Extrazelluläre Draht Tetrode Aufnahme im Gehirn frei zu gehen Insekten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, komplexe neuronale Aktivitäten im Gehirn aufzuzeichnen und diese mit den videoaufgezeichneten Verhaltensweisen frei beweglicher Insekten zu synchronisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine flexible Ableitungstetrode aus äußerst feinem Draht hergestellt wird, wobei die Spitze geschliffen, getestet und beschichtet wird, sowie Material zur Markierung ihres Standorts verwendet und der Draht in Polyethylenröhrchen stabilisiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Ableitungstetrode in das Gehirn einzuführen, sie mit Acetat und Wachs zu stabilisieren und eine Zugentlastungsschleife am Kopf zu befestigen.

Anschließend wird die neuronale Aktivität zusammen mit einer Videoaufnahme des lokomotorischen Verhaltens aufgezeichnet. Synchronisieren Sie das Video mit der Aufzeichnung durch einen Synchronisationsimpuls an eine LED und den Verstärker. Der letzte Schritt besteht darin, Kupfer mittels eines kontinuierlichen elektrischen Stroms abzuscheiden und die Färbung mit der Tims-Methode zu verstärken, um die Aufzeichnungsstelle sichtbar zu machen.

Letztlich ermöglichen Methoden zur Sortierung von Mehrfacheinheiten mit hoher Dichte die Identifizierung neuronaler Einheiten, während die Analyse gleichzeitig aufgezeichneter Verhaltensvideos eine feinskalige Korrelation zwischen neuronaler Aktivität und Verhalten erlaubt. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass wir bestehende Verfahren nutzen können, um extrazelluläre neuronale Aktivitäten mit hoher Dichte aus dem Gehirn eines Insekts aufzuzeichnen, während es ein komplexes Verhalten ausführt. Anschließend können wir bestimmen, an welcher Stelle im Gehirn sich die Tet-Elektroden befanden, und dies alles kann vergleichsweise kostengünstig durchgeführt werden.

Mit dieser Technik lassen sich zentrale Fragen der Neuropathologie beantworten, indem die zeitliche Abfolge und Intensität neuronaler Aktivität in bestimmten Hirnregionen mit dem Verhalten eines frei beweglichen Tieres korreliert werden. Diese Methode kann Einblicke in die sensorimotorische Kontrolle gewähren, ist aber auch auf jedes andere Verhalten anwendbar, das ein frei bewegliches Insekt erfordert, wie beispielsweise Lernverhalten, Orientierung oder Navigation. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in diesem Bereich sind, Schwierigkeiten, da die Aufzeichnungselektroden schwer herzustellen sind und deren Platzierung sowie Stabilisierung für die Ableitung äußerst präzise mikrochirurgische Techniken erfordert.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend. Die Herstellung und Implantation der Tero ist schwierig zu erlernen, da sie mit sehr kleinen und empfindlichen Materialien durchgeführt werden, und es ist große Sorgfalt erforderlich, um das Gehirngewebe nicht zu beschädigen. Zum Vorbereiten der Tet-Road-Drahtelektroden werden zwei gezogene Rom-Drahtelektroden in eine motorisierte, rotierende Wickelvorrichtung eingelegt.

Wickeln Sie das Tero zwei Minuten lang in eine Richtung bei 60 Umdrehungen pro Minute auf, anschließend wird es 30 Sekunden lang in die entgegengesetzte Richtung abgewickelt. Danach verwenden Sie eine Heißluftpistole, um die Drähte miteinander zu verbinden, wobei darauf zu achten ist, die Drähte nicht mit der Pistole zu berühren. Führen Sie drei Auf- und Abwärtsbewegungen aus wechselnden Richtungen durch, wobei jede Bewegung etwa 10 Sekunden dauert.

Danach einen Stützschlauch aus einem 30 cm langen Stück Polyethylen-Schlauch anbringen. Die Tetra vorsichtig in den Stützschlauch einfädeln, damit sie sich nicht knickt. Sobald das verschmolzene Ende am anderen Ende des Schlauchs erscheint, wird es so weit durchgezogen, dass an beiden Enden des Führungsschlauchs eine gleich lange Drahtlänge herausragt.

