Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Protein aus menschlichem und mausartigem Gehirngewebe für die Proteomik-Analyse zu extrahieren. Dies wird durch die Verwendung eines gemeinsamen Lysepuffers erreicht, um die gleiche Proteinextraktion zu erhalten, die für zweidimensionale Elektrophoreseansätze geeignet ist. Als nächstes wird die zweidimensionale Fluoreszenzdifferenz-Gelelektrophorese verwendet, um Proteine für die massenspektrometrische Identifizierung zu trennen.

Es folgt eine miniaturisierte 2D-Gelelektrophorese mit Immunblotting, um posttranslationale Modifikationen zu identifizieren. Die Ergebnisse können eine globale Proteinexpression zeigen. Die Wirtstranslationen verändern alle Ligamentisierungs- und katalytischen Produkte basierend auf den Unterschieden im isoelektrischen Punkt und Molekulargewicht.

Die Kombination von 2D-Dash und 2D-Monolo kann uns helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neuroproteomik zu beantworten, indem sie gleichzeitig Informationen über Expressionsveränderungen liefert. Postmodifikation und Katabolismus in Produkten Beginnen Sie mit der Entnahme und Homogenisierung des Hirngewebes. Bereiten Sie das Gewebe mit 10 % Gewicht zu Volumen in einem Extraktionspuffer für menschliches Hirngewebe vor.

Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem Glaspipetter, verwenden Sie jedoch einen Teflon-Homogenisator für Nagetiergewebe, um beide Homogenate aufzulösen. Beschallen Sie es bei 60 Hertz mit 30 Halbsekundenpulsen. Bestimmen Sie anschließend die Proteinkonzentration mit einem Bradford-Assay unter Verwendung von BSA als Standard.

Sammeln Sie nun die Lösungen für die Chloroform-Methanol-Fällung in einem Eiskübel. Planen Sie, etwa 125 Mikrogramm für 11 Zentimeter IPG-Streifen oder etwa 1,25 Milligramm für 18 Zentimeter große IPG-Streifen zu sammeln. Sobald die Lösungen bei vier Grad Celsius sind, führen Sie die Fällung vollständig auf Eis durch.

Zuerst fügen Sie drei Volumen Methanol hinzu, dann ein Volumen Chloroform. Schütteln Sie diese Mischung. Fügen Sie als nächstes drei Volumina kaltes Wasser hinzu.

Vortex, diese Mischung für eine Minute zentrifugieren Sie das Probenröhrchen bei 12.000 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn. Fügen Sie dann drei Volumina Methanol-Wirbel hinzu und schleudern Sie die Proteine auf die gleiche Weise herunter.

Trocknen Sie das gesammelte Proteinpellet unter Stickstoffgas vor 2D DIGE. Suspendieren Sie das Protein erneut in 2D-Puffer bei 2,5 Milligramm pro Milliliter. Anschließend werden die Proben wie zuvor beschallt, bis sie verwendet werden.

Lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bevor Sie mit diesem Schritt beginnen und nach der Proteinfällung. Es ist notwendig, die Proteinkonzentration erneut mit dem Bradford-Assay zu bestimmen. Befolgen Sie das gleiche Verfahren wie zuvor gezeigt vor der Psy-Farbstoffmarkierung.

Zu diesem Zweck wird die Qualität der Proteinprobe auf der SDS-Seite überprüft. Verdünnen Sie 15 Mikrogramm Protein in LDS und erhitzen Sie es auf 37 Grad Celsius in einem Wärmebad oder Block. Lassen Sie sie dann auf ein Polyacrylamid-Gel laufen und färben Sie das Gel mindestens eine Stunde lang mit Kumasi-Blau-Lösung.

Dann das Gel über Nacht in 7%iger Essigsäure- und 10%iger Ethanollösung aufbewahren. Sobald die Qualität der Proteinprobe festgestellt ist, wird am nächsten Tag mit dem SD-Markierungsverfahren begonnen. Messen Sie zunächst den pH-Wert des Lysats, der basisch bis neutral sein sollte.

Der optimale pH-Wert liegt bei 8,6 für nachfolgende Reaktionen. Richten Sie als Nächstes die Farbstoffkonjugationsreaktionen für jede Proteinprobe ein. Mischen Sie 50 Mikrogramm mit 400 Picomole des Farbstoffs S3 und 50 Mikrogramm mit 400 Picomole des Farbstoffs S fünf.

Führen Sie dies im Quadruplex für insgesamt acht D-Kupplungsreaktionen pro Probe durch. Führen Sie für jede getestete Probe einen komplementären Satz von DI-Kupplungsreaktionen mit Protein aus der Kontrolle, z. B. aus einem erkrankten Gehirn, durch. Dann richten Sie für jedes Reaktionspaar eine interne Kontrollreaktion mit 400 Pikosolen CY zwei und einer gleichmäßigen Darstellung aller Proteine von insgesamt 250 Mikrogramm ein.

