Herstellung von DNA-vernetztem Polyacrylamid, Hydrogele

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, DNA-vernetzte Polyacrylamid-Hydrogele herzustellen, die durch das Pipettieren von einzelsträngigen DNAs in das Kulturmedium nach dem Plattieren der Zellen versteift oder weicher werden können. Dies wird erreicht, indem zuerst lyophilisierte SA eins, SA zwei L zwei R zwei Resus suspendiert und einzelsträngige DNAs in Puffer kontrolliert und die SA eins und SA zwei Lösungen einzeln zu einem Polyacrylamid-Acrylamid-Rückgrat polymerisiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die polymerisierten Lösungen SA one und SA two mit der L zwei Lösung zu mischen, um das DNA-Gel zu bilden.

Anschließend wird die DNA-Gellösung mit optischem Kleber auf Glasdeckgläsern immobilisiert. Der letzte Schritt ist die Funktionalisierung der Gele durch Behandlung mit Sul Sampa und dann PDL. Letztendlich werden Zellen auf die DNA-Gele plattiert und die Gelelastizität wird durch Zugabe von R zwei L zwei moduliert oder einzelsträngige DNA kontrolliert, um die Gelelastizität zu erweichen, zu versteifen bzw. nicht zu verändern.

Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass die dynamische Natur des zugrunde liegenden Substrats das Zellverhalten steuert. Der Vorteil der Verwendung dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie CROs, Lingo und Kugelhydrogelen besteht darin, dass DNA-Gele keinen Stimulus wie UV benötigen, um ihre Elastizität zu modulieren. Stattdessen werden DNA-Gele durch die Diffusion von L zwei bzw. R zwei, einzelsträngiger DNA, durch das Gel versteift und erweicht. Zentrifugieren Sie zunächst eine einzelsträngige SA-DNA 15 Sekunden lang bei 2000 GS, um sicherzustellen, dass sich die gesamte einzelsträngige DNA am Boden des Röhrchens befindet.

Bereiten Sie nach der Zentrifugation drei Millimolare SA-1-Lösung vor, indem Sie 107 Mikroliter eines x Tris-, EDTA- oder TE-Puffers in das Röhrchen geben. Erhitzen Sie den SA one NTE-Puffer fünf Minuten lang bei 70 Grad Celsius oder bis das einzelsträngige DNA-Pellet vollständig aufgelöst ist. Anschließend bereiten Sie die polymerisierte Lösung SA one vor, indem Sie 45 Mikroliter 40% Acrylamid und 18 Mikroliter 10 x Tribo-, EDTA- oder FSME-Puffer und Zentrifuge hinzufügen. Diese Mischung erleichtert das Mischen.

Führen Sie eine P 200-Spitze ein, befestigen Sie sie an einer Stickstoffgasquelle in der Lösung und lassen Sie das Stickstoffgas zwei bis drei Minuten lang langsam durch die Lösung strömen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Probe 15 Sekunden lang bei 2000 Gs, um die Lösung zu sammeln. Wenn Sie mit 4,5 Mikrolitern 2 % Ammonium pro Sulfat oder einem PS in die Probe gekommen sind, um die Gelpolymerisation zu starten, drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, um es zu mischen. Nachdem Sie die Probe zentrifugiert haben, um die Lösung für eine homogene Polymerisation zu erhalten, fügen Sie 4,5 Mikroliter 20 % Tetraethylmethylen hinzu. Diamin oder T-T an die Probe gegeben, um die Polymerisation zu katalysieren Sobald die Probe gemischt und zentrifugiert wurde. Entgasen Sie die Lösung drei bis fünf Minuten lang mit Stickstoffgas, um die Polymerisation abzuschließen und inaktive Monomere zu minimieren.

Anschließend wird die Lösung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die Polymerisation abzuschließen und der SA eine polymerisierte Lösung zu geben. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte mit lyophilisierter SA, zwei einzelsträngiger DNA, fügen Sie 45, 18, 4, 0,5 und 4,5 Mikroliter Acrylamid T-B-E-A-P-S hinzu und teten Sie jeweils zu 108 Mikrolitern der SA-2-Lösung. Zur Herstellung der L zwei R zwei und Kontrolllösungen zentrifugieren Sie lyophilisierte, einzelsträngige DNA und fügen Sie die folgenden Mengen an TE-Puffer zu der entsprechenden lyophilisierten einzelsträngigen DNA hinzu, wie zuvor beschrieben, erhitzen Sie die Lösung, bis sie sich für die Gellösung aufgelöst hat.

Bei den Präparaten werden die polymerisierten Lösungen s sa one und SA two etwa eine Minute lang bei 70 Grad Celsius erhitzt. Bis die Viskosität der Lösung reduziert ist. 10 Mikroliter oder 10 Teile der SA one polymerisierte Lösung zu 10 Mikrolitern oder 10 Teilen der SA two polymerisierten Lösung hinzufügen.