Nun fassen Sie mit der Pinzette das lose Ende jedes Drahtes am Basisflammenbereich eines Gasbrenners auf. Brennen Sie vorsichtig die Isolierung von den letzten zwei oder drei Millimetern jedes Drahtes ab. Erhitzen Sie den Draht, bis er glüht, sich aber nicht aufkrümmt.

Verbinden Sie als Nächstes mit einer Pinzette das Tero mit einem männlichen/weiblichen IC-Sockeladapter, der zur Aufzeichnungsvorrichtung passt. Führen Sie das entisolierte Ende jedes Drahtes in eine separate Buchse des Adapters ein. Fügen Sie eine Messingstift hinzu, um die Drähte an Ort und Stelle zu halten.

Verwenden Sie dann ein feines Lötkolbengeschäft, um die Buchse mit dem geschmolzenen Lot zu füllen. Prüfen Sie anschließend die korrekten elektrischen Verbindungen mit einem Impedanzmessgerät, wie im begleitenden textlichen Protokoll beschrieben. Bilden Sie mithilfe eines separaten unbenutzten Adapters eine kleine Papierform mit Löchern in der Unterseite.

Bei den Nadelpins übertragen Sie den Arbeitsadapter in die Box, sodass sich die Nadelseite unten befindet und die Pins aus der Box herausragen. Befestigen Sie die Box wie in der schriftlichen Anleitung beschrieben mit Klebeband und mischen Sie den Zweikomponentenepoxidharz schnell an. Gießen Sie das Harz in die Box.

Um den Adapter und alle Drähte zu sichern, befestigen Sie das nahe Ende des Führungsrohrs mit Zahnpflege-Wachs an einer Seite der Box, lassen das Rohr jedoch offen, sodass der Tero-Draht an beiden Enden frei durchgezogen werden kann. Nachdem das Epoxidharz ausgehärtet und die Attire-Baugruppe trocken ist, folgt der nächste Schritt: das Anspitzen des Tero. Beginnen Sie damit, die Spitze des Tero mit einer scharfen Skalpellklinge abzuschneiden.

Als Nächstes polieren Sie das Tero mit einem kleinen, vertikal montierten Rotationstool, das mit Schleifscheiben mittlerer und feiner Körnung ausgestattet ist. Stellen Sie das Rotationstool auf eine moderate Drehzahl ein und halten Sie das Bündel nahe seinem Ende fest. Neigen Sie mit einer Pinzette das Drahtsetende in einem Winkel von 45 Grad relativ zur Schleifscheibe.

Es ist entscheidend, dass die Drehrichtung der Schleifscheiben vom flachen Winkel der Drahtenden weg zeigt. Andernfalls kann eine Trennung der Drähte auftreten. Berühren Sie das Bündel vorsichtig für ein bis zwei Sekunden mit der Schleifscheibe mittlerer Körnung und anschließend für weitere ein bis zwei Sekunden mit der feinkörnigen Schleifscheibe.

Wiederholen Sie dies noch dreimal, wobei Sie das Bündel jedes Mal um 90 Grad axial drehen. Überprüfen Sie anschließend mit einem Stereomikroskop, ob das Bündelende eine spitze Spitze aufweist, an der geringe Mengen Isolierung von jedem Drahtende entfernt wurden, und stellen Sie sicher, dass keine Ausfransungen vorliegen. Überprüfen Sie danach erneut die Impedanzen sowohl zwischen den einzelnen Drähten als auch zwischen jedem Draht und der Erdplatte.

Das Tero, indem man die Spitze in eine gesättigte Kupfersulfatlösung bringt. Plattieren Sie den ersten Draht mit einem Strom von 2,5 Mikroampere. Injizieren Sie mithilfe eines Stimulusisolators den Strom für eine Sekunde. Warten Sie eine Sekunde und wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.