Die SAI-Markierung wird erreicht, indem alle Reaktionsgemische eine Stunde lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubiert werden. Kombinieren Sie nach der Inkubation alle Sätze von drei verschiedenen Cyan-Reaktionen in einem Volumen von 150 Mikrolitern für jeden Reaktionssatz bei 200 Mikrolitern 2D-Puffer. Fahren Sie dann mit den Schritten der 2D-Elektrophorese fort.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung unmarkierter Proteinlösungen für das präparative Gel, aus dem Proteinflecken für jede Probe und für die Positivkontrolle herausgeschnitten werden. Aliquotieren Sie 300 bis 350 Mikrogramm unmarkiertes Protein in 2D-Puffer und lassen Sie sie in Kontakt mit dem IPG-Streifen rehydrieren. Nach dem Laden überführen die IPG-Streifen das markierte und das unmarkierte Protein in eine Rehydratation.

Nun gut, dann jede Vertiefung mit einem IPG-Reaktionsstreifen abdecken. Anschließend mit Mineralöl überzogen und die Streifen über Nacht bei maximal 25 Grad Celsius passiv passiv mit der Proteinlösung rehydrieren lassen. Führen Sie am nächsten Tag eine isoelektrische Fokussierung der IPG-Streifen durch.

Entfernen Sie dann das Öl und lagern Sie die IPG-Streifen bei minus 20 Grad Celsius, um die IPG-Streifen auszugleichen. Tauchen Sie sie 15 Minuten lang in einen Gleichgewichtspuffer. Übertragen Sie dann die Streifen in 4,7%iges IDO-Acetamid in Äquilibrierungspuffer, das beim Baden der Streifen kein DVB-t enthält.

Verwenden Sie ein großes 2D-Gelsystem, um vier 12%SDS-Seitengele pro Probe in Glasplatten mit niedriger Fluoreszenz für die markierten Proteine zu gießen. Gießen Sie außerdem für jedes der unmarkierten Proteine ein 12%iges SDS-Seitengel in 1,5 Millimeter dicke Standardglasplatten. Dies sind die präparativen Gele.

Wenn die Gele abgekühlt sind, übertragen Sie die Streifen auf die Oberseite der Gele und überlagern Sie die Streifen mit 0,5%Aros Sobald sie abgekühlt sind, lassen Sie die Gele über Nacht bei 2,5 Watt bei vier Grad Celsius laufen und analysieren Sie sie am nächsten Tag. Viele 2D-Reaktionen können mit Proteinproben durchgeführt werden, die für die präparativen Gele verwendet werden. Messen Sie weniger als 100 Mikrogramm Probe in 200 Mikroliter 2D-Puffer.

Anschließend die Probenmischungen kräftig durchwirbeln und kurz schleudern. Laden Sie die Proben auf 11 Zentimeter große IPG-Streifen und lassen Sie sie am nächsten Tag über Nacht mit Mineralöl bedeckt passiv rehydrieren. Führen Sie die isoelektrische Fokussierung durch.

Bewegen Sie dann die Streifen 15 Minuten lang pro Bad durch drei Bäder mit Äquilibrierungspuffer. Die Streifen werden dann auf 2D-SDS-Seitengelen ausgeführt. Schichten Sie jeden Streifen auf ein vorgefertigtes Gel mit dem entsprechenden Molekulargewicht.

Polyacrylamid für das Protein von Interesse. Übertragen Sie die Gele später auf die NITROCELLULOSE PVDF-Membran und analysieren Sie sie mit Antikörpern bei der Entwicklung dieses Protokolls. Drei verschiedene Lyseformen.

Getestet wurden Puffer. Erstens, ein gemeinsamer biochemischer und molekularbiologischer Puffer. Tris SDS wurde getestet.

Tris SDS hatte eine schlechte Auflösung im Vergleich zu einem anderen getesteten Puffer UTS. Der dritte zu de-Puffer wurde ausgeschlossen, da damit keine prüfbaren Proben hergestellt werden konnten. Als nächstes wurden Proteome des Gehirns von Menschen und Mäusen untersucht.

Es wurden Proben aus dem menschlichen Kontrollkortex und Ad-Cortex-Proben verglichen. Gehirnproteine von Mäusen mit Alzheimer-ähnlicher Tau-Pathologie wurden ebenfalls aus der menschlichen Probe betrachtet. SCI zwei wurde unabhängig voneinander betrachtet, ebenso wie S, SI drei und sci fünf für jedes D. Die hohe Punktauflösung erleichterte die Ausrichtung.

Qualitative Mini-2D-Analysen wurden verwendet, um posttranslationale Modifikationen zu untersuchen, und es wurde festgestellt, dass ein Ligamentisierungs-Alpha-Synuclein im AD-Gewebe ein normales Profil aufweist, aber auch als Dimer mit einem Sternchen gekennzeichnet ist. Pfeile markieren, wo Alpha-Synuclein gefunden wurde. Das ubiquitinierte Amyloid-Vorläuferprotein wurde ebenfalls von mini 2D untersucht.

Sporadische Werbung wurde mit familiärer Werbung verglichen. In der familiären ad Beta-Amyloid-Varianz sind die Konzentrationen von eins bis 42 und ISO-Varianz geringer, da Ligaformen bei acht Kilodalton gefunden wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Proteom untersucht, um komplexe Proben durch Messung von Proteinexpressionsmodifikationen zu vergleichen.