Name: Herstellung von DNA-vernetztem Polyacrylamid, Hydrogele (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von DNA-vernetztem Polyacrylamid-Hydrogel für Zellbiologie und Gewebetechnik. Diese Methode ermöglicht die dynamische Steifigkeitsmodulation zur Untersuchung zellulärer Mechanik.

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Die Autoren danken: Dr. Frank Jiang, Dr. David Lin, Dr. Bernard Yurke und Dr. Uday Chippada für ihre Beiträge zur Entwicklung der DNA-Gel-Technologie; Dr. Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter für ihre Kommentare und Bearbeitungen dieser Handschrift; Finanzierungsquellen, einschließlich der New Jersey Kommission auf Rückenmarksforschung (Grant # 07A-019-SCR1, NAL) und New Jersey Neuroscience Institute (MLP); und Herausgeber von Tissue Engineering, Teil A, für die Erlaubnis, 2 und 4 und Biomaterialien für die Erlaubnis, Abbildung 3 Reprint.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Fähigkeit von DNA-Gelen zu erweichen oder zu versteifen, bevor und nachdem die Zelladhäsion macht sie zu einem idealen Modell, um die Rolle von Gewebesteifigkeit dynamisch auf die Zellfunktion untersucht werden. Alle drei Ausführungen sind in mechanischen und biologischen Untersuchungen verwendet. Allerdings haben alle drei Ausführungen ähnlich Elastizitäten bei verschiedenen Vernetzungsprozent anzeigt Vernetzungslänge nicht beeinflusst DNA Gel-Elastizität (Tabelle 2). Im Gegensatz dazu betrifft Acr...

