Zellen. Dies wird erreicht, indem Zellextrakte oder ganze Zellen mit einer Score-Oxidase inkubiert werden, um in nachfolgenden Schritten selektiv einen Score BA zu depletieren. Bei der ersten Methode werden Zellextrakte mit Cyanid inkubiert, um Ferrocyanid in einer ascorbatabhängigen Weise zu erzeugen, was eine direkte Darstellung der Ascorbatmenge in den Extrakten ergibt.

Als nächstes wird die Menge an Ferrocyanid, die in den Zellextrakten gebildet wird, bestimmt, indem das Ferrocyanid mit zugesetztem Eisen quantitativ oxidiert wird, um Ferris-Eisen zu bilden, um einen chromogenen Eisen-Zwei-Ferne-S-Komplex zu erzeugen, der spektrophotometrisch quantifiziert werden kann. Bei der zweiten Methode werden alle Zellen direkt mit dem Eisen zwei Chelator ferne S und Eisencitrat inkubiert. Die Ergebnisse zeigen Unterschiede in den intrazellulären oder extrazellulären Ascorbatspiegeln, die auf der quantitativen und spezifischen Reduktion der extrazellulären Eisenkomplexe beruhen, die nachgewiesen werden können.

Spektrometrisch. Der Hauptvorteil der aktuellen Technik gegenüber bereits bestehenden Methoden wie dem HBLC-basierten Nachweis besteht darin, dass dieser hochspezifische Mikrotiterplatten-Assay sehr schnell durchgeführt werden kann und alle Proben und Standards parallel und nicht seriell verarbeitet werden können. Kultivieren Sie K 5 62 Suspensionszellen und erzeugen Sie in einem Score BA enthaltenden Zellextrakt.

Anschließend wird eine Stammlösung von 10 millimolaren Ascorbinsäure in eiskaltem PBS hergestellt. Bereiten Sie dann sorgfältig eine Reihe von Ascorbatstandards zwischen null und 20 Mikromolar vor. Entfernen Sie vorsichtig vier 100-Mikroliter-Aliquots aus jedem Standard und fügen Sie sie einer horizontalen Abfolge von Vertiefungen hinzu.

In einer 96-Well-Platte mit flachem Boden, die 25 Mikroliter PBS pro Well oder 45,5 Einheiten pro Milliliter enthält. Stammlösung von L-Ascorbatoxidase oder AO in PBS Decken Sie die 96-Well-Platte mit Folie und Orbital ab. Mischen Sie es bei 550 U/min bei Raumtemperatur fünf Minuten lang.

Wenn Sie fertig sind, geben Sie 50 Mikroliter 3,5 Millimolar Kalium-Ferris-Cyanid in PBS in alle Vertiefungen, um eine endgültige Ferris-Cyanid-Konzentration von einem Millimolar nach dem orbitalen Mischen der 96-Well-Platte unter den gleichen Bedingungen wie zuvor zu erhalten. Sofort werden 25 Mikroliter einer frisch hergestellten Lösung mit 50 % Essigsäure und 30 % Trichloressigsäure zugegeben. Geben Sie als Nächstes 100 Mikroliter einer frisch zubereiteten Pharao-Cyanid-Bestimmungslösung in jedes Well-Orbital.

Mixen Sie die Platte im Dunkeln bei 550 U/min für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Dann lesen Sie die Absorptionswerte der Vertiefungen bei 593 Nanometern ab. Um den Assay zu starten.

Zuerst oxidieren Sie extrazelluläres Ascorbat in ausgewählten Vertiefungen, indem Sie 50 Mikroliter von 120 Einheiten pro Milliliter AO oder HBSD in gepaarte Vertiefungen in dreifacher Ausfertigung hinzufügen, um eine endgültige AO-Konzentration von 10 Einheiten pro Milliliter zu erhalten. Nach dieser Bezeichnung werden die gepaarten Wells als minus AO und plus ao angezeigt. Nachdem Sie die Platten fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit sanftem Orbitalmischen gemischt haben, geben Sie 50 Mikroliter 2,4 Millimolar Ferne S in alle Vertiefungen, um eine endgültige Ferne s-Konzentration von 200 Mikromolar zu erhalten, und mischen Sie die Platten wie oben beschrieben für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie als Nächstes 50 Mikroliter frisch zubereitetes 120-Mikromol-Eisencitrat in alle Vertiefungen, um die endgültige Eisen- und Citratkonzentration von 10 Mikromolareisen bzw. 50 Mikromolarzitrat zu erhalten. Am Ende des Ascorbat-FLX-Assays gut mischen. Saugen Sie das darüber liegende Medium schnell aus jeder Vertiefung an und geben Sie es in eine entsprechend markierte Vertiefung in einer 24-Well-Platte.

Anschließend fügen Sie drei Mikroliter-Aliquots des Überstands zu einer 96-Well-Platte hinzu, um extrazelluläres Ascorbat zu bestimmen. Lesen Sie die Absorptionswerte der Vertiefungen bei 593 Nanometern in einem Mikroplatten-Spektralphotometer ab. Berechnen Sie abschließend die Menge an extrazellulärem Ascorbat als m Ascorbat pro abgebildetem Milligramm Protein.

