Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting
April 10th, 2014
Eine gemeinsame Proteinextraktionsprotokoll unter Verwendung von Harnstoff / Thioharnstoff / SDS Puffer für Mensch und Maus Hirngewebe ermöglicht indentification von Proteinen mittels 2D-DIGE und ihre anschließende Charakterisierung von Mini 2DE Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht es, mehr reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse aus menschlichen Biopsien und experimentellen Modellen zu erhalten.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Protein aus menschlichem und mausartigem Gehirngewebe für die Proteomik-Analyse zu extrahieren. Dies wird durch die Verwendung eines gemeinsamen Lysepuffers erreicht, um die gleiche Proteinextraktion zu erhalten, die für zweidimensionale Elektrophoreseansätze geeignet ist. Als nächstes wird die zweidimensionale Fluoreszenzdifferenz-Gelelektrophorese verwendet, um Proteine für die massenspektrometrische Identifizierung zu trennen.
Es folgt eine miniaturisierte 2D-Gelelektrophorese mit Immunblotting, um posttranslationale Modifikationen zu identifizieren. Die Ergebnisse können eine globale Proteinexpression zeigen. Die Wirtstranslationen verändern alle Ligamentisierungs- und katalytischen Produkte basierend auf den Unterschieden im isoelektrischen Punkt und Molekulargewicht.
Die Kombination von 2D-Dash und 2D-Monolo kann uns helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neuroproteomik zu beantworten, indem sie gleichzeitig Informationen über Expressionsveränderungen liefert. Postmodifikation und Katabolismus in Produkten Beginnen Sie mit der Entnahme und Homogenisierung des Hirngewebes. Bereiten Sie das Gewebe mit 10 % Gewicht zu Volumen in einem Extraktionspuffer für menschliches Hirngewebe vor.
Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem Glaspipetter, verwenden Sie jedoch einen Teflon-Homogenisator für Nagetiergewebe, um beide Homogenate aufzulösen. Beschallen Sie es bei 60 Hertz mit 30 Halbsekundenpulsen. Bestimmen Sie anschließend die Proteinkonzentration mit einem Bradford-Assay unter Verwendung von BSA als Standard.
Sammeln Sie nun die Lösungen für die Chloroform-Methanol-Fällung in einem Eiskübel. Planen Sie, etwa 125 Mikrogramm für 11 Zentimeter IPG-Streifen oder etwa 1,25 Milligramm für 18 Zentimeter große IPG-Streifen zu sammeln. Sobald die Lösungen bei vier Grad Celsius sind, führen Sie die Fällung vollständig auf Eis durch.
Zuerst fügen Sie drei Volumen Methanol hinzu, dann ein Volumen Chloroform. Schütteln Sie diese Mischung. Fügen Sie als nächstes drei Volumina kaltes Wasser hinzu.
Vortex, diese Mischung für eine Minute zentrifugieren Sie das Probenröhrchen bei 12.000 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn. Fügen Sie dann drei Volumina Methanol-Wirbel hinzu und schleudern Sie die Proteine auf die gleiche Weise herunter.
Trocknen Sie das gesammelte Proteinpellet unter Stickstoffgas vor 2D DIGE. Suspendieren Sie das Protein erneut in 2D-Puffer bei 2,5 Milligramm pro Milliliter. Anschließend werden die Proben wie zuvor beschallt, bis sie verwendet werden.
Lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bevor Sie mit diesem Schritt beginnen und nach der Proteinfällung. Es ist notwendig, die Proteinkonzentration erneut mit dem Bradford-Assay zu bestimmen. Befolgen Sie das gleiche Verfahren wie zuvor gezeigt vor der Psy-Farbstoffmarkierung.
Zu diesem Zweck wird die Qualität der Proteinprobe auf der SDS-Seite überprüft. Verdünnen Sie 15 Mikrogramm Protein in LDS und erhitzen Sie es auf 37 Grad Celsius in einem Wärmebad oder Block. Lassen Sie sie dann auf ein Polyacrylamid-Gel laufen und färben Sie das Gel mindestens eine Stunde lang mit Kumasi-Blau-Lösung.
Dann das Gel über Nacht in 7%iger Essigsäure- und 10%iger Ethanollösung aufbewahren. Sobald die Qualität der Proteinprobe festgestellt ist, wird am nächsten Tag mit dem SD-Markierungsverfahren begonnen. Messen Sie zunächst den pH-Wert des Lysats, der basisch bis neutral sein sollte.
Der optimale pH-Wert liegt bei 8,6 für nachfolgende Reaktionen. Richten Sie als Nächstes die Farbstoffkonjugationsreaktionen für jede Proteinprobe ein. Mischen Sie 50 Mikrogramm mit 400 Picomole des Farbstoffs S3 und 50 Mikrogramm mit 400 Picomole des Farbstoffs S fünf.
