Herstellung von DNA-vernetztem Polyacrylamid, Hydrogele

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, DNA-vernetzte Polyacrylamidhydrogels herzustellen, die sich versteifen oder weichen lassen, indem einzelsträngige DNA-Moleküle nach dem Ansäen der Zellen in das Kulturmedium pipettiert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst lyophilisiertes SA1, SA2, L2, R2 und die Kontroll-Einzelstrang-DNAs in Puffer resuspendiert und anschließend die SA1- und SA2-Lösungen einzeln in ein Polyacrylamid-Backbone polymerisiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die polymerisierten SA1- und SA2-Lösungen mit der L2-Lösung zu mischen, um das DNA-Gel zu bilden.

Anschließend wird die DNA-Gel-Lös游戏副本 auf Glasdeckgläser mit optischem Kleber fixiert. Der letzte Schritt besteht in der Funktionalisierung der Gele durch Behandlung mit Sul Sampa und anschließend PDL. Abschließend werden Zellen auf die DNA-Gele ausplattiert, und die Gel-Elastizität wird durch Zugabe von R zwei L zwei oder einer Kontroll- Einzelstrang-DNA moduliert, um die Elastizität des Gels jeweils zu verringern, zu erhöhen oder unverändert zu lassen.

Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass die dynamische Natur des zugrunde liegenden Substrats das Zellverhalten beeinflusst. Der Vorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie CROs, Lingo, Ball-Hydrogelen besteht darin, dass DNA-Gele keinen Stimulus wie UV-Licht benötigen, um ihre Elastizität zu modulieren. Stattdessen werden DNA-Gele durch die Diffusion von L zwei bzw. R zwei Einzelstrang-DNA in das Gel hinein versteift oder aufgeweicht. Zentrifugieren Sie zunächst lyophilisiertes SA eins Einzelstrang-DNA bei 2000 ×g für 15 Sekunden, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Einzelstrang-DNA am Boden des Röhrchens befindet.

Nach der Zentrifugation bereiten Sie drei Millimolar SA-eins-Lösung vor, indem Sie 107 Mikroliter eines 1x-Tris-EDTA- oder TE-Puffers in das Gefäß geben. Erhitzen Sie den SA-eins-NTE-Puffer fünf Minuten lang auf 70 Grad Celsius oder bis der Pellet aus einzelsträngiger DNA vollständig gelöst ist. Danach bereiten Sie die SA-eins-polymerisierte Lösung vor, indem Sie 45 Mikroliter 40%iges Acrylamid und 18 Mikroliter 10x-Tribo-EDTA- oder TBE-Puffer hinzufügen und zentrifugieren, um die Vermischung zu erleichtern.

Setzen Sie eine P-200-Spitze ein, verbinden Sie sie mit einer Stickstoffgasquelle und lassen Sie langsam Stickstoffgas zwei bis drei Minuten lang durch die Lösung strömen. Zentrifugieren Sie danach die Probe 15 Sekunden lang bei 2000 G, um die Lösung zu sammeln. Geben Sie anschließend 4,5 µL einer 2 %igen Ammoniumpersulfat-Lösung oder PS zur Probe, um die Gel-Polymerisation einzuleiten, und mehrfaches Vorsichtiges Umstülpen des Reaktionsgefäßes, um die Komponenten zu vermischen. Nach erneuter Zentrifugation der Probe, um die Lösung für eine homogene Polymerisation zu sammeln, geben Sie 4,5 µL einer 20 %igen Tetraethylenmethylendiamin- oder TEDA-Lösung zur Probe, um die Polymerisation zu katalysieren, sobald die Probe durchmischung und Zentrifugation abgeschlossen hat. Entgasen Sie die Lösung abschließend drei bis fünf Minuten lang mit Stickstoffgas, um die Polymerisation abzuschließen und nicht umgesetzte Monomere zu minimieren.

Anschließend die Lösung 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Polymerisation abzuschließen und die SA-eine-polymerisierte Lösung zu erhalten. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte mit lyophilisierter SA zwei Einzelstrang-DNA, wobei 45, 18, 4, 0,5 bzw. 4,5 Mikroliter Acrylamid, T-B-E-A-P-S und Teed zu 108 Mikrolitern der SA-zwei-Lösung gegeben werden. Um die L-zwei-, R-zwei- und Kontrolllösungen herzustellen, zentrifugieren Sie die lyophilisierte Einzelstrang-DNA und geben Sie die zuvor beschriebenen Mengen an TE-Puffer zu der entsprechenden lyophilisierten Einzelstrang-DNA; erhitzen Sie die Lösung, bis sie vollständig gelöst ist, für die Gel-Lösung.

Erhitzen Sie die SA eins und SA zwei polymerisierten Lösungen auf 70 Grad Celsius für etwa eine Minute, bis die Viskosität der Lösung abnimmt. Geben Sie 10 Mikroliter oder 10 Teile der SA eins polymerisierten Lösung zu 10 Mikrolitern oder 10 Teilen der SA zwei polymerisierten Lösung hinzu.

