Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Proteine aus menschlichem und murinem Hirngewebe für die Proteomanalyse zu extrahieren. Dies wird durch die Verwendung eines gängigen Lysepuffers erreicht, um eine für zweidimensionale Elektrophoreseverfahren geeignete Proteinextraktion durchzuführen. Anschließend erfolgt die Trennung der Proteine mittels zweidimensionaler Fluoreszenz-Differenz-Gelelektrophorese zur Identifizierung durch Massenspektrometrie.

Anschließend erfolgt eine miniaturisierte zweidimensionale Gelelektrophorese mit Immunschichtblotting zur Identifizierung posttranslationaler Modifikationen. Die Ergebnisse können die globale Proteinausprägung zeigen. Wirtsübersetzungsänderungen aller Ligamentierungen und katalytischen Produkte basieren auf den Unterschieden im isoelektrischen Punkt und im Molekulargewicht.

Die Kombination aus 2D-DASH und 2D-Monolo kann uns dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neuroproteomik zu beantworten, indem gleichzeitig Informationen über Expressionsänderungen, posttranslationale Modifikationen und Katabolismus in Produkten bereitgestellt werden. Beginnen Sie mit der Gewinnung und Homogenisierung des Gehirngewebes. Bereiten Sie das Gewebe im Verhältnis von 10 % Gewicht zu Volumen in Extraktionspuffer für menschliches Gehirngewebe auf.

Homogenisieren Sie das Gewebe mithilfe einer Glaspipette; verwenden Sie jedoch für Nagetiergewebe einen