Führen Sie dies im Quadruplex für insgesamt acht D-Kupplungsreaktionen pro Probe durch. Führen Sie für jede getestete Probe einen komplementären Satz von DI-Kupplungsreaktionen mit Protein aus der Kontrolle, z. B. aus einem erkrankten Gehirn, durch. Dann richten Sie für jedes Reaktionspaar eine interne Kontrollreaktion mit 400 Pikosolen CY zwei und einer gleichmäßigen Darstellung aller Proteine von insgesamt 250 Mikrogramm ein.
Die SAI-Markierung wird erreicht, indem alle Reaktionsgemische eine Stunde lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubiert werden. Kombinieren Sie nach der Inkubation alle Sätze von drei verschiedenen Cyan-Reaktionen in einem Volumen von 150 Mikrolitern für jeden Reaktionssatz bei 200 Mikrolitern 2D-Puffer. Fahren Sie dann mit den Schritten der 2D-Elektrophorese fort.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung unmarkierter Proteinlösungen für das präparative Gel, aus dem Proteinflecken für jede Probe und für die Positivkontrolle herausgeschnitten werden. Aliquotieren Sie 300 bis 350 Mikrogramm unmarkiertes Protein in 2D-Puffer und lassen Sie sie in Kontakt mit dem IPG-Streifen rehydrieren. Nach dem Laden überführen die IPG-Streifen das markierte und das unmarkierte Protein in eine Rehydratation.
Nun gut, dann jede Vertiefung mit einem IPG-Reaktionsstreifen abdecken. Anschließend mit Mineralöl überzogen und die Streifen über Nacht bei maximal 25 Grad Celsius passiv passiv mit der Proteinlösung rehydrieren lassen. Führen Sie am nächsten Tag eine isoelektrische Fokussierung der IPG-Streifen durch.
Entfernen Sie dann das Öl und lagern Sie die IPG-Streifen bei minus 20 Grad Celsius, um die IPG-Streifen auszugleichen. Tauchen Sie sie 15 Minuten lang in einen Gleichgewichtspuffer. Übertragen Sie dann die Streifen in 4,7%iges IDO-Acetamid in Äquilibrierungspuffer, das beim Baden der Streifen kein DVB-t enthält.
Verwenden Sie ein großes 2D-Gelsystem, um vier 12%SDS-Seitengele pro Probe in Glasplatten mit niedriger Fluoreszenz für die markierten Proteine zu gießen. Gießen Sie außerdem für jedes der unmarkierten Proteine ein 12%iges SDS-Seitengel in 1,5 Millimeter dicke Standardglasplatten. Dies sind die präparativen Gele.
Wenn die Gele abgekühlt sind, übertragen Sie die Streifen auf die Oberseite der Gele und überlagern Sie die Streifen mit 0,5%Aros Sobald sie abgekühlt sind, lassen Sie die Gele über Nacht bei 2,5 Watt bei vier Grad Celsius laufen und analysieren Sie sie am nächsten Tag. Viele 2D-Reaktionen können mit Proteinproben durchgeführt werden, die für die präparativen Gele verwendet werden. Messen Sie weniger als 100 Mikrogramm Probe in 200 Mikroliter 2D-Puffer.
Anschließend die Probenmischungen kräftig durchwirbeln und kurz schleudern. Laden Sie die Proben auf 11 Zentimeter große IPG-Streifen und lassen Sie sie am nächsten Tag über Nacht mit Mineralöl bedeckt passiv rehydrieren. Führen Sie die isoelektrische Fokussierung durch.
Bewegen Sie dann die Streifen 15 Minuten lang pro Bad durch drei Bäder mit Äquilibrierungspuffer. Die Streifen werden dann auf 2D-SDS-Seitengelen ausgeführt. Schichten Sie jeden Streifen auf ein vorgefertigtes Gel mit dem entsprechenden Molekulargewicht.
Polyacrylamid für das Protein von Interesse. Übertragen Sie die Gele später auf die NITROCELLULOSE PVDF-Membran und analysieren Sie sie mit Antikörpern bei der Entwicklung dieses Protokolls. Drei verschiedene Lyseformen.
Getestet wurden Puffer. Erstens, ein gemeinsamer biochemischer und molekularbiologischer Puffer. Tris SDS wurde getestet.
Tris SDS hatte eine schlechte Auflösung im Vergleich zu einem anderen getesteten Puffer UTS. Der dritte zu de-Puffer wurde ausgeschlossen, da damit keine prüfbaren Proben hergestellt werden konnten. Als nächstes wurden Proteome des Gehirns von Menschen und Mäusen untersucht.
Es wurden Proben aus dem menschlichen Kontrollkortex und Ad-Cortex-Proben verglichen. Gehirnproteine von Mäusen mit Alzheimer-ähnlicher Tau-Pathologie wurden ebenfalls aus der menschlichen Probe betrachtet. SCI zwei wurde unabhängig voneinander betrachtet, ebenso wie S, SI drei und sci fünf für jedes D. Die hohe Punktauflösung erleichterte die Ausrichtung.