Hier ist eine typische Standardkurve für einen Satz von Ascorbat-Standards, null bis 20 mikromolares oder null bis zwei NMO-Ascorbat pro Well. Von der 96-Well-Platte, obwohl hier nicht gezeigt, wird die Linearität bis zu acht NMO-Ascorbat pro Well beibehalten, was einer Ascorbatkonzentration der Probe von etwa 80 Mikromolar entspricht. Der Assay kann zum erfolgreichen Nachweis von Ascorbatgehalten unter 0,25 Ole Ascorbat pro Vertiefung verwendet werden.

K 5 62-Zellen akkumulieren intrazelluläres Ascorbat schnell aus extrazellulärer dehydro L-Ascorbinsäure, jedoch kein Ascorbat. In diesem repräsentativen Experiment wurden mit PBS gewaschene K 5 62 Zellen in PBS mit 500 Mikromolaren entweder Ascorbat, Dehydro L, Ascorbinsäure, Dehydro L, Ascorbinsäure plus 50 Mikromolar Cyto B, Ascorbat plus fünf Millimolar Cyanid oder Ascorbat plus 50 Einheiten pro Milliliter AO für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert. Intrazelluläres Ascorbat wurde wie zuvor beschrieben bestimmt.

Die Aufnahme von Dehydro L-Ascorbinsäure durch K 5 62-Zellen erfolgt durch einen erleichternden Glukosetransporter-Gesäßtransport, um die Beteiligung der Gesäßmuskulatur an der Aufnahme von Dehydro L-Ascorbinsäure zu beurteilen. In diesem repräsentativen Experiment wurden K 5 62 Zellen mit steigenden Konzentrationen von Cyto B oder Dihydrocyto B inkubiert, bevor sie mit dehydro L Ascorbinsäure inkubiert wurden. Es ist wichtig zu beachten, dass, während sowohl Cyto Callin B als auch Dihydro Cyto B bei mikromolaren Konzentrationen bewegliche Prozesse hemmen, nur Cyto Callin B, das sich von Dihydro Cyto B durch das Vorhandensein einer einfachen Doppelbindung unterscheidet, den glutenabhängigen Transport bei niedrigen mikromolaren Konzentrationen hemmt.

Daher wurde die Ascorbinsäureaufnahme als Dehydro L durch Cyto B mit einem IC 50 von weniger als 2,5 Mikromolar gehemmt, aber nicht durch Dihydrozyto gehemmt. B dehydro. Die Aufnahme von L-Ascorbinsäure erfolgt wahrscheinlich durch den durch die Gesäßmuskulatur vermittelten Transport.

Alternativ wurden gewaschene Zellen während der Inkubation mit dehydro L-Ascorbinsäure steigenden Konzentrationen des gesäßtransportablen, aber nicht metabolisierbaren Glukoseanalogons drei O-Methyl-D-Glukose oder des nicht gesäßtransportierbaren Glukose-Stereoisomers L-Glukose ausgesetzt. Auch hier deuten die Ergebnisse auf eine Beteiligung des Glus am Dehydro-L-Ascorbinsäureimport hin, da die Hemmung der intrazellulären Ascorbatakkumulation nur in Gegenwart des durch die Gemeine transportierbaren Glukoseanalogons auftritt. Im zweiten Assay.

Die Rate des Ascorbatausflusses aus kultivierten Zellen kann bestimmt werden. Dieser spezielle Assay ist wichtig, da die Freisetzung von Ascorbat aus Zellen entscheidend für die ascorbatregulierte zelluläre Aufnahme von nicht transferringebundenem Eisen durch die Zellen zu sein scheint. Die Aufnahme von nicht transferringebundenem Eisen wird als relevant für die Pathophysiologie von Eisenüberladungsstörungen, wie z.B. der Hämochromatose, sowie für den Eisenaustausch und die Homöostase von Astrozyten-Neuronen im Säugetiergehirn angesehen.

Tatsächlich löst der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter L-Glutamat die Freisetzung von Ascorbat für Astrozyten in einer Weise aus, die von L-Glutamat, der Aufnahme durch Glas und wahrscheinlich GLT 1 und der anschließenden zellulären Schwellung abhängt, die die Freisetzung von Ascorbat durch mutmaßliche VSOs auslöst. In Analogie dazu kann die Freisetzung von A-Score B-beladenen Astrozyten durch die exzitatorische Aminosäure L-Aspartat stimuliert werden, nicht jedoch durch die nicht-exzitatorische Aminosäure L-Glutamin. Dieser Effekt ist hier dargestellt, das Dosis-Wirkungs-Kurven für die Stimulation der Ascorbatfreisetzung durch Aspartat und Glutamin aus Primärkulturen von ascorbatbeladenen Maus-Astrozyten zeigt.

Diese Technik kann bei korrekter Ausführung in nur zwei Stunden durchgeführt werden.