Imaging Plasmamembran Verformungen Mit pTIRFM

Ziel dieses Verfahrens ist es, zu zeigen, wie die polarisationsbasierte Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie für die Untersuchung des Membranumbaus während der regulierten Exozytose eingesetzt wird. Dies wird erreicht, indem zunächst sichergestellt wird, dass optische Elemente, nämlich die Viertelwellenplatte und die Polarisationswürfel, korrekt positioniert sind, um diskrete p- und s-Anregungspolarisationen zu erzeugen. Der zweite Schritt besteht darin, zu überprüfen, ob die p- und s-Strahlen koline sind, durch die optische Achse des Mikroskops verlaufen und den gleichen Teil des Betrachtungsfeldes beleuchten, wenn es sich um Totalreflexionsfluoreszenz oder TIRF handelt.

Anschließend werden die abzubildenden Zellen mit dem Carbocyanid-Die, dem D gefärbt und mit einem depolarisierenden Reiz stimuliert, um die Exozytose auszulösen. Der letzte Schritt besteht darin, Bilder von fusionierenden Vesikeln mit dichtem Kern aufzunehmen, während sie sich in TIRF befinden. Letztendlich wird P-T-I-R-F verwendet, um Bilder in Echtzeit aufzunehmen und die topologischen Veränderungen der Membran zu überwachen, die sich aus der Exozytose von Chrominzellen ergeben.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Pyrometrie und Membrankapazität besteht darin, dass ptro F eine Membrankrümmung und damit eine direkte Fusionsportdilatation meldet. Der steilste Teil der Lernkurve bei dieser Technik besteht darin, zunächst zu lernen, die Anregungspolarisationen p und s so auszurichten, dass sie sich durch die optische Achse des Mikroskops bewegen und denselben Teil des Bildgebungsfeldes beleuchten. Ein zweites Problem, das häufig auftaucht, betrifft die Zellfärbung, nämlich wie lange Zellen dd ausgesetzt werden sollen und was eine gut gefärbte Zelle im Vergleich zu einer schlecht gefärbten ausmacht.

Das Verfahren wird von TA square row, einem Doktoranden aus unserem Labor, demonstriert. Um mit dem Einschalten aller Mikroskopkomponenten zu beginnen, richten Laser und Computer einen Strahl des 488-Nanometer-Lasers auf die hintere Brennebene des Objektivs mit 1,49 numerischer Apertur. Wenn der Laserstrahl auf die hintere Brennebene fokussiert wird, tritt er aus, sortiert und erscheint als kleiner, genau definierter Punkt an der Decke direkt über dem Objektiv.

Stellen Sie dann den X-Galvanometerspiegel so ein, dass der Laserstrahl aus der Achse bewegt wird und in zunehmend steileren Winkeln zur Objektivnormalen aus dem Objektiv austritt. Überprüfen Sie als Nächstes, ob eine interne Totalreflexion oder TIR erreicht ist. Geben Sie 10 Mikroliter fluoreszierende Mikrosphären zu einem Milliliter Volumen physiologischer Kochsalzlösung und einer Glasbodenschale. Es sollte nur die Fluoreszenz von Mikrosphären auf dem Boden der Schale, die der TIR-Grenzfläche am nächsten liegt, nachgewiesen werden.

Die Detektion von schwebenden Mikrosphären deutet darauf hin, dass der Winkel zwischen dem einfallenden Licht und der objektiven Normalen unzureichend ist. Verwenden Sie für die polarisationsbasierte Bildgebung den ausgerichteten 488-Nanometer-Strahl als Leitfaden und passen Sie die Position des 561-Nanometer-Rohlaserstrahls so an, dass er sich auf einem identischen Strahlengang bewegt. Der 561-Nanometer-Laser wird für die Abbildung des Carbocyanid-Farbstoffs verwendet.

Dem 561-Nanometer-Laser sind eine zerstreuende Linse und Spiegel nachgeschaltet. Stellen Sie den Strahl mit den Einstellknöpfen an den Spiegeln so ein, dass er mit dem 488-Nanometer-Strahl übereinstimmt und der Spot an der Decke scharf ist. Wenn sich die Galvanometerspiegel in der Nullstellung befinden, reflektiert ein Polarisationswürfel die vertikale Komponente des elektrischen Feldes und passiert die horizontale Komponente.