Qualitative Mini-2D-Analysen wurden verwendet, um posttranslationale Modifikationen zu untersuchen, und es wurde festgestellt, dass ein Ligamentisierungs-Alpha-Synuclein im AD-Gewebe ein normales Profil aufweist, aber auch als Dimer mit einem Sternchen gekennzeichnet ist. Pfeile markieren, wo Alpha-Synuclein gefunden wurde. Das ubiquitinierte Amyloid-Vorläuferprotein wurde ebenfalls von mini 2D untersucht.
Sporadische Werbung wurde mit familiärer Werbung verglichen. In der familiären ad Beta-Amyloid-Varianz sind die Konzentrationen von eins bis 42 und ISO-Varianz geringer, da Ligaformen bei acht Kilodalton gefunden wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Proteom untersucht, um komplexe Proben durch Messung von Proteinexpressionsmodifikationen zu vergleichen.
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Überblick
Diese Studie konzentriert sich auf die Extraktion von Proteinen aus menschlichem und murinem Hirngewebe unter Verwendung eines gängigen Lysepuffers für die Proteomikanalyse. Die Methode ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen durch fortschrittliche Elektrophoresetechniken.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Proteomik
- Neurowissenschaft
- Biochemie
Hintergrund
- Die Proteinextraktion ist entscheidend für das Verständnis der Gehirnfunktion.
- Zweidimensionale Elektrophoresetechniken verbessern die Proteintrennung.
- Posttranslationale Modifikationen können die Proteinfunktion erheblich beeinflussen.
- Zuverlässige Methoden sind für reproduzierbare Ergebnisse in Biopsien und Modellen erforderlich.
Zweck der Studie
- Proteine aus Hirngewebe für die Analyse zu extrahieren.
- Zweidimensionale Fluoreszenz-Differenz-Gelelektrophorese zu nutzen.
- Posttranslationale Modifikationen durch Immunblotting zu identifizieren.
Verwendete Methoden
- Proteinextraktion mit Harnstoff/Thioharnstoff/SDS-Puffer.
- Zweidimensionale Fluoreszenz-Differenz-Gelelektrophorese (2D-DIGE).
- Mini 2D Gelelektrophorese für Immunblotting.
- Massenspektrometrie zur Proteinidentifizierung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Extraktion von Proteinen aus humanem und murinem Hirngewebe.
- Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie.
- Charakterisierung posttranslationaler Modifikationen.
- Verbesserte Reproduzierbarkeit der Ergebnisse aus Biopsien und Modellen.
Schlussfolgerungen
- Die Methode liefert zuverlässige Ergebnisse für die Proteomikanalyse.
- Sie erleichtert die Untersuchung der Proteinexpression und -modifikationen.
- Dieser Ansatz kann auf verschiedene neurologische Studien angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables standardized protein extraction from limited human post-mortem and murine brain tissue, supporting reproducible proteomic profiling in neurodegenerative disease models. By integrating 2D-DIGE for quantitative expression analysis and mini 2DE immunoblotting for post-translational modification validation, the method strengthens target validation confidence and mechanistic de-risking in early discovery. The approach facilitates cross-species comparison and biomarker discovery relevant to Alzheimer’s disease and Lewy body dementia pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through global protein expression profiling in disease-relevant brain tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by detecting post-translational modifications such as ubiquitination and dimerization of disease-associated proteins like alpha-synuclein and amyloid precursor protein.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing qualitative comparison of protein modifications across conditions, aiding in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by yielding protein extracts compatible with 2D-DIGE and immunoblotting platforms.
- Reproducibility: Addresses assay standardization through standardized lysis buffer and chloroform-methanol precipitation, improving consistency across human and murine samples.
- Quantitative Output: Enables reliable compound evaluation via fluorescence difference gel electrophoresis, supporting differential expression screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports study of molecular pathways in neurodegenerative diseases by enabling analysis of protein aggregates such as amyloid-beta and alpha-synuclein.
- Translational Continuity: Provides continuity from discovery through preclinical validation by allowing side-by-side comparison of human and mouse brain proteomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying disease-associated protein modifications and expression changes in models of tau pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, particularly in neurodegenerative disease programs requiring mechanistic insight and target de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein expression changes and post-translational modifications via isoelectric point and molecular weight separation.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through 2D-DIGE, enabling comparison of protein expression across complex samples.
- Analytics: Generates measurable readouts including spot intensity, migration shifts, and modification patterns that help teams compare conditions and prioritize targets.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling analysis of human and murine brain tissue under comparable conditions, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic capability rather than a single-use technique, applicable across multiple targets and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of protein modifications and expression shifts.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via standardized lysis buffer and protein precipitation protocols, minimizing variability across laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through mechanistic insight, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing data on protein biomarkers and modification states relevant to disease progression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, protein biochemistry, and electrophoresis techniques including 2D-DIGE and immunoblotting.
- Depends on instrumentation such as electrophoresis systems, sonicators, centrifuges, and mass spectrometry-compatible platforms.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, protein quantification, and labeling procedures to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different brain regions, disease models, or sample quantities.
- Includes practical limitations such as the need for careful sample handling to prevent degradation and the dependency on sufficient protein yield from limited tissue inputs.