Statische und dynamische Substrate gibt zwei Kategorien von Biomaterialien, die entwickelt wurden, um die Wirkungen einer Gewebe Elastizität oder Steifigkeit auf die Zellfunktion untersucht werden. Statische Substrate sind nicht in der Lage, ihre physikalischen Eigenschaften ändern, nachdem sie hergestellt sind, und / oder einmal Zellen plattiert. Polyacrylamid (PA)-Gelen wurden die ersten zweidimensionalen statischen Substraten für Untersuchungen Mechanobiologie 5,17 synthetisiert. PA Gele sind leicht herzustellen, preiswert, flexibel und kann mit einer Vielzahl von elastischen Moduli hergestellt werden. Obwohl diese technischen Vorteile machen PA-Gele häufig angewendet Substrat, sind statische Substrate kein Hinweis auf die Dynamik der extrazellulären Matrix (ECM) und die umliegenden Zellumgebung in vivo. Zum Beispiel kann die ECM-Steifigkeit erfährt Änderungen als Folge von Verletzungen, die Entwicklung oder Krankheit. Dynamische Substrate werden daher als gehirnähnlichen Substrat Modelle in Mechanobiologie Studien begünstigt <sup&gt; 22,24,25. Zahlreiche synthetische, natürliche, zweidimensionalen, dreidimensionalen, statischen und dynamischen Biomaterialien wurden entwickelt, um Gewebesteifigkeit 1,3,6,16,23,26 imitieren. Einige dynamische Substrate benötigen Wärme, UV, elektrischen Strom, Ionen und pH-Änderungen, um ihre mechanischen Eigenschaften zu verändern 2,4,7,8,12,15,16, aber diese Reize Bio-Anwendung des Hydrogels zu beschränken. DNA-Polyacrylamid vernetzt Hydrogele (DNA Gele) sind dynamisch zweidimensionalen elastischen Substraten. DNA-Vernetzungen ermöglichen zeitlichen, räumlichen und reversible Modulation der DNA-Gel-Steifigkeit durch die Zugabe von Einzelstrang-DNA (ssDNA), um Medien oder Puffer 9-11,13,14,18,21. Im Gegensatz zu den oben erwähnten dynamischen Gele wo Stimuli zur Modulation der Elastizität aufgebracht, stützen sich die DNA Gele auf der Diffusion von Applied ssDNA zur Veränderung der Elastizität. Deshalb ist die obere Geloberfläche, wo Zellen gezüchtet werden, ist der erste Bereich moduliert, da die Geschwindigkeit of Elastizität Modulation hängt von der Gel-Dicke. DNA-Gele sind ähnlich wie ihre Gegenstücke in PA-Gel, dass sie eine Polyacrylamid-Rückgrat haben jedoch die Bis-Acrylamid Vernetzungen mit Vernetzungen von DNA (Figur 1) zusammengesetzt ersetzt. Zwei ssDNAs (SA1 und SA2) hybridisieren mit einem Vernetzer Strang (L2) bilden die DNA-Quervernetzungen des Gels. SA1 und SA2 haben verschiedene Sequenzen, die sowohl eine ACRYDIT Modifikation am 5&#39;Ende für eine effektive Einbindung in die PA-Netzwerk enthalten. Zur Herstellung des Gels, SA1 und SA2 werden einzeln in einem PA Gerüst polymerisiert und anschließend die polymerisierten SA1 und SA2 werden miteinander vermischt. L2, das Vernetzungsmittel wird zu der SA1 und SA2 Mischung zugegeben. Der L2-Basensequenz komplementär zu beiden SA1 und SA2 und L2 Sequenzen hybridisiert SA1 und SA2, um die DNA-Vernetzungen zu bilden. Initial, DNA-Gel Elastizität wird von beiden L2-Konzentrationen und Vernetzung (Tabellen 1 bestimmt </strong&gt; und 2). DNA-Gelen, die gleiche stöchiometrische Mengen L2, SA1, SA2 und sind die härtesten Gele, weil SA1 und SA2 sind 100% vernetzt durch L2 (als 100% Gele bezeichnet). Niedrigere Konzentrationen von L2 zu einem niedrigeren Prozentsatz an DNA-Vernetzung und damit weicher DNA Gele. Gele so niedrig wie 50% vernetzt (zu 50% Gele bezeichnet) wurden konstruiert, 9-11. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. DNA-Gel Vernetzung und uncrosslinking schematische 9-11,13,14,18,21. Schritt 1: SA1 (rot) und SA2 (blau) werden einzeln in einem Polyacrylamid-Rückgrat (schwarz) polymerisiert. Nach der Polymerisation werden SA1 und SA2 polymerisiert Lösungen miteinander vermischt. Schritt 2: L2 (grün) zu und hybridisiert mit SA1 und SA2, die Vernetzungen des Gels. Schritt 3: R2 hybridisiert mit ter Ansatzpunkt von L2. Schritt 4: Brückenkopf-Hybridisierung von R2 treibt das Entpacken von L2 von SA1 und SA2. Im Gegensatz zu PA-Gele können DNA-Gele zu versteifen und zu erweichen nach der Synthese. Aus diesem Grund können die Zellen auf DNA-Gelen gezüchtet, um dynamische Steifigkeit Änderungen unterzogen werden. Zellhaftenden Gelen erstarren kann L2 zu den Kulturmedien von geringen Prozentsatz Gels zugegeben werden, um den Prozentsatz von Vernetzungen zu erhöhen. Erweichen zellhaft Gele können L2 entfernt werden, um den Prozentsatz von Vernetzungen 10,13,21 verringern. L2 hat einen zusätzlichen Brückenkopf-Sequenz am 3&#39;Ende zu ermöglichen L2 von SA1 und SA2 (Tabelle 1) uncrosslink. Entfernung von L2 durch Hybridisierung einer Umkehrstrang genannt R2 erreicht. R2 ist komplementär zu der vollen Länge von L2 und hybridisiert mit dem ersten Ansatzpunkt L2. Brückenkopf-Hybridisierung treibt das Entpacken von L2 von SA1 und SA2, die die Vernetzungs beseitigt und reduziert das Gel Steifigkeit. In diesem Bericht undVideo, Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Herstellung von Versteifungs und Erweichung DNA-Gelen zur Verfügung gestellt. Während 100% und 80% Gel Präparate beschrieben, kann dieses Protokoll zugeschnitten werden, um DNA-Gelen anderer anfänglichen und endgültigen vernetzten Prozentsätze zu erstellen. Im allgemeinen sind 100% und 80% Gele hergestellt, auf Glas-Deckgläschen immobilisiert, funktionalisiert und mit Zellen besät. L2 ist mit den Medien 80% Gele gegeben und R2 ist mit dem Medium 100% Gelen, 48 h nach dem Plattieren zugegeben. Die Zugabe von L2 Medien versteift 80% bis 100% Gelen vernetzt, während die Zugabe von R2 Medien erweicht 100% Gele zu 80% vernetzt ist. Versteift Gele sind als 80 → 100% Gele bezeichnet und aufgeweicht Gele als 100 → 80% Gele im Text bezeichnet. Für die Kontrolle oder statische Gele, ssDNA aus Ts oder As ist, um einen weiteren Satz von 100% und 80% Gelen geliefert. Nach einem Minimum von zwei Tagen nach der Elastizität Modulations können Zellen verarbeitet und analysiert werden. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:kEEP-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> DNA-Vernetzung </td><td rowspan="2"> # Basen </td><td> Sequenz (Brückenkopf) </td><td rowspan="2"> Änderung </td><td rowspan="2"> Schmelztemperatur (T m ° C) </td><td rowspan="2"> Kommentare </td></tr><tr><td> 5 &#39;→ 3&#39; </td></tr><tr><td rowspan="4"> Design 1 </td><td> SA1 </td><td> 10 </td><td> GCA CCT TTG C </td><td> 5 &#39;ACRYDIT </td><td> 34,9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 10 </td><td> GTC AGA ATG A </td><td> 5 &#39;ACRYDIT </td><td> 23,6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 30 </td><td> TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG </td><td></td><td> 56 </td><td>Ein 10 bp-Sequenz Ansatzpunkt ist inbegriffen. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 30 </td><td> CAA GTG CGC TAG ACC TTT GCG TCA GAA TGA </td><td></td><td></td><td> R2 ist komplementär zu L2 </td></tr><tr><td rowspan="4"> Design 2 </td><td> SA1 </td><td> 14 </td><td> CGT GGC ATA GGA CT </td><td> 5 &#39;ACRYDIT </td><td> 46,9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 14 </td><td> GTT TCC CAA TCA GA </td><td> 5 &#39;ACRYDIT </td><td> 40,2 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C </td><td></td><td> 65,9 </td><td> Ein 12-bp-Sequenz Ansatzpunkt ist inbegriffen. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 40 </td><td> GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A </td><td></td><td> 65,9 </td><td> R2 ist komplementär zu L2 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Design 3 </td><td> SA1 </td><td> 20 </td><td> ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC </td><td> 5 &#39;ACRYDIT </td><td> 55 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 20 </td><td> CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA </td><td> 5 &#39;ACRYDIT </td><td> 56,6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T </td><td></td><td> 68,8 </td><td> Ansatzpunkt ist nicht inbegriffen. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Kontrolle </td><td rowspan="2"> Kontrolle </td><td rowspan="2"> 20-40 </td><td> AAA AAA (etc.) oder </td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> TTT TTT (usw.) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Basissequenzen für ssDNA 9-11,13,14,18,21. Zelluläre und mechanischen Studien haben mehrere d verwendetifferent Vernetzungs Designs zur DNA-Gelen mit verschiedenen statischen und dynamischen mechanischen Eigenschaften zu erzeugen. Die in der Quer Design moduliert Parameter sind Basensequenz und Sequenzlänge oder vernetzen Länge. Bold und kursiv Schriften veranschaulichen Basenpaarung zwischen SA1 und L2 und zwischen SA2 und L2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="8"> Design </td></tr><tr><td colspan="3"> 1 </td><td colspan="3"> 2 </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td> Acrylamidkonzentration (%) </td><td colspan="3"> 10 </td><td colspan="3"> 10 </td><td> 10 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SA1 und SA2 auf den L2-hybridisiert (% vernetzt) </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> &lt;strong&gt; Elastizität (kPa, Mittelwert ± SEM) </td><td> 6,6 ± 0,6 </td><td> 17,1 ± 0,8 </td><td> 29,8 ± 2,5 </td><td> 5,85 ± 0,62 </td><td> 12,67 ± 1,33 </td><td> 22.88 ± 2.77 </td><td> 25,2 ± 0,5 </td><td> 10,4 ± 0,6 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Elastizitätsmodul (E) von DNA-Gelen 9-11,13,14,18,21. Acrylamidkonzentration, Vernetzungsprozent und Vernetzungs Länge kann in DNA-Gelen moduliert werden. Motive 1, 2 und 3 sind 20, 28 und 40 bp Vernetzungslängen sind. 100%-Gele für alle Ausführungen haben ähnliche Module anzeigt vernetzen Länge hat keinen Einfluss auf Gel-Elastizität. Variationen in Acrylamidkonzentration verändern jedoch DNA-Gel Elastizität.