Er wird hinter dem elliptisch polarisierten Strahl auf einem kleinen Translationstisch platziert. Um die anschließende Ausrichtung der Polarisation zu erleichtern, verwenden Strahlengänge einen zweiten Polarisationswürfel und Spiegel, um die Strahlen neu zu kombinieren. Zwischen dem ersten Polarisationswürfel und dem vertikalen Komponentenspiegel wird ein Shutter platziert.

Ein zweiter Shutter wird zwischen dem horizontalen Komponentenspiegel und dem zweiten Polarisationswürfel platziert. Diese Verschlüsse werden von der Bildgebungssoftware gesteuert, so dass der Benutzer schnell zwischen den Strahlpolarisationen wählen kann. Verwenden Sie einen Polarisationsfilter, um die Ausrichtung des elektrischen Feldes in jedem Strahlengang zu überprüfen.

Ein Polarisationsfilter lässt nur eine Übertragung in Übereinstimmung mit der Achse des Filters zu. Stellen Sie sicher, dass die vertikalen und horizontalen Komponenten des Laserstrahls zueinander ausgerichtet sind, und nehmen Sie bei Bedarf Anpassungen am 488-Nanometer-Strahl vor. Die drei Strahlen sollten alle auf die hintere Fokusebene fokussiert sein und vom Objektiv an der gleichen Stelle an der Decke gruppiert austreten.

Dieser Punkt kann mit einem X markiert werden, um die zukünftige Ausrichtung zu erleichtern. Geben Sie als nächstes einen Tropfen Tauchöl auf das Objektiv. Stellen Sie die Schale mit fluoreszierenden Mikrokügelchen auf.

Geben Sie auf dem Objektiv TIR ein, indem Sie den X-Galvanometerspiegel in der Spiegelbewegungssoftware in TIR bewegen. Die vertikale Komponente des Strahls ist die S-Polarisation und die horizontale Komponente des Strahls ist nun das P-Polarisationszentrum, eine Viertelwellenplatte oder qw im Strahlengang. Unmittelbar stromabwärts der Laserblende betrachten Sie jedes polarisierte evaneszente Feld mit einer Stäbchen-Dominanz-Probe, die voraussichtlich zufällig orientiert ist.

Drehen Sie die qw-Platte, um sie an die durchschnittliche Pixelintensität anzupassen. Isolieren Sie gesunde Chrominzellen aus der Nebenniere der Katze, wie im Textprotokoll beschrieben, zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer und bereiten Sie die Transfektion vor, transfizieren Sie Zellen mit DNA, die für das interessierende Protein kodiert, unter Verwendung des Elektroporationssystems gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Die Einstellungen, die das beste Gleichgewicht zwischen Transfektionseffizienz und Zellüberlebensrate bieten.

Für diese Herstellung von bovinen Chrominzellen werden 1.100 Volt, 40 Millisekunden und ein Puls auf Poly de Lycine und Kollagen folgende Transfektionsplattenzellen in einem Milliliter erwärmten Elektro-Parading-Medien behandelt. Stellen Sie die Gerichte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Geben Sie einen Milliliter von zwei x antibiotischen Medien in jede Schüssel Nach sechs Stunden wechseln Sie das Medium am nächsten Tag zu normalen Medien.

Chrominzellen werden in der Regel 48 Stunden bis fünf Tage nach der Elektroporation mit der Bildgebungssoftware des Bildgebungssystems beim Start der Erfassung abgebildet. Stellen Sie sicher, dass die Laser ausgerichtet sind. Überprüfen Sie das evaneszente Feldprofil mit Mikrosphären.

Bereiten Sie das globale und lokale Profusionssystem vor. Reinigen Sie die Lösungsbehälter mit gefiltertem deionisiertem Wasser und füllen Sie sie mit basalen und stimulierenden physiologischen Kochsalzlösungen. Vor der Bildgebung von Chrominzellen wird überprüft, ob die P-Polarisations- und die S-Polarisationsanregung denselben Bereich des Betrachtungsfeldes beleuchten und dass die Beleuchtungsintensitäten ungefähr gleich sind, wie im Textprotokoll beschrieben.

Fahren Sie nun mit der Färbung der bovinen Chromazellen mit DD fort. Spülen Sie das Kulturmedium aus der Schale, die die Chrominzellen enthält, und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter basale physiologische Kochsalzlösung. Geben Sie 10 Mikroliter 10 millimolare DD direkt in die Schale, die die Zellen enthält. Rühren Sie die Schüssel zwei bis 10 Sekunden lang vorsichtig um, bevor Sie die Lösung entfernen.