Bestücken Sie anschließend die verbleibenden drei Drähte auf die gleiche Weise. Überprüfen Sie erneut die Impedanz. Bringen Sie den Adapter auf der Kopfstufe eines Mehrkanal-Aufnahmesystems an.

Befestigen Sie eine gebogene Insektennadel an einem Mikromanipulator und verbinden Sie das Ende des Tero-Drahts mit der Insektennadel mittels Zahnwachs, nachdem Sie eine Schabe wie im Textprotokoll beschrieben anästhesiert und fixiert haben. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um zwischen der O-Zelle und dem Auge ein kleines Fenster zu schneiden, nachdem Sie die Cuticula entfernt haben. Entfernen Sie mit einer Pinzette Bindegewebe und Fett, um das Gehirn freizulegen. Geben Sie dann Kochsalzlösung für Schaben in die Kopfkapsel, um das Gehirngewebe zu bedecken und das Gehirn zu enthäuten.

Verwenden Sie eine feine Pinzette, um vorsichtig die Hülle über dem Gehirn zu greifen, und nutzen Sie eine weitere feine Pinzette, um die Hülle im Bereich der implantierten Drähte aufzutrennen. Öffnen Sie anschließend mit einer Insektennadel eine kleine Öffnung in der Kopfkapsel vor dem Gehirn. Führen Sie ein Geflecht aus 3 Kupferdrähten mit einem Durchmesser von 56 µm und Isolierung in die Öffnung ein.

Um als Referenz-Masselektrode zu dienen, senken Sie die Spitze des Tetrodes mit dem Mikromanipulator bis zur Gehirnoberfläche ab und positionieren Sie sie nahe dem Gehirn. Interessengebiet. Plazieren Sie vorsichtig zwei kleine Stücke einer zwei bei einem Millimeter großen dünnen Acetatfolie, die etwas größer als die Öffnung in der Kopfkapsel sind, anterior und posterior zum Tede.

Senken Sie den Tetrode langsam um 150 bis 250 Mikrometer unter die Gehirnoberfläche ab, während Sie die Aufnahmequalität überwachen. Achten Sie auf spontane extrazelluläre Spikes mittlerer bis großer Amplitude, um sowohl einen interessierenden Bereich als auch die allgemeine Lebensfähigkeit des neuronalen Gewebes anzuzeigen. Sobald Sie mit der Position des Tetroden zufrieden sind, bringen Sie die beiden Acetatfolienstücke so nah wie möglich an den Tetroden heran, ohne ihn zu berühren.

Es ist sehr wichtig, während der Dissektion und Implantation äußerst vorsichtig zu sein, um die Drähte nicht zu beschädigen. Verwenden Sie einen kleinen Spatel, der durch Abflachen der Spitze einer Hohlnadel hergestellt wurde, und erhitzen Sie den Spatel mit einem Alkoholbrenner. Tauchen Sie anschließend den Spatel in Zahnwachs, sodass sich flüssiges Wachs an der Spitze des Spatels befindet.

Das flüssige Wachs vorsichtig an ein Ende eines Acetatblatts anlegen, das am weitesten vom Tero entfernt ist, wobei das flüssige Wachs den Spalt zwischen dem Acetatblatt und der Kopfkutikula verschließt. Die Spatel weiterhin erhitzen und jeweils eine kleine Menge flüssigen Wachses auf das Acetatblatt tropfen. Allmählich in Richtung des Tero vorgehen und diesen schließlich mit einer kleinen Menge Zahnwachs verankern.

Vermeiden Sie es, heißes Wachs in den Hohlraum und auf das Gehirn zu bekommen. Befestigen Sie als Nächstes die Referenzelektrode auf ähnliche Weise mit Wachs. Erhitzen Sie nun das Wachs, das den Tero am Mikromanipulator befestigt, um den Tero davon zu lösen.

