Name: Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-21T15:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Erfahren Sie, wie Leukozyten-Rekrutierung über Leberendothelzellen unter Schubspannung untersucht wird. Diese Methode nutzt Phasenkontrastmikroskopie zur Analyse lymphozytärer Adhäsion und liefert Erkenntnisse für antiinflammatorische Therapien bei chronischen Lebererkrankungen.

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SS wird durch ein Wellcome Trust Zwischen Clinical Fellowship, CW durch ein Wellcome-Trust-Programm Zuschuss finanziert.

1. Mikroobjekt Vorbereitung <ol><li> Vorstrich ein Sechskanal-Mikroobjekt mit Rattenschwanz-Kollagen Typ I (RTC, in PBS 1:100 verdünnt geben eine Arbeitsverdünnung von 220 pg / ml). Dies wird durch Einspritzen von 30 &amp;mgr; l verdünnt RTC-Lösung direkt in die Kanäle und Inkubation für 2 h bei 37 ° C, gefolgt von drei Waschungen mit PBS durchgeführt. </li></ol> 2. Seeding Zellen in Mikroobjekt <ol><li> In Trypsin-EDTA dissoziiert einer konfluenten T75-Flasche von kultivierten humanen hepatischen sinusoidalen Endothelzellen (HSEC) (aus Lebergewebe isoliert, wie zuvor beschrieben, 13), Waschen mit PBS und Resuspendieren in 3 × 10 6 Zellen / ml in Komplettmedium (human endothelial Grundmedium mit 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100μg/ml Streptomycin, 10% hitzeinaktiviertes AB Humanserum, 10 ng / ml vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor und 10 ng / ml an Hepatozyten-Wachstumsfaktor) supplementiert. Spritzen Sie 30 ul Zellsuspension directly in jeden Kanal. </li><li> Lassen Zellen für 1 Stunde in einem befeuchteten Inkubator bei 37 anhaften ° C mit 5% CO 2-Atmosphäre auf einer Folie Rack. Nachdem die Zellen anhaften zu füllen die Ports auf jeder Seite jedes Kanals mit Vollmedium (Fig. 1). </li></ol> 3. Cytokin-Stimulation von Zellen <ol><li> Lassen Zellen in Inkubator für 24 Stunden. Bewerten Zellwachstum mit einem inversen Phasenkontrastmikroskop. 24 Stunden vor dem Adhäsionstest, Stimulation der endothelialen Monoschichten mit Cytokin durch Austausch des Wachstumsmediums mit Vollmedium von Tumor-Nekrose-Faktor alpha und Interferon-gamma ergänzt, die beide bei 10 ng / ml. </li></ol> 4. Isolierung von Lymphozyten aus peripherem Blut <ol><li> Isolierung von Lymphozyten aus peripherem Blut Vollblut durch anfängliches Reinigen der einkernigen Fraktion durch Dichtegradientenzentrifugation über eine geeignete Zelltrennmittel Zentrifugation für 25 min bei 800x g. Die Zellen auf Kunststoff für 1 h inkubiert, um die Einhaltung von Monozyten zu ermöglichen. </li><li> Nach Einhaltung der Kunststoff absaugen Lymphozyten angereicherten Überstand. Waschen der Lymphozyten und resuspendieren sie (üblicherweise 1 x 10 6 Zellen / ml in Strömungsmedium (Endothelial Basal Medium, enthaltend 0,1% (v / v) Rinderserumalbumin (BSA)). </li></ol> 5. Vorbehandlung von Endothel oder Leukozyten mit Inhibitoren <ol><li> Vorbereitung empfohlenen Verdünnungen Funktion blockierende Antikörper oder niedermolekularen Inhibitoren der endothelialen media/0.1% (v / v) BSA. Ersetzen Sie Vollmedium mit blockierenden Antikörper / Inhibitor-Lösung in ausgewählten Mikroobjekt Kanal 30 min vor Test fließen. </li><li> Wobei die Vorbehandlung von Chemokin-Rezeptoren auf Lymphozyten sind geplant, resuspendieren isolierten Leukozyten in RPMI-Lösung, die 0,1% (v / v) BSA und Inkubation mit 200 ng / ml Pertussistoxin auf G-Protein-gekoppelte Rezeptoraktivität von Chemokin-Rezeptoren blockieren, alternativ verdünnen spezifischen Funktionblockierenden Antikörpern oder niedermolekularen Inhibitoren von Chemokin-Rezeptoren bei den empfohlenen Verdünnung. Leukozyten Bei 37 ° C für 30 Minuten, dann waschen und resuspendieren in Strömungsmedium. </li></ol> 6. Setup-Flow-Testsystem <ol><li> Vorwärmen eine thermostatisch gesteuerte transparente Kammer 37 ° C. Die Kammer sollte Öffnungen zum Einführen Silikonschlauch und Elektronikversorgung für eine elektronische Schaltmagnetventil, das zwischen den Zellen und Medien können praktisch ohne Totvolumen. Die Kammer ist auf einem inversen Mikroskop, damit montiert Phasenkontrastmikroskopie. Fig. 2 zeigt die Strömungsanalysekammer und Mikroobjekt Mikroskop und auf dem Mikroskoptisch platziert. </li><li> Prefill eine 50 ml Glasspritze mit Luer-Lock mit 10 ml sterilem destilliertem Wasser und legen eine Länge von 25 cm Silikonschlauch mit dem Spritzenkanal. Legen Sie in eine Spritzenpumpe. Verändern die Abzugsgeschwindigkeit des Spritzenpumpe nachAnweisungen des Herstellers Mikrodia einer Scherbelastung von 0,05 Pa (0,5 dyn / cm 2, Fig. 3) zu halten. </li><li> Nehmen Sie zwei 5-ml-Spritzen, entsorgen Sie die Kolben und befestigen Sie die Fässer mit den beiden in-Flussöffnungen eines elektronischen Magnetventil mit Silikonschlauch. <ol><li> Bringen 12 cm Silikonschlauch an den Abfluss Ventil. Das Ventil ermöglicht Wechsel zwischen einem zellfreien Waschpuffer (endothelial media/0.1% (v / v) BSA) und der Lymphozytensuspension. </li><li> Spülen der elektronischen Magnetventils durch Einsetzen Waschpuffer in beiden Spritzenzylinder und die Gewährleistung Puffer aus einem Zylinder durch das Ventil und in den Abfluss Silikonschlauch fließt. </li><li> Verwenden Sie den Ventilschalter auf die andere Trommel abwechselnd und sicherzustellen, dass die Puffer fließt und dass alle Luftblasen aus dem System entfernt. Entfernen Waschpuffer von einem der Fässer und ersetzen mit Lymphozytensuspension 4a. </li></ol></li><li> Schließen Sie das Silikon Tubing aus der Spritzenpumpe an einem Port eines ausgewählten Mikroobjektkanal über einen Mikroobjektteil. Dann verbinden Sie den Silikonschlauch von der Ablaufventil auf der gegenüberliegenden Hafen über einen Mikroobjektteil. Stellen Sie sicher, dass die Silikonschlauch und die Adapter mit Waschpuffer vor der Verbindung gefüllten Luftblasen in das System (Abbildung 4b) zu verhindern. </li><li> Einmal auf das Flusssystem angeschlossen, stellen Sie den Mikroobjekt auf dem Mikroskoptisch und bringen mit Clips oder Klebeband auf die Bewegung zu verhindern. Stellen Sie das Mikroskop auf die 10X-Objektiv zusammen mit der entsprechenden Phase-Einstellung. Sicherstellen, dass die endotheliale Monolayer visualisiert und Fokus mit der Augenlinse. Bilder sorgen kann über eine Kamera, die mit dem Mikroskop, wobei Bilder auf einem Monitor weitergeleitet und aufgezeichnet werden angebracht erfasst werden. </li></ol> 7. Flow-Assay-Technik und Aufzeichnung der Haftung für Analysis <ol><li> Perfundieren das Endothel mit Waschpuffer für 2 min von Beginn withdrawal der Spritzenpumpe, um jeglichen Schmutz oder ungebundenen Antikörper zu entfernen Sperrung und wechseln Sie dann das Ventil, um eine 5 min Bolus von Leukozyten-Lösung bei einer konstanten Wandschubspannung von 0,05 Pa ermöglichen </li><li> Während der letzten 2 min der Leukozyten-Bolus, notieren 10 Zufallsfelder entlang der Länge des Mikroobjekt. Dies ermöglicht die Offline-Analyse von Lymphozyten-Roll / Tethering auf dem Endothel-Monolayer. Nehmen Sie jedes Feld für ca. 10 Sek., bevor Sie zum nächsten und sicherzustellen, dass Aufnahmen gegen die Strömungsrichtung der Aufnahme den gleichen Roll Zelle zweimal schnell hintereinander zu vermeiden. </li><li> Folgen der Leukozyten Bolus mit einem 5 min Bolus Waschpuffer durch Rückkehr des Ventils in seine Startposition. Während der letzten 2 Minuten des Bolus Durchführung einer zweiten Aufnahmephase durch die Wahl mindestens 10 zufällig ausgewählten Bereichen entlang der Länge des Mikroobjekt. Nehmen Sie jedes Feld für ca. 5 sec, bevor Sie zum nächsten und sicherzustellen, dass die endotheliale Monolayer und haft leucocytes sind in klaren Fokus. Dies ermöglicht die Offline-Analyse des Musters der Adhäsion. </li></ol>