Anschließend die SA1- und SA2-Polymerisationslösungen durch abwechselndes Erwärmen für jeweils 15 Sekunden bei 70 Grad Celsius und Rühren für jeweils 15 Sekunden mit einer Pipettenspitze insgesamt eine Minute lang miteinander vermischen. Nach dem Mischen sechs Mikroliter oder sechs Teile der 100%L2-Lösung hinzufügen, um ein 100%Gel zu bilden. Sobald die Probe wie zuvor beschrieben gemischt wurde, das 100%Gel mit einer Pipette in eine 60 Millimeter große Petrischale überführen und das Gel eine Stunde lang bei der optimalen Annealing-Temperatur erhitzen.

Als Nächstes ermöglichen Sie, dass DNA-Quervernetzungen durch eine vierstündige Inkubation der Gele bei Raumtemperatur weiterhin rekombinieren. Decken Sie das Gel nach der Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur mit PBS, das Kalzium und Magnesium enthält, ab, entfernen Sie den restlichen Puffer aus der Petrischale und geben Sie das Gel in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Erwärmen Sie zu diesem Zeitpunkt das 100 %-Gel bei 70 Grad Celsius für etwa 30 Sekunden oder bis das Gel weniger viskos ist.

Legen Sie für das Pipettieren Glas-Deckgläser auf einen 70 Grad Celsius heißen Wärmespeicherblock und lassen Sie sie ein bis zwei Minuten lang erwärmen. Geben Sie einen Tropfen optischen Klebstoff auf jedes Glas-Deckglas. Fügen Sie dann 20 Mikroliter des 100%igen Gels zu jedem Glas-Deckglas hinzu und lassen Sie das Gel schmelzen und sich darauf verteilen.

Entfernen Sie jedes Glas mit Gel vom Wärmeblock und stellen Sie es in eine 24-Loch-Zellkulturschale. Belichten Sie die Gele 15 Minuten lang mit UV-Licht der Wellenlänge 365 Nanometer. Nachdem das Gel eine Stunde lang bei optimaler Analttemperatur erhitzt wurde und die DNA-Quervernetzungen vier Stunden lang zur Rehybridisierung zugelassen wurden, geben Sie PBS hinzu.

Anschließend die Gele über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation den Puffer mit einer Pipette aus den Mulden entfernen, wobei darauf zu achten ist, das Gel nicht anzusaugen. Danach Sulfa Sampa hinzufügen, um jedes Gel zu bedecken.

Nachdem die Gele 15 Minuten lang UV-Licht mit einer Wellenlänge von 365 Nanometern ausgesetzt wurden, entfernen Sie das Sulfa Sampa. Spülen Sie die Gele einmal mit PBS, um das überschüssige Sulfa Sampa zu entfernen, nachdem Sie die vorherigen Schritte wiederholt haben. Inkubieren Sie die Gele über Nacht bei vier Grad Celsius in etwa 300 Mikrolitern einer 0,2 Milligramm pro Milliliter Poly-D-Lysin-Lösung. Anschließend waschen Sie die Gele zweimal für jeweils fünf Minuten mit PBS, um überschüssiges Polylysin zu entfernen, und geben Sie das Kulturmedium hinzu. Nach einer 30-minütigen Inkubation der Gele im Medium entfernen Sie das Medium unmittelbar vor der Zellseeding für die Zellkultur und Bildgebung.

Fibroblasten, die auf verhärtenden Gele kultiviert wurden, wiesen keine Veränderungen im Aspektverhältnis auf, zeigten jedoch eine größere Projektionsfläche als Fibroblasten, die auf 100%igen Gele gezüchtet wurden. Fibroblasten auf 100%igen Gele hatten eine kleinere Projektionsfläche und ein größeres Aspektverhältnis im Vergleich zu Fibroblasten auf 80%igen Gele. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Verhalten von Fibroblasten von der dynamischen Beschaffenheit der Mikroumgebung abhängt.

Neuronen, die auf weichenden Gelen gezüchtet wurden, wiesen keine Unterschiede in der Anzahl der primären Dendriten oder in der Axonlänge auf, zeigten jedoch kürzere primäre Dendriten im Vergleich zu Neuronen, die auf 50%igen Gelen kultiviert wurden. Wie in Fibroblastenstudien beobachtet, unterschieden sich die Neurophänotypen auf statischen Gelen von denen auf dynamischen Gelen. Neuronen, die auf 50%igen Gelen gezüchtet wurden, wiesen weniger primäre Dendriten und längere Axone auf als Neuronen auf 100%igen Gelen.

Bei dem Versuch, dieses Verfahren durchzuführen, ist es äußerst wichtig, daran zu denken, das viskose Gel genau anzupipettieren, da die Konzentrationen entscheidend dafür sind, ein Platzen des Gels zu vermeiden. Das genaue Pipettieren kann mehrere Versuche erfordern, und im Diskussionsteil dieses Protokolls bieten wir mehrere weitere Optionen an.