Schleifen Sie dann das Tero in das Wachs am Kopf ein, um eine Zugentlastung zu gewährleisten, und bedecken Sie die Zugentlastungsschleife mit Wachs. Entfernen Sie zu diesem Zeitpunkt vorsichtig die Haltevorrichtungen und übertragen Sie das Präparat auf eine Petrischale, die auf Eis steht. Fixieren Sie das Präparat mit der dorsalen Seite nach oben mithilfe großer Sattelstifte. Befestigen Sie mit einer Klebepistole einen Holzstab, sodass dieser vom Pronotum über den Hinterleib reicht.

Befestigen Sie anschließend die Spitze der Tero-Sonde mit Zahnwachs am hinteren Ende des Stabs. Anschließend befestigen Sie die Tero-Sonde und die Referenzelektrode mit Zahnwachs am vorderen Ende des Stabs. Ziehen Sie danach die Tero-Sonde so weit wie möglich vom Stecksockelende des Schlauchs weg, ziehen Sie jedoch nicht daran.

Befestigen Sie es mit Wachs am Adapter, um die Gefahr auszuschließen, dass das Tier den freiliegenden Teil des Tero beschädigt. Nach dem Entfernen aller Einschränkungen befestigen Sie die Referenzelektrode mit Zahnarztwachs am Tero-Schlauch. Stellen Sie wie im Textprotokoll beschrieben eine gute neuronale und videobasierte Aufzeichnung sicher, bevor Sie mit den Verhaltensversuchen beginnen. Für Gangexperimente lassen Sie die Schabe eine Plexiglas-Arena erkunden; für Kletterexperimente entsprechend ebenfalls.

Verwenden Sie eine lange, schmale Versuchsanlage mit entweder einer Ablage, die das Tier überklettern oder unterkriechen muss, oder einem Plexiglasblock, den das Tier erklimmen kann. Erzeugen Sie beim Aufzeichnen einen TTL-Impuls vom Computer aus mithilfe eines angepassten MATLAB-Befehls. Der TTL-Impuls erzeugt eine Zeitmarke für das Aufzeichnungssystem und schaltet entweder das LED-Licht für Stimulationsversuche ein oder aus.

Stromimpulsfolgen zwischen den Aufnahmedrähten können verwendet werden, um ein Verhalten auszulösen, nachdem das Experiment abgeschlossen ist, nachdem fünf Sekunden lang ein Gleichstrom von fünf Mikroampere durch eine der Drahtspitzen und die Referenzelektrode geleitet wurde, um Kupfer im Gehirn abzulagern. Um die Position der Drahtspitze zu markieren, sind hier Rohspannungssignale von einzelnen Elektroden innerhalb eines Tero-Bündels dargestellt. Achten Sie auf die Unterschiede der Spannungssignale zwischen den verschiedenen Elektroden.

Drei Einheiten wurden mithilfe von MLUs sortiert. Hier ist eine dreidimensionale Ansicht der Wellenformenergie, wie sie an drei der vier Elektroden aufgezeichnet wurde, jeweils dargestellt. Jeder einzelne Schwellenwertereignis ist farbkodiert nach dem Cluster, dem es letztendlich zugeordnet wurde.

Diese Momentaufnahme stammt aus einem Video eines Kletterversuchs. Über jedem Bildfeld sind die normalisierte Geschwindigkeit, die Höhe des Käfers und die momentane Feuerrate zweier sortierter Einheiten von der ersten bis zur aktuellen Bildschirmseite dargestellt. Null markiert den Beginn des Kletterns. Die Feuerrate wurde von null bis eins normalisiert, Geschwindigkeit und Höhe zur Anzeige von null bis 0,5. Die Markierungen unterhalb jedes Bildfelds zeigen die Spikes der beiden sortierten Einheiten innerhalb einer Sekunde um das aktuelle Bildfeld an. Die orangefarbene Linie kennzeichnet die zeitliche Ausdehnung jedes Bildfelds, und das blaue Rechteck zeigt die doppelte Breite des Kerns an, der zur Berechnung der momentanen Feuerrate für das aktuelle Bildfeld verwendet wurde.