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen

Der kritischste Schritt für eine erfolgreiche Durchführung Flow-Assay wird sichergestellt, dass eine gesunde und konfluente Monoschicht von Endothelzellen bereit ist vor der Durchfluss Adhäsionstest. Primäre Endothelzellen schwierig, Kultur und sensibel auf Veränderungen in der Kultivierungsverfahren sein kann. Es ist wichtig, dass 1) Strömungskammern ausreichend und gleichmäßig mit endothelialen Zellen in einer Monoschicht beschichtet ist, für HSEC wir Rattenschwanzkollagen vom Typ I, aber dies kann für andere endotheliale Populationen unterscheiden, 2) Kulturmedium für die Zelltyp geeignet, für HSEC haben wir unsere Komplettmedium in der Protokoll-Abschnitt beschrieben. Weitere wichtige Schritte sind die Festlegung der Spritzenpumpe mit der entsprechenden Rate auf physiologische Werte der Scherspannung zu reflektieren. Während des Flow-Assay ist es notwendig, Luftblasen innerhalb des Strömungskreislaufs, der die endotheliale Monoschicht beschädigen oder Streifen Immunzellen aus dem Endothel Oberfläche zu verhindern. Dies kann durch en verhindert werdenSüring, dass alle Silikonschlauch und Adapter sind mit Waschpuffer vor der Verbindung durchblutet, dass alle Luftblasen entfernt werden und dass die Medien vor der Verwendung vorgewärmt. Wenn die Adapter an die Anschlüsse auf der Mikroobjekt ist es sehr wichtig, dass es eine Flüssigkeit / Flüssigkeit-Grenzfläche während der Verbindung, wenn es irgendeine Luft, dann wird dies einen Luftspalt innerhalb des Systems, die den endothelialen Monoschicht während der Spritze Rückzug stören wird auszubilden Schritt. Die Leukozyten-Lösung in den Spritzenzylinder regelmässige Bewegung zu gewährleisten, dass die Zellen sich nicht absetzen, wodurch die Aufrechterhaltung einer konstanten Zelldichte während des gesamten Experiments. Während der Aufzeichnungsschritte ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Bild der endothelialen Schicht ausreichend scharf und klar, präzise Offline-Analyse zu ermöglichen, und dass während des zweiten Schritts des Flow-Assay (post Leukozyten-Bolus), dass genügend Zeit während des Waschpuffer übrig Phase vor der Aufzeichnung wieder aufgenommen wird, um sicherzustellen, dassAlle nicht-adhärenten Leukozyten entfernt werden. Ebenfalls ist es wichtig, Endothelzellen Verwendung in einer Monoschicht von geeigneter Dichte, um den Verlust von Zellen, die mit Strömungsmuster in engen Kapillaren stören können, zu verhindern und auch schwer aus größeren anhaftenden Leukozyten unter Phasenkontrastmikroskopie diskriminiert werden. Wir haben optimale Aussaatdichte für den menschlichen Lebersinus Endothelzellen beschrieben, aber das kann zwischen verschiedenen Populationen und Arten endothelialen variieren. Bedeutende Fortschritte bei der Untersuchung Leukozytenrekrutierung in Tiermodellen mit Intravitalmikroskopie gemacht worden. Der Hauptvorteil der Strömungshafttestverfahren ist, dass Leukozyten-Rekrutierung in einem binären System mit primären humanen Endothelzellen untersucht werden. Darüber hinaus können diese Wechselwirkungen unter physiologischen Ebenen in die Scherbeanspruchung untersucht werden. Es ist wichtig, Ergebnisse der Intravital-Studien an Tieren mit menschlichen Zellsysteme zu bestätigen, da es sein kann differences in Endothelzellen Eigenschaften zwischen den Arten. Eine der Einschränkungen des Flow-Assay ist, dass Leukozytenrekrutierung ist in einem einzelligen Umgebung der endothelialen Monoschicht untersucht. Darüber hinaus, wenn die Leukozyten haben halten und durch das Endothel transmigrierten sie nicht in ausreichender Zahl in den isoliert und nachgelagerten Prozessen unterzogen werden anwesend sein. Trotz dieser Einschränkungen, wenn die Strömungs Adhäsionstest bewältigt wurde sie entwickelt werden können, um eine weitere Analyse der Leukozytenadhäsion Kaskade durchzuführen und geeignet ist, einen multizellulären Umgebung zu rekapitulieren. Längerer Aufnahme von einzelnen Feldern und den Einsatz von Tracking-Software verwendet werden, um kriechen Verhalten der Leukozyten zu analysieren. Ferner nach Beendigung des Flow-Assay kann unter Verwendung der Mikroobjekt konfokalen Laserrastermikroskopie und Immunfluoreszenz-Markierung zur Adhäsion und Trans genauer zu untersuchen abgefragt werden. Zusätzlich entwickeln wir bereits habened ein in vitro-Modell, bei dem fließenden Leukozyten konnte mit Leber Endothel durch die Anwesenheit von Hepatozyten Anlage interagieren. Dieser Test kann auch entwickelt, um Subpopulationen von Leukozyten zu untersuchen: hat unsere Gruppe mit Teilmengen, wie regulatorische T-Zellen, B-Zellen und Leber infiltrieren Leukozyten durchgeführten Studien. Diese Studien belegen, dass die Strömung Haftung Assay ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur allgemeinen und organspezifische Leukozytenrekrutierung in menschlichen Systemen zu studieren.

Es ist nun bekannt, dass Leukozytenrekrutierung im Allgemeinen folgt dem Paradigma der mehrstufigen Kaskadenhaftung ein. Dies beinhaltet die Erfassung von Leukozyten aus Blut fließt durch Endothelzellen der Gefäßwand. Zunächst Leukozyten durchlaufen einen Walzschritt, der durch Selektin-Rezeptoren oder Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie vermittelt wird. Dies ermöglicht G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), das auf der Oberfläche von Leukozyten am Endothel Chemokine Glykokalyx dargestellt aktiviert. Dies führt zur Veränderung der Integrin-Bestätigung zu einem &quot;hohe Affinität&quot; Zustand auf der Oberfläche der Leukozyten und verhaften und feste Adhäsion an das Endothel. Firm Haftung wird dann durch Formänderung und Crawling der Leukozyten an der Gefäß gefolgt. Der letzte Schritt ist durch das Trans endothelialen Monoschicht, die über den parazellulären oder transzellulären Route erfolgen kann. Während der mehrstufigen Kaskadenhaftung beschreibens der allgemeine Mechanismus der Leukozyten-Rekrutierung innerhalb des Körpers gibt es organspezifische Unterschiede. In der Leber der Großteil der Leukozyten-Rekrutierung erfolgt innerhalb der Lebersinuskurven im Gegensatz zu anderen Organen, wo Rekrutierung innerhalb der Post-Venolen 2 tritt in der Regel. Die Lebersinuskurven sind ein niedriger Scher Umwelt und Leukozyten unterziehen eine kurze Tethering Schritt vor, um die Haftung, die Selektin wird unabhängig 2 festigen. Diese Kanäle werden durch die Lebersinus Endothel, die diskontinuierlich und enthält fenestrae, offenen Poren 100-200 nm im Durchmesser gefüttert, und es fehlt eine Basalmembran 3. Die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Leukozyten-Rekrutierung über menschliche Lebersinus Endothel vermitteln könnte organspezifische therapeutische Ziele für entzündliche Lebererkrankungen zu identifizieren. Flow-Adhäsions-Assays sind wesentliche Instrumente bei der Untersuchung Leukozytenrekrutierung. Sie erlauben die Rekonstruktion der Leukozyten recruitment in Gegenwart von Scherbeanspruchung, um die Haftung unter definierten Kräfte zu analysieren. Die häufigste Verwendung für den Test ist die Untersuchung Leukozytenadhäsion zu kultivierten Endothelzellen Monoschichten oder gereinigten Substraten. Im Handel erhältliche Strömungskammern werden verwendet, um Zellen unter Bedingungen einer laminaren Strömung zwischen zwei ebenen Flächen durchströmen und dann visualisieren den dynamischen Prozess der Haftung auf ein Mikroskop 4. Zurück Gruppen haben gezeigt, dass bestimmte adhäsive Wechselwirkungen unter Fluss nur stattfinden, und kann nicht in statischen Tests 5,6 sucht werden. Wir haben diese Technik verwendet, um die Lebersinuskurven zu rekapitulieren und zu studieren Leukozytenrekrutierung unter Bedingungen geringer Scherbeanspruchung. Primäre humane HSEC in Mikroobjekttragerglaschen Leukozyten kultiviert und kann dann über diese Monoschicht bei einer Fließgeschwindigkeit berechnet, um die Scherspannung in Sinusleber reproduzieren perfundiert werden. Die Scherspannung ist eine Spannung, die parallel oder tangential zu einer Oberfläche aufgebracht wird oppauf Normalspannung, die senkrecht osed. Jedes Fluid, das entlang einer Grenze bewegt wird eine Scherbeanspruchung auf dieser Grenze auszuüben. Scherbeanspruchung ist gezeigt worden, eine wesentliche Komponente der Lymphozytentrans 7 sein. Unter diesen Bedingungen wird jeder Schritt des Adhäsionskaskade durch Phasenkontrastmikroskopie visualisiert werden. Dieses Verfahren hat wichtige Einblicke in die Rekrutierung von Leukozyten in der Leber einschließlich der Untersuchung der herkömmlichen Adhäsionsmoleküle 8, die Rolle von Chemokinen und Chemokinrezeptoren 9-11 und atypische Adhäsionsmolekülen wie dem vaskulären Adhäsionsmolekül-1 (VAP-1 erlaubt ) 8,12 und gemeinsame Lymph-und vaskulären endothelialen Rezeptor-1 (CLEVER-1) 13. Während dieser Assay wurde in mehreren Publikationen unserer Gruppe erwähnt wurde, hat seine Beschreibung war kurz und wir haben diese Gelegenheit genutzt, um eine detaillierte Schritt für Schritt Anleitung zur Verfügung stellen, um bei der Fehlersuche helfen und verhindern, dass technische Fehler beim Versuch,ten des Assays. Darüber hinaus haben wir vor kurzem die Beschaffung von Mikroobjektkammern, die genauen Änderungen in der Scherbeanspruchung ermöglicht verändert. Wir glauben, dass dies erweitert die Anwendbarkeit des Assays zu anderen Immunzellen und Endothelzellen. Das folgende Verfahren beschreibt die Herstellung und Verfahren zur Durchführung einer flussbasierten Haft Assay mit menschlichen Lebersinus Endothelzellen und Lymphozyten des peripheren Blutes.

<table><tbody><tr><td>Sechskanal-Mikroschlitten VI 0,4 Durchflusskammer&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>Andere Kanalgrößen und vorbeschichtete Objektträger sind je nach Assay-Anforderungen erhältlich.</td></tr><tr><td>Durchflussadapter&nbsp; Microslide VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80646</td><td></td></tr><tr><td>Durchfluss-Assay-Kammer</td><td>Solent Scientific</td><td>33-3322</td><td>Diese Kammern werden von der Firma speziell für das Modell des Mikroskops und des Zubehörs hergestellt.</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop IX2</td><td>Olympus, UK</td><td>Modell IX50</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Spritzenpumpe</td><td>Harvard Apparatus, UK</td><td>702101</td><td></td></tr><tr><td>Elektronisches Magnetventil</td><td>Lee Products Limited, UK</td><td>Teilenummer LFYA1226032H</td><td></td></tr><tr><td>Silikonschlauch groß</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50855</td><td>2 mm Innendurchmesser, 4 mm Außendurchmesser</td></tr><tr><td>Silikonschlauch - klein</td><td>Fisher Wissenschaftliche</td><td>FB50853</td><td>1 mm Innendurchmesser, 3 mm Außendurchmesser</td></tr><tr><td>Harvard Glasspritze</td><td>Harvard Apparatur, UK</td><td>55-0962</td><td></td></tr><tr><td>Zelltrennmedium/Lympholyt</td><td>VH Bio</td><td>CL-5020</td><td></td></tr><tr><td>Rattenschwanz Kollagen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr></tbody></table>

ein flow-assay zur haftung leukozyten-rekrutierung human lebersinus endothel unter den bedingungen der schubspannung studieren

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leukozyten-Infiltration in menschlichem Lebergewebe ist ein gängiges Verfahren in aller erwachsenen entzündlichen Lebererkrankungen. Chronische Infiltration kann die Entwicklung der Fibrose und die Progression der Zirrhose zu fahren. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die Leukozyten-Rekrutierung in die Leber vermitteln könnten wichtige therapeutische Ziele für Lebererkrankungen zu identifizieren. Der Schlüssel Interaktion während Leukozyten-Rekrutierung ist, dass der Entzündungszellen mit Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung. Recruitment der Leber tritt innerhalb der geringen Scher Kanäle der Lebersinuskurven, die durch Lebersinus Endothelzellen (HSEC) ausgekleidet sind. Die Bedingungen in den Lebersinuskurven können durch Perfusion Leukozyten durch die Kanäle durch menschliche HSEC Monoschichten an bestimmten Flussraten ausgekleidet rekapituliert werden. Unter diesen Bedingungen Leukozyten durchlaufen eine kurze Anbindung Schritt, gefolgt von der Aktivierung und feste Haftung, gefolgt von einem Schritt kriechen und nachfolgende Transmigration durch die endothelialeSchicht. Mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie, kann jeder Schritt dieser &quot;Adhäsionskaskade &#39;visualisiert und aufgezeichnet, gefolgt von Offline-Analyse werden. Endothelzellen und Leukozyten können mit Inhibitoren vorbehandelt, um die Rolle von spezifischen Molekülen während dieses Prozesses zu bestimmen.