Waschen Sie das Geschirr drei- bis viermal mit basaler physiologischer Kochsalzlösung, um alle DD-Reste zu entfernen, die Zellen sind nun gefärbt und gebrauchsfertig. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv. Stellen Sie die Schale mit Dai D-gefärbten Chrominzellen auf das Objektiv.

Positionieren Sie die lokale Perfusionsnadel so, dass sie etwa 100 Mikrometer von der Zelle entfernt ist. Fokussieren Sie sich auf die Zellmembran und aktivieren Sie die Autofokus-Hardware unmittelbar vor der Aufnahme von Bildern zur Zellstimulation. Beginnen Sie die Bildaufnahme mit der Perfusion der Zellen für 10 Sekunden mit einer Basallösung und dann für 60 Sekunden mit einer depolarisierenden 56 millimolaren Kaliumchloridlösung.

Erfassen Sie Bilder beim schnellen Umschalten zwischen 561 Nanometer P-Polarisation und 561 Nanometer s-Polarisation, um Änderungen der p- und s-Emissionen von DD und 488 Nanometer-Anregung zu überwachen. Um die transfizierte Vesikelsonde abzubilden, wird nach einer kurzen Inkubation mit Dai D.In diesem Beispiel die Zellmembran gut angefärbt. Eine gesunde adhärente Zelle weist deutliche Unterschiede in den p- und s-Emissionen auf.

Das P-Emissionsbild zeigt einen helleren Zellrand im Vergleich zum Rest der Zelle. Das S-Emissionsbild zeigt eine ungefähr gleichmäßige Fluoreszenz über den gesamten Zell-Fußabdruck, berechnet von Pixel zu Pixel P über S und p plus zwei s. Die Bilder sind empfindlich gegenüber der Membrankrümmung bzw. der Farbstoffkonzentration.

Der CHRO und die gezeigte Zelle wurden ebenfalls mit der Synap OIN von einem Gulden transfiziert, um sekretorische Vesikel zu markieren. Der CHRO und die Zelle werden mit Kaliumchlorid stimuliert, um die Zellmembran zu depolarisieren und die Exozytose auszulösen. Eine Reihe von zu Recht fluoreszierenden Flecken werden plötzlich sichtbar, wenn dichte Kernvesikel verschmelzen.

Ein weißer Kasten ist um ein Fusionsereignis gezeichnet: Um dieses Fusionsereignis Bild für Bild zu analysieren, wurden Bildveränderungen in sit one florin po VS und p plus zwei s Bildintensitäten untersucht. Die Fluoreszenzfluoreszenzintensität von CIT one nimmt schnell ab, wenn das Protein von der Fusionsstelle weg diffundiert. Die Vertiefung, die den fusionierten Vesikel-Plasmamembrankomplex darstellt, nimmt relativ langsamer ab.

Diese Abbildung zeigt eine Interpretation dieser Messungen. Die schnelle und lokalisierte Membranverformung ist das Ergebnis des stimulusevozierten Kalziumeinstroms, die Membrandepolarisation bewirkt einen signifikanten Anstieg der G Camp 5G-Fluoreszenz, was einen Anstieg der subplasmalen Kalziumspiegel bedeutet. Ein Bereich von 30 x 20 Pixeln der Zelle wird ausgewählt und Frame für Frame ändert sich in G camp, 5G, PS und p plus zwei s.

Die Pixelintensitäten werden in den Bildern und Grafiken angezeigt. Mal Null bezeichnet den Rahmen, bevor eine Änderung der PS erkennbar ist. Die weißen Pfeilspitzen zeigen an, dass die Membranverformung mit einer Abnahme der p plus zwei S-Emission einhergeht.

Das zytosolische G CAMP 5G-Protein wird durch das fusionierte Dense-Core-Vesikel aus dem Bereich ausgeschlossen. Beachten Sie auch den plötzlichen Rückgang der 5G-Intensität im G-Lager bei Null. Die lang anhaltende Zunahme des POS und die Abnahme von p plus zwei s deutet auf eine Fusionspore hin, die sich langsam erweitert, wie dargestellt

Hier Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein PTU F-System aufbauen und Zellen abbilden, um topologische Änderungen der Membran im Rasen nach ihrer Entwicklung zu beobachten. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie den Weg, um Veränderungen der Membranform während der Exozytose, der Endozytose, der Zytokinese und der Zellmotilität in lebenden Zellen zu untersuchen.