Diese Aufnahme wurde im rechten fächerförmigen Körper aufgezeichnet. Die Feuerrate der Einheit eins eins stieg während des Kletterns an, und der Anstieg der Feuerrate ging dem Geschwindigkeitsanstieg voraus. Einheit eins zwei war vor dem Klettern stumm, begann jedoch zu feuern, nachdem das Klettern eingeleitet wurde.

In dieser Momentaufnahme aus dem Arena-Erkundungstest zeigt die rote ovale Linie die Form der Schabe in diesem Bildausschnitt und die rote gestrichelte Linie die Position des Massenschwerpunkts der Schabe in den vorherigen 10 Bildern an. Die Dreh- und Vorwärtslaufgeschwindigkeit sowie die momentane Feuerrate der Einheit zwei eins werden hier dargestellt. Die Spikes der Einheit zwei, eins innerhalb von vier Sekunden des aktuellen Bildes sind unterhalb des Bildes dargestellt.

Wie zuvor zeigt die orangefarbene Linie den durch jeden Frame abgedeckten Zeitraum an, und das blaue Rechteck zeigt die doppelte Breite des Kerns an, der zur Berechnung der momentanen Feuerrate des aktuellen Frames verwendet wurde. Diese Aufnahme wurde in der mittleren Fan-Struktur durchgeführt. Die Position der Schabe und ihre Körperorientierung in jedem Frame wurden mithilfe einer Tracking-Software extrahiert, wie im Textprotokoll beschrieben, und zur Berechnung der Vorwärts- und Richtungsgeschwindigkeit sowie der momentanen Feuerrate verwendet.

Die Feuerrate der Einheit zwei eins stieg an, wenn die Schabe mit dem Gehen begann, und korrelierte mit der Gehgeschwindigkeit. Bei vielen Einheiten des zentralen Komplexes war die erhöhte Feuerrate auf bestimmte Bewegungszustände beschränkt. Beispielsweise war die Einheit zwei, eins auf Vorwärtsgehen eingestellt, unabhängig von der Drehgeschwindigkeit.

Die Bahnkurve der Schabe im Video ist hier dargestellt. Der große schwarze Punkt markiert den Startpunkt der Schabe, und jeder kleine schwarze Punkt zeigt die Position der Schabe in jedem Einzelbild an. Die Bahnkurve wurde farbkodiert, um die momentane Feuerrate der Einheit zwei wiederzugeben, wobei von Blau für eine niedrige bis Rot für eine hohe Feuerrate skaliert wurde.

In dieser Feuerratenkarte der Einheit zwei eins zeigt die X-Achse die Drehgeschwindigkeit und die Y-Achse die Vorwärtsgehgeschwindigkeit. Positive Drehgeschwindigkeit bedeutet Rechtsdrehung, negative Drehgeschwindigkeit bedeutet Linksdrehung. Die Positionierung der Elektrode wird anhand sichtbarer Kupferablagerungen nach dem histologischen Verfahren bestimmt, wie im Text beschrieben.

Alternativ kann die Elektrode mit einem fluoreszierenden Farbstoff beschichtet und mittels konfokaler Mikroskopie lokalisiert werden. Dies ist ein komplexes Verfahren, das selbst bei Beherrschung insgesamt viele Stunden in Anspruch nimmt; es empfiehlt sich daher, die einzelnen Schritte in Teilschritte zu unterteilen, mehrere Teros herzustellen und zu testen, bevor man ein Implantationsexperiment beginnt.

Es ist wichtig, daran zu denken, einen Tero vor der Verwendung auf ordnungsgemäße Inter-Wire- und individuelle Impedanz zu prüfen und äußerste Vorsicht walten zu lassen beim Implantieren sowie bei der Sicherung der Schwellenwerte im Gehirn. Methoden wie die automatisierte Echtzeit-Verfolgung können integriert werden, um den Analyseprozess zu vereinfachen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Teros herstellt und implantiert, um physiologische Aktivität mit dem komplexen Verhalten eines frei beweglichen Insekts zu koordinieren.