Dieser Assay bietet die Möglichkeit, den mehrstufigen Strömungs Adhäsionskaskade visualisieren und Aufklärung der molekularen Mechanismen, durch den Vergleich der Ergebnisse der Kontrollexperimente, um solche mit Molekularinhibitoren. Verschiedene Gefäßbetten kann, indem spezifische Endothelzellen und die Änderung Scherstressbedingungen rekapituliert werden. Jeder Schritt des Adhäsionskaskade können offline durch folgenden Aufzeichnungsverfahrens in dem Protokoll beschrieben analysiert werden. Der erste Schritt des Adhäsionskaskade ist das Rollen der Leukozyten, die als Prozentsatz der gesamten haftenden Zellen exprimiert werden können. Offline-Analyse kann die Anzahl der adhärenten Zellen, die in jedem Bereich aufgezeichnet während der Leukozyten-Bolus aufgezählt werden. Die Wiedergabe des Bildes ermöglicht den Vergleich von Zellen, die fest haftenden und diejenigen, die unterzogen werden eine Rollbewegung durch das Endothel sind. Rollbewegung kann mit dieser Technik dargestellt werden, wird jeder Bereich für mindestens 10 Sekunden aufgezeichnet. Rollende Zellen werden durch ihre reduzierte Geschwindigkeit über die endothelialen Oberfläche im Vergleich zu fließenden Zellen identifiziert. Dieses Verhalten ist für mindestens 5 sec ohne Ablösung nachgewiesen werden. Die Haftung Kaskade innerhalb der Lebersinuskurven erfolgt in einer geringen Scher Umwelt-und in-vivo-Studien haben nur geringen Roll mit einer kurzen Tethering Schritt bestätigt. Wir haben bestätigt, dass die Strömungs Assay spiegelt die Umgebung der hepatischen Sinusoiden durch den Nachweis, dass weniger als 10% der adhärenten Leukozyten anhaltend rollen stimulierte HSEC in diesen Assays. Der nächste Schritt des Adhäsionskaskade ist eine feste Haftung. Insgesamt kann die Einhaltung der zweiten Stufe der Aufzeichnung während des Waschpuffers Bolus (Schritt 7.3) ermittelt werden. Offline-Analyse ermöglicht die Gesamtzahl der fest adhärenten Zellen, die in jedem Bereich (Abbildung 5) gezählt werden. Fest haftenden Zellen werden als Zellen, die stationär oder mit langsamen Kriechen Verhalten shapechanged sind definiert.Die durchschnittliche Anzahl von Zellen pro Feld kann dann berechnet werden. Diese Zahl kann dann verwendet werden, in Verbindung mit der Gesamtoberfläche des Sichtfelds (bestimmt unter Verwendung eines Rasters oder Äquivalent), die Konzentration von Lymphozyten (typischerweise 1 x 10 6 Zellen / ml) und die Durchflussrate, um das Ausmaß auszudrücken Lymphozytenanhaftung als adhärente Zellen / mm 2/10 6 Zellen perfundiert. Studieren Sie das Muster der Haftung umfasst die Analyse der letzten beiden Schritte die Haftung Kaskade einschließlich Formänderungen, Krabbeln und transendotheliale Migration. Leukozyten Anhänger der oberen Fläche der HSEC Monophasen hell erscheinen, während diejenigen, die durch die Monoschicht migriert haben, erscheinen dunkle Phase (Abbildung 6). Die Zellen können dann als &quot;statische&quot; Haftung (nonmigrated / Runde) zeigen &quot;-Form-verändert&quot; Morphologie klassifiziert werden, oder als &quot;migriert&quot; und einzelnen Kategorien werden dann als Prozentsatz der AusdruckGesamthaft Bevölkerung. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Monolayer von primären humanen Lebersinus Endothelzellen in Flusskammer. A) Mikroobjekttragerglaschen mit Medien, die Monoschicht von Endothelzellen vor Beginn der Strömung Adhäsionstest. B) Phasenkontrastbild konfluenten endothelialen Monoschicht gefüllt ist, sollte Endothelzellen in die Mikroobjekt vorbeschichtet wurden ausgesät werden (für den menschlichen Leberendothelzellen sollte dies sein mit Rattenschwanz-Kollagen Typ 1) und es ist wichtig, dass die Endothelzellen sind gesund in Kultur und konfluent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ Files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot; /&gt; 2. Durchflusskammer-Assay. A-Flow-Assay Kammer Set-up ist hier zu sehen, es besteht aus einer transparenten Kammer, die auf einem inversen Mikroskop montiert ist. Eine Heizung in der Kammer platziert und sollte thermostatisch gesteuert werden, um eine Temperatur von 37 ° C zu halten Es sollte Ports zur Verfügung Silikonschlauch von einem Mikroobjektträger innerhalb der Kammer, um eine Spritzenpumpe, die außerhalb angeordnet ist, zu verbinden. Die Mikroobjekt wird direkt auf den Mikroskoptisch gelegt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> 3. Spritzenpumpe. Eine Spritzenpumpe ist zu verbindenüber Silikonschlauch auf die Strömungskammer ed. Die Pumpe auf eine spezifische Entzugsrate in Abhängigkeit von der für den Test erforderlich gewünschte Schubspannung eingestellt ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> 4. Anschlussventil zur Flusskammer. A) Ein elektronisches Magnetventil ermöglicht das Umschalten zwischen zwei Spritzenzylinder, die entweder Zellen oder Medien praktisch ohne Totvolumen. B) Sobald das Ventil gespült wird und die beiden Fässer sind eingerichtet, die Silikonschlauch vom Ventil an die Strömungskammer angeschlossen. Entscheidend ist, dass beim Anschluss des Adapters an der Siliconschlauchleitung mit dem Anschluss an der Strömungskammer befindet sich eine Flüssigkeit / Flüssigkeit-Grenzfläche. &lt;a href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> 5. Messung des Gesamt-Leukozyten-Anhaftung. Während der letzten zwei Minuten des Waschpuffers Bolus Schritt (wie in dem Protokoll beschrieben), sollte ein Minimum von zehn zufälligen Feldern aufgezeichnet. Diese können off-line analysiert werden, und die Gesamtzahl der fest haftenden Zellen können in jedem Bereich gezählt werden. Gesamthaftung von Leukozyten zwischen Steuerkammern und solche mit blockierenden Antikörpern vorbehandelt verglichen werden, hier zeigen wir einen repräsentativen Bereich von einem Steuerschieber und eine Rutsche mit intrazellulären Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1)-blockierenden Antikörper vorbehandelt. Arrows wurden hinzugefügt, um die anhaftenden Leukozyten zu markieren, in der Vertretertive Feld von der Steuerschieber gibt es insgesamt 25 Leukozyten identifiziert und in der ICAM-1-Block Schlitten gibt es insgesamt 13 Leukozyten identifiziert. Maßstabsbalken = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> 6. Analyse des Musters der Leukozytenadhäsion an Endothelzellen-Monoschichten durch Phasenkontrastmikroskopie. Offline-Analyse der aufgezeichneten Felder können auch verwendet werden, um die Richtung und die Geschwindigkeit der Leukozyten-Adhäsion zu untersuchen. Konkrete Schritte des Adhäsionskaskade visualisiert und quantifiziert mittels Phasenkontrastbildgebung werden. Phase hellen Zellen, die fest haftenden, aber nicht aktiviert sind, können &quot;runde&quot; Haftung, die Zellen, die activate sind bezeichnet werdend und Phasen hell kann &#39;Form verändert &quot;bezeichnet werden und die Zellen, die dunkle Phase sind die Zellen, die transendotheliale Migration unterzogen haben und kann bezeichnet werden&quot; migriert &quot;. Das Bild zeigt Beispiele der einzelnen Muster der Haftung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

Leukozyten-Rekrutierung in die Leber tritt innerhalb der spezialisierten Kanäle der Lebersinuskurven, die durch einzigartige hepatischen sinusoidalen Endothelzellen ausgekleidet sind. Phasenkontrast-Mikroskopie von Leukozyten-Rekrutierung über menschliche Lebersinus Endothel unter physiologischen Bedingungen der Schubspannung kann die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die diesen Prozess zugrunde liegen, zu erleichtern.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Mechanismen der Leukozytenrekrutierung über menschliche Leberendothelzellen unter physiologischen Scherstressbedingungen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine konfluente Monoschicht menschlicher hepatischer sinusoidaler Endothelzellen in einem Mikroobjektträger präpariert wird, die anschließend mit entzündlichen Zytokinen stimuliert wird. Der zweite Schritt besteht darin, Lymphozyten aus peripherem Blut zu isolieren.Anschließend wird der Mikroobjektträger mit einem Durchfluss-Testsystem verbunden und mit Lymphozyten unter physiologisch relevanter Scherbelastung perfundiert. Im letzten Schritt werden die Wechselwirkungen der Lymphozyten unter Durchflussbedingungen mittels Phasenkontrastmikroskopie sichtbar gemacht. Letztendlich dienen die Offline-Analysen der während des Durchflussassays aufgenommenen Phasenkontrastbilder zum Vergleich der Wirkung verschiedener Inhibitoren auf die Rekrutierung von Lymphozyten über Leberendothelzellen.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Hepatologie beantworten, beispielsweise, welche Kombinationen von Adhäsionsproteinen und Chemokinrezeptoren für die Rekrutierung unterschiedlicher Immunzellpopulationen über das sinusoidale Endothel in das hepatische Parenchym wichtig sind. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie chronisch entzündlicher Lebererkrankungen, deren Großteil durch die Rekrutierung von Lymphozyten in das Lebergewebe verursacht wird. Das Verständnis der molekularen Mechanismen könnte zu neuen antiinflammatorischen Therapieansätzen führen.Obwohl diese Methode Einblicke in die Rekrutierung entzündungsfördernder Zellen in die menschliche Leber ermöglichen kann, ist sie ebenfalls auf andere Zelltypen anwendbar, wie beispielsweise Endothelzellen, die aus der Nabelvene oder anderen Gefäßbetten isoliert wurden. Zunächst wird eine Arbeitslösung von 200 Mikrogramm pro Milliliter Rattenschwanzkollagen, Typ eins, hergestellt, indem diese aus einer Stammlösung in steriles PBS verdünnt wird.Anschließend injizieren Sie 30 Mikroliter des verdünnten Kollagens in jeden Kanal eines Sechs-Kanal-Mikroschlittens und inkubieren zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Danach bereiten Sie komplettes Medium zu, indem Sie humanes endotheliales Basalmedium mit L-Glutamin, Penicillin und Streptomycin, hitzeinaktiviertem ab, humanem Serum, vasculärem endothelialem Wachstumsfaktor und hepatocytärem Wachstumsfaktor ergänzen. Verwenden Sie dann Trypsin-EDTA, um kultivierte humane hepatische sinusoidale endotheliale Zellen aus einer konfluenten T-75-Flasche zu gewinnen, pelletieren die Zellen, waschen sie in PBS und resuspendieren sie anschließend mit drei mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter in komplettem Medium.Als Nächstes waschen Sie den Mikroschlitten dreimal mit PBS und geben anschließend 30 Mikroliter der Zellsuspension in jeden Kanal des mit Kollagen beschichteten Mikroschlittens. Lassen Sie die Zellen eine Stunde lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und einer Atmosphäre mit 5 % CO2 anhaften. Nachdem die Zellen angeheftet sind, füllen Sie die Anschlussöffnungen auf beiden Seiten jedes Kanals mit komplettem Medium und stellen Sie sie für 24 Stunden zurück in den Inkubator.Nach 24 Stunden ein invertiertes Phasenkontrastmikroskop verwenden, um zu überprüfen, dass das Zellwachstum eine Konfluenz von 80 % erreicht hat. Anschließend die Zytokine zur Zellstimulation vorbereiten, indem 10 Nanogramm pro Milliliter TNF-α und 10 Nanogramm pro Milliliter Interferon-γ zu einem Milliliter komplettem Kulturmedium hinzugefügt werden. Dann 24 Stunden vor der Durchführung des Adhäsionsassays das Zellkulturmedium durch 0,1 Milliliter des zytokinangereicherten Mediums ersetzen, um die Zellen zu stimulieren. Die mononukleäre Fraktion aus Vollblut durch Dichtegradientenzentrifugation über ein geeignetes Zellseparations-Zentrifugationsmedium, wie beispielsweise Lympho Light, über 25 Minuten bei 800 × g reinigen.Überführen Sie danach die mononukleäre Fraktion in ein neues Gefäß und ergänzen Sie mit PBS, das 0,1 % (Volumen pro Volumen) BSA enthält. Zentrifugieren Sie das Gefäß 10 Minuten bei 125 × g, um die Lösung von Thrombozyten zu befreien. Waschen Sie anschließend das Pellet mit PBS, das 0,1 % (Volumen pro Volumen) BSA enthält, und zentrifugieren Sie erneut 10 Minuten bei 800 × g. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter RPMI, das 0,1 % (Volumen pro Volumen) BSA enthält, geben Sie die Zellen in einen mit Gewebekultur behandelten T-75-Flasche und inkubieren Sie eine Stunde lang, um die Adhärenz der Monozyten in der Fraktion zu ermöglichen.Entfernen Sie anschließend vorsichtig das lymphozytenangereicherte Überstand und pelletieren Sie die Zellen bei 800 × g für 10 Minuten. Behandeln Sie dann die isolierten Lymphozyten vorab, indem Sie sie in RPMI-Lösung mit 0,1 % (Volumen pro Volumen) BSA und entweder 200 Nanogramm pro Milliliter pertussis-Toxin-spezifischen funktionsblockierenden Antikörpern oder kleinen molekularen Inhibitoren von Chemokinrezeptoren suspendieren. Inkubieren Sie die Lymphozyten 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in der Inhibitorlösung und pelletieren Sie anschließend die Zellen, um sie dann mit PBS mit 0,1 % (Volumen pro Volumen) BSA zu waschen.Zentrifugieren Sie die Zellen erneut, um sie anschließend in Durchflussmedium mit einer Konzentration von einem Mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter erneut aufzuschwemmen. Heizen Sie eine thermostatisch geregelte, transparente Umgebungskammer auf 37 Grad Celsius vor. Die Kammer sollte Anschlüsse für die Einführung von Silikonschläuchen und eine elektronische Stromversorgung für ein Magnetventil enthalten.Füllen Sie eine 50-Milliliter-Glaspipette mit Luer-Verschluss mit 10 Millilitern steriler destillierter Wasser. Befestigen Sie anschließend ein 25 cm langes Silikonrohr am Pipettenanschluss und setzen Sie die Pipette in eine Pipettenpumpe ein. Stellen Sie die Abzugsgeschwindigkeit der Pumpe gemäß den Anweisungen des Herstellers des Mikroobjektträgers ein, um eine Scherspannung von 0,05 Pascal oder 0,5 Dyn pro Quadratzentimeter aufrechtzuerhalten.Entfernen Sie die Kolben von zwei Fünf-Milliliter-Spritzen und befestigen Sie die Spritzenkörper an den beiden Zulaufhähnen eines elektronischen Magnetventils, indem Sie ein Zentimeter langes Silikonschläuchchen verwenden. Befestigen Sie anschließend ein zwölf Zentimeter langes Silikonschläuchchen am Auslassventil. Füllen Sie pufferhaltige, zellfreie Waschlösung in beide Spritzenhähne ein und spülen Sie das elektronische Magnetventil durch.Stellen Sie sicher, dass Puffer aus einem Behälter durch das Ventil und in die Silikonabflussleitung strömt. Drehen Sie anschließend den Ventilschalter zum anderen Behälter und vergewissern Sie sich, dass weiterhin Puffer fließt. Entfernen Sie alle Luftblasen aus dem System. Danach ersetzen Sie den Waschpuffer in einem der Fässer durch die Lymphozytensuspension, die eine Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter enthält. Verbinden Sie den Silikon-Schlauch der Spritzenpumpe mit einem Anschluss eines gewählten Mikrokanals auf dem Objektträger mithilfe eines Mikro-Objektträger-Adapters. Anschließend verbinden Sie den Silikon-Schlauch des Ablaufventils mit dem gegenüberliegenden Anschluss desselben Mikrokanals auf dem Objektträger, ebenfalls unter Verwendung eines Mikro-Objektträger-Adapters.Befestigen Sie als Nächstes den Mikroobjektträger mit Clips oder Klebeband auf dem Mikroskoptisch, um Bewegungen zu verhindern. Stellen Sie das Mikroskop vor dem Beginn der Perfusion auf das 10×-Objektiv mit der entsprechenden Phaseneinstellung ein. Stellen Sie sicher, dass eine Kamera ordnungsgemäß am Mikroskop angeschlossen ist und bereit ist, Bilder zur Aufzeichnung auf einen Monitor zu übertragen.Stellen Sie sicher, dass die endotheliale Monolayer scharf gestellt ist, und perfundieren Sie mithilfe einer Spritzenpumpe die endotheliale Schicht zwei Minuten lang mit zellfreiem Waschpuffer, indem Sie die Spritzenpumpe starten, um jegliche Rückstände oder ungebundenes Blockierantikörper zu entfernen. Schalten Sie dann das Ventil um, um einen fünfminütigen Bolus an Lymphozytenlösung bei konstantem Wanddruck zuzulassen. Scherstress 0,05 Pascal während der letzten zwei Minuten des Lymphozytenbolus.Notieren Sie 10 zufällige Felder entlang der Länge des Mikroskopschlides für jeweils 10 Sekunden. Jede Bewegung zwischen den Aufnahmen sollte entgegen der Flussrichtung erfolgen. Um die doppelte Aufnahme derselben rollenden Zelle nach dem Lymphozyten-Bolus zu vermeiden, kehren Sie das Ventil in seine Ausgangsposition zurück und schließen Sie einen fünfminütigen Bolus aus zellfreiem Waschpuffer an.Notieren Sie eine zweite Aufnahme von 10 zufällig ausgewählten Feldern, jeweils fünf Sekunden lang. Während der letzten zwei Minuten dieses Bolus können die rollenden Lymphozyten mithilfe dieser Durchflussanalysemethode leicht sichtbar gemacht werden. Rollende Zellen werden anhand ihrer verminderten Geschwindigkeit über der endothelialen Oberfläche im Vergleich zu fließenden Zellen identifiziert.Bei diesem Durchfluss-Assay rollten weniger als 10 % der adhärenten Lymphozyten kontinuierlich über stimulierte endotheliale Zellen, was bestätigt, dass der Durchfluss-Assay das Milieu der Leber sinusoiden widerspiegelt. Die Aufnahme des Waschpuffers wird zur Beurteilung der gesamten Lymphozytenadhärenz herangezogen.Fest haftende Zellen sind Zellen, die ortsfest oder formverändert mit langsamem Kriechverhalten sind. Gezeigt sind hier repräsentative Felder von einer Kontrollprobe und einer mit interzellulärem Adhäsionsmolekül, einem blockierenden Antikörper, vorbehandelten Probe. Das Ausmaß der Lymphozytenadhärenz unter jeder Bedingung wird als haftende Zellen pro Quadratmillimeter pro Millionen perfundierter Zellen angegeben.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden angewendet werden, wie beispielsweise die konfokale Mikroskopie, um zusätzliche Fragen zu beantworten, etwa nach der genauen Ursache der transendothelialen Migration oder nach zytoskelettalen Veränderungen, die während der Rekrutierung unter Scherstress nach der Entwicklung auftreten. Diese Technik ebnete Forschern, die Entzündungen in der Leber oder anderen Organen untersuchen, den Weg, um zu erforschen, wie organspezifische endotheliale Zellpopulationen den Prozess der Leukozytenrekrutierung steuern. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Rekrutierung von Lymphozyten über humane Leberendothelzellen bewertet und Immunzellen in verschiedenen Stadien der Adhäsionskaskade gezählt werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieser Bericht liefert eine visuelle Darstellung der parallelen Platten Flusskammer Analyse für das Studium Leukozyten Endothel-Interaktionen unter physiologischen Schubspannung. Diese Methode ist besonders nützlich für die Untersuchung der Rolle der endothelialen (E)-Selektin und Leukozyten-E-Selektin-Liganden, die Trigger-Leukozyten-Rollen auf Endothelzellen Oberflächen.

Die Analyse der physiologischen E-Selectin-vermittelte Leukozyten-Rolling auf mikrovaskuläre Endothel

Dies ist eine Methode zur Leukozyten-Adhäsion an das Endothel in geerntet Druckbehälter zu visualisieren. Die Technik ermöglicht das Studium vaskulären Haftung unter Scherströmung mit unterschiedlichen intraluminale Drücke bis 200 mmHg damit nachahmen-Ing den pathophysiologischen Bedingungen des hohen Blutdrucks.

Imaging Leukozytenadhäsion an das vaskuläre Endothel bei hohen intraluminalen Druck

Mikrofluidische Strömungskammern durch Photolithographie geätzt und hergestellt von PDMS werden angewendet, um die funktionellen Ergebnisse mit den EG-Dysfunktion und Entzündung zu untersuchen. In einem repräsentativen Experiment, die Fähigkeit der Differential Scherbeanspruchung zu modulieren die Zelladhäsion an Monozyten Cytokin aktiviert EG Monoschichten nachgewiesen wird.

On-Chip-Endothelial Entzündliche Phänotypisierung

Dieses Video zeigt einen auf Laminarströmung basierenden Assay zur Charakterisierung der Interaktion von Leukozyten und zellulären Partnern wie Endothelzellen. Diese Methode liefert dynamische Einblicke in die Adhäsion, Deadhäsion und Transmigration von Leukozyten, wenn sie über eine intakte und konfluente Schicht von Gefäßzellen perfundiert werden.

Ein Laminar-Flow-basierter Assay zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und Endothelzellen

Strömungskammern, die in Adhäsionsexperimenten verwendet werden, bestehen typischerweise aus linearen Strömungswegen und erfordern mehrere Experimente mit unterschiedlichen Durchflussraten, um eine Scherhaftungskarte zu erzeugen.  SynVivo-SMN ermöglicht die Erstellung einer Scheradhäsionskarte mit einem einzigen Experiment unter Verwendung von Mikrolitervolumen, was zu erheblichen Einsparungen bei Zeit und Verbrauchsmaterialien führt.

Erzeugung von Scherhaft Karte Mit SynVivo Synthetische mikrovaskuläre Networks

Verfahren zum Quantifizieren von Adhäsion von Neutrophilen berichtet. Dieses Verfahren erzeugt eine dynamische Fließumgebung ähnlich der in einem Blutgefäß auftreten. Es erlaubt die Untersuchung der Adhäsion von Neutrophilen an entweder gereinigte Adhäsionsmoleküle (Ligand) oder Endothelzell-Substrat (HUVEC) in einem Rahmen ähnlich der in vivo Umgebung mit Scherbeanspruchung.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Hier stellen wir ein Protokoll, das die Ermittler Leukozytenrekrutierung Dynamik ex vivo durch Verbinden einer Kammer mit Endothelzellen stamm Adhäsionsmolekülen auf das Kreislaufsystem der Maus beschichtet beurteilen können. Dieses Verfahren bietet deutliche Vorteile, da es eine Leukozyten-Beurteilung nach relativen biologischen Bedingungen.

Bewertung der Leukozyten-Endothel-Interaktionen unter Strömungsbedingungen in einem Ex vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Dieser Strömungs Adhäsionsassay stellt eine einfache, hochschlag Modell von T-Zell-epithelialen Zell-Wechselwirkungen. Eine Spritzenpumpe wird verwendet, Scherspannung zu erzeugen, und die konfokale Mikroskopie erfasst Bilder für die Quantifizierung. Das Ziel dieser Studien ist es, um effektiv T Zelladhäsion quantifizieren Strömungsbedingungen.

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Leukozyten Interaktion eifrig mit vaskulären Zellen und Blutplättchen nach Schiff Wand Unfall oder während einer Entzündung. Hier beschreiben wir einen unkomplizierten Laminar-Flow-based Assay zur Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und ihre zellulären Partner zugrunde liegen.

Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen

Hier präsentieren wir Ihnen eine integrierte Protokoll, die Monocyte Subpopulation Handel unter in-vitro-Fluss durch Verwendung von spezifischen Oberflächenmarker und konfokale Fluoreszenzmikroskopie misst. Dieses Protokoll kann sequentielle Rekrutierung Schritte sowie zu erkunden, andere Leukozyten-Subtypen mit anderen spezifischen Oberflächenmarker Profil verwendet werden.

Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

Dieses schrittweise Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Versuchsanordnung und Datenanalyse für die Bewertung von Entzündungsreaktionen in HiPSC-ECs und die Analyse der Leukozyten Adhäsion unter physiologischen Fluss.

Mikrofluidische Assay für die Beurteilung der Leukozyten Adhäsion an humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Endothelzellen (HiPSC-ECs)

Erfahren Sie, wie Leukozyten-Rekrutierung über Leberendothelzellen unter Schubspannung untersucht wird. Diese Methode nutzt Phasenkontrastmikroskopie zur Analyse lymphozytärer Adhäsion und liefert Erkenntnisse für antiinflammatorische Therapien bei chronischen Lebererkrankungen.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

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