<table><tbody><tr><td>ssDNA</td><td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com</td><td></td><td>Wirbeln Sie ssDNA nicht. Drehen Sie die Durchstechflasche und/oder die Pipettenlösung vorsichtig um, um sie zu mischen.</td></tr><tr><td>PBS mit Calcium und Magnesium</td><td></td><td></td><td>Jede Marke.</td></tr><tr><td>100x Tris-EDTA-Puffer (TE-Puffer)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris-Borat-EDTA-Puffer (FSME-Puffer)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>93290</td><td>FSME ist ein Fortpflanzungsgift.</td></tr><tr><td>40% Acrylamid Lösung</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>BP14021</td><td>Acrylamid ist ein Toxin.</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>A3678</td><td>Eine 2%ige Lösung in TE-Puffer herstellen. APS ist ein Toxin und ein Reizstoff.</td></tr><tr><td>Tetramethylethylendiamin (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>T9281</td><td>Bereiten Sie eine 20%ige Lösung in TE-Puffer vor. TEMED ist brennbar, ätzend und giftig.</td></tr><tr><td>Rundes Deckglas mit 12 mm Durchmesser</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)<br/</td><td>>fishersci.com 12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Norland optischer Klebstoff 72</td><td>Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com</td><td>NOA72</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Gewebekulturplatte</td><td></td><td></td><td>Jede Marke.</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td></td><td></td><td>Jede Marke.</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>ProteoChem oder Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com oder thermofisher.com</td><td>C111 oder 22589</td><td>Bereiten Sie unmittelbar vor Gebrauch eine Lösung von 0,315 mg/ml in Wasser vor. Bei 37 Grad auflösen; C und Filter sterilisieren. Es ist normal, ungelöstes Sulfo-SANPAH im Filter zu beobachten. Sulfo-SANPAH ist lichtempfindlich und daher sollte die Lösung bis zur UV-Einwirkung vor Licht geschützt werden.</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>P6407</td><td>Eine Lösung von 0,2 mg/ml in Wasser herstellen und mit dem Filter sterilisieren.</td></tr><tr><td>Kollagen Typ I</td><td>Affymetrix (Santa Clara, Kalifornien) affymetrix.com</td><td>13813</td><td>Bereiten Sie eine Lösung von 0,2 mg/ml in 0,2 N Essigsäure vor. Die Lösung muss immer kalt bleiben, um eine Polymerisation zu vermeiden. Essigsäure ist brennbar, giftig und ätzend.</td></tr><tr><td>22 x 60 Deckglas</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Direktverdrängerpipette</td><td>Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com</td><td>F148504</td><td></td></tr><tr><td>Heizblock</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>UV-Lichtquelle</td><td></td><td></td><td>Platzieren Sie Gele so nah wie möglich am UV-Licht. UV-Licht kann Haut- oder Augenverletzungen verursachen.</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td>Jede Marke.</td></tr><tr><td>Stickstoffgas</td><td>GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/</td> <td>NI 5.0UH-R</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von dna-vernetztem polyacrylamid, hydrogele

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiologie ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet, das die kritische Rolle der körperliche Signale in der Leitung der Zellmorphologie und Funktion adressiert. Zum Beispiel ist die Wirkung der Elastizität des Gewebes auf die Zellfunktion ein wichtiger Bereich der Forschung, da Mechanobiologie Gewebesteifigkeit moduliert mit der Krankheit, Entwicklung und Verletzungen. Statische Gewebe-ähnlichen Materialien oder Materialien, die nicht ändern kann, wenn die Steifigkeit Zellen plattiert werden hauptsächlich verwendet, um die Effekte der Gewebesteifigkeit auf die Zellfunktionen zu untersuchen. Während Informationen aus statischen Studien gesammelt wertvoll ist, sind diese Studien kein Hinweis auf die dynamische Natur der zellulären Mikroumgebung in vivo. Um die Wirkungen der dynamischen Steifigkeit auf die Zellfunktion besser erfüllen eine DNA-vernetzte Polyacrylamid-Hydrogel-System (DNS-Gele) entwickelt. Im Gegensatz zu anderen dynamischen Substraten, haben DNA-Gelen die Fähigkeit zu verringern oder zu erhöhen in der Steifigkeit nach der Herstellung ohne Reize. DNA-Gele bestehen aus DNA crosslTinten, die in einem Polyacrylamid-Grundgerüst polymerisiert werden. Hinzufügen und Entfernen von Vernetzungen durch Lieferung von Einzelstrang-DNA kann zeitlicher, räumlicher und reversible Steuerung Gelelastizität. Wir haben in früheren Berichten dargestellt, dass die dynamische Modulation der DNA-Gel Elastizität beeinflusst Fibroblasten und Neuronen Verhalten. In diesem Bericht und Video bieten wir eine schematische, die die DNA-Gel Vernetzungsmechanismen und Schritt-für-Schritt-Anleitung beschreibt auf die Vorbereitung DNA-Gelen.

Vor unserer Studien wurden zell ECM-Wechselwirkungen auf statische konform Biomaterialien oder irreversibel und unidirektionalen dynamischen Substraten beobachtet. Diese Substrate müssen nicht genau die dynamische Natur der zellulären Mikroumgebung. Unsere Arbeit verschiebt die bestehenden technischen Paradigmen, indem sie einen physiologischen Modell zur Untersuchung von Zell-ECM-Interaktionen auf Erweichung und Versteifungs dynamische Biomaterialien. In früheren Studien untersuchten wir die Wirkungen von dynamischen S...

Unser Labor hat DNA-vernetzte Polyacrylamid-Hydrogele, ein dynamisches System Hydrogel entwickelt, um die Effekte der Modulation Gewebesteifigkeit auf die Zellfunktion zu verstehen. Hier bieten wir Schaltpläne, Beschreibungen und Protokolle, um diese Hydrogele vorzubereiten.

Herstellung von DNA-vernetztem Polyacrylamid, Hydrogele

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, DNA-vernetzte Polyacrylamidhydrogels herzustellen, die sich versteifen oder weichen lassen, indem einzelsträngige DNA-Moleküle nach dem Ansäen der Zellen in das Kulturmedium pipettiert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst lyophilisiertes SA1, SA2, L2, R2 und die Kontroll-Einzelstrang-DNAs in Puffer resuspendiert und anschließend die SA1- und SA2-Lösungen einzeln in ein Polyacrylamid-Backbone polymerisiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die polymerisierten SA1- und SA2-Lösungen mit der L2-Lösung zu mischen, um das DNA-Gel zu bilden.Anschließend wird die DNA-Gel-Lös游戏副本 auf Glasdeckgläser mit optischem Kleber fixiert. Der letzte Schritt besteht in der Funktionalisierung der Gele durch Behandlung mit Sul Sampa und anschließend PDL. Abschließend werden Zellen auf die DNA-Gele ausplattiert, und die Gel-Elastizität wird durch Zugabe von R zwei L zwei oder einer Kontroll- Einzelstrang-DNA moduliert, um die Elastizität des Gels jeweils zu verringern, zu erhöhen oder unverändert zu lassen.Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass die dynamische Natur des zugrunde liegenden Substrats das Zellverhalten beeinflusst.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir präsentieren Protokolle für die 3-dimensionale (3D) Verkapselung von Zellen innerhalb synthetischen Hydrogelen. Die Kapselung Verfahren ist für zwei häufig verwendete Methoden der Vernetzung (Michael-Addition und Licht-initiierte radikalische Mechanismen), sowie eine Reihe von Techniken für die Beurteilung der eingekapselten Zellen Verhalten skizziert.

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogele für Tissue Engineering

Die Wirkung von Substraten Steifigkeit auf die zelluläre Funktion modelliert werden...

Untersuchung der Auswirkungen von Matrix Stiffness auf Cellular-Funktion mit Acrylamid-basierte Hydrogele

In diesem Video zeigen wir die experimentelle Techniken verwendet, um konform, extrazellulären Matrix (ECM) beschichtete Substrate für Zellkulturen herzustellen, und die durchaus in Zugkraft Mikroskopie und Beobachten Auswirkungen der ECM Steifigkeit auf das Verhalten der Zelle.

Vorbereitung der Beschwerde Matrizen zur Quantifizierung von Cellular Kontraktion

Wir präsentieren ein neues Polyacrylamid-Hydrogel, genannt Hydroxy-PAAm, die mit minimalen Kosten oder Know-how eine direkte Bindung von ECM-Proteine ​​ermöglicht. Die Kombination von Hydroxy-PAAm Hydrogele mit Mikrokontaktdruck erleichtert eine unabhängige Steuerung der vielen Hinweise des natürlichen Zellmikroumgebung für die Untersuchung zellulärer mechanostransduction.

Herstellung von Hydroxy-PAAm Hydrogele zur Entkopplung der Auswirkungen von Mechanotransduction Cues

Mechanische Steifigkeit in der Tumor-Mikroumgebung spielt eine entscheidende Rolle bei der malignen Verhalten durch Erhöhung invadopodia Aktivität und Actomyosin Kontraktilität. Verwendung Polyacrylamidgelen (PAAs), kann invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden, die invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in Reaktion zu untersuchen, um die Steifigkeit Matrix.

Polyacrylamidgelen für Invadopodia und Traction Force-Assays auf Krebszellen

Hier wird eine Methode beschrieben, die eine schnelle, effiziente und kostengünstige Herstellung von Polyacrylamid-Gelen in einem Multiwell-Plattenformat ermöglicht. Die Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann von jedem Forschungslabor leicht übernommen werden. Es wäre besonders nützlich in der Forschung, die sich auf das Verständnis steifigkeitsabhängiger Zellreaktionen konzentriert.

Einfache Polyacrylamid-basierten Multiwell Steifigkeit Assay für das Studium der Steifigkeit abhängige Zell-Antworten

Die Zelldifferenzierung wird durch eine Vielzahl von Mikroumgebungsfaktoren reguliert, einschließlich der beiden Matrixzusammensetzung und Substratmaterialeigenschaften. Wir beschreiben hier eine Technik unter Verwendung von Zellmicroarrays in Verbindung mit Traktionskraftmikroskopie sowohl Zelldifferenzierung und biomechanischen Zell-Substrat-Wechselwirkungen als Funktion der Mikroumgebungskontext zu bewerten.

Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Dieses Protokoll beschreibt die Charakterisierung der DNA-Polymerase Synthese von modifizierten DNA durch Beobachtung der Veränderungen an der Nah-Infrarot-Eindringmittel beschrifteten DNA mittels Gelelektrophorese und Gel-Bildgebung. Acrylamid Gele werden für hochauflösende Bildgebung der Trennung von kurzen Nukleinsäuren verwendet, die mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in Abhängigkeit von Größe zu migrieren.

DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

Traditionell wird der vertikale Scheiben schneiden und die ganze-mount Vorbereitung der Netzhaut verwendet worden, um die Funktion der Netzhaut Schaltkreise zu untersuchen. Hier beschreiben wir den Roman Slicing-Verfahren, um die dendritischen Morphologie der retinalen Nervenzellen intakt zu erhalten.

Horizontale Scheiben Vorbereitung der Retina

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Erzeugung von neuronalen Kulturen vom späten Embryo und frühen postnatalen Maus Kortex. Diese Kulturen können für Immunzytochemie, Biochemie, Elektrophysiologie, Calcium und Natrium Bildgebung verwendet werden und bieten eine Plattform, um die neuronale Entwicklung von transgenen Tieren, die ein postnatale tödlichen Gen-Mutation tragen zu studieren.

Vorbereitung von dissoziierten Maus kortikale Neuron Kulturen

Lernen Sie die Herstellung von DNA-vernetztem Polyacrylamid-Hydrogel für Zellbiologie und Gewebetechnik. Diese Methode ermöglicht die dynamische Steifigkeitsmodulation zur Untersuchung zellulärer Mechanik.

Herstellung von DNA-vernetztem Polyacrylamid, Hydrogele

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