Mischen Sie dann die polymerisierten Lösungen SA one und SA two durch abwechselndes Erhitzen für 15 Sekunden bei 70 Grad Celsius und 15 Sekunden lang unter Rühren mit einer Pipettenspitze für insgesamt eine Minute. Nach dem Mischen bei sechs Mikrolitern oder sechs Teilen 100%L zwei Lösungen zu einem 100%igen Gel bilden. Sobald die Probe wie zuvor beschrieben gemischt wurde, pipettieren Sie das 100%ige Gel in eine 60-Millimeter-Petrischale und erhitzen Sie das Gel eine Stunde lang auf die optimale Glühtemperatur.

Lassen Sie anschließend die DNA-Vernetzungen weiter rehybridisieren, indem Sie die Gele vier Stunden lang bei Raumtemperatur inkubieren. Decken Sie das Gel nach der Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur mit kalziumhaltigem PBS bei Magnesium ab, entfernen Sie den restlichen Puffer aus der Petrischale und geben Sie das Gel in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Erhitzen Sie zu diesem Zeitpunkt das 100%ige Gel bei 70 Grad Celsius für etwa 30 Sekunden oder bis das Gel weniger viskos ist.

Zum Pipettieren legen Sie die Glasabdeckung auf einen 70 Grad Celsius heißen Block und lassen Sie sie ein bis zwei Minuten lang erhitzen. Geben Sie einen Tropfen optischen Klebstoff auf jedes Glasabdeckglas. Geben Sie dann 20 Mikroliter des 100%igen Gels auf jeden Glasabdeckglas und lassen Sie das Gel schmelzen und verteilen Sie es.

Nehmen Sie jedes Glas mit Gel aus dem Heizblock und stellen Sie es in eine 24-Well-Gewebekulturschale. Setzen Sie die Gele 15 Minuten lang einem 365-Nanometer-UV-Licht aus. Nachdem Sie das Gel eine Stunde lang auf die optimale Analtemperatur erhitzt und die DNA-Vernetzungen vier Stunden lang rehybridisiert haben, fügen Sie PBS hinzu.

Dann inkubieren Sie die Gele über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation den Puffer mit einer Pipette aus den Vertiefungen und achten Sie darauf, das Gel nicht zu aspirieren. Fügen Sie dann Sulfa Sampa hinzu, um jedes Gel zu bedecken.

Sobald die Gele 15 Minuten lang 365 Nanometer UV-Licht ausgesetzt wurden, entfernen Sie die Sulfa-Sampa. Spülen Sie die Gele einmal mit PBS, um den überschüssigen Sulfa-Sampa zu entfernen, nachdem Sie die vorherigen Schritte wiederholt haben, inkubieren Sie die Gele in etwa 300 Mikrolitern von 0,2 Milligramm pro Milliliter Poly de Lycine über Nacht bei vier Grad Celsius. Wenn Sie fertig sind, waschen Sie die Gele zweimal fünf Minuten lang mit PBS, um überschüssiges Polylysin zu entfernen und Medien hinzuzufügen. Sobald die Gele 30 Minuten lang in Medien inkubiert wurden, entfernen Sie das Medium sofort, bevor Sie die Zellen für die Zellkultivierung und Bildgebung plattieren.

Fibroblasten, die auf Versteifungsgelen gezüchtet wurden, wiesen keine Veränderungen im Aspektverhältnis auf, wiesen aber eine größere Projektionsfläche auf als Fibroblasten, die auf 100%igen Gelen gezüchtet wurden. Fibroblasten, die auf 100%-Gelen gezüchtet wurden, hatten eine kleinere Projektionsfläche und ein größeres Aspektverhältnis als Fibroblasten, die auf 80%-Gelen gezüchtet wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Verhalten von Fibroblasten von der dynamischen Natur der Mikroumgebung abhängt.

Neuronen, die auf weichmachenden Gelen gezüchtet wurden, wiesen keine Unterschiede in der primären Dendritenzahl oder Axonlänge auf, wiesen jedoch kürzere primäre Dendriten auf als Neuronen, die auf 50%-Gelen gezüchtet wurden. Wie in Fibroblastenstudien waren die Neurophänotypen auf statischen Gelen anders als die Neurophänotypen auf dynamischen Gelen. Neuronen, die auf 50%-Gelen gezüchtet wurden, hatten weniger primäre Dendriten und längere Axone als Neuronen, die auf 100%-Gelen gezüchtet wurden.

Während der Versuch dieses Verfahrens äußerst wichtig ist, daran zu denken, das viskose Gel genau zu pipettieren, da Konzentrationen wichtig sind, um ein Platzen des Gels zu vermeiden, kann ein genaues Pipettieren mehrere Versuche erfordern, und wir bieten im Diskussionsteil dieses Protokolls mehrere andere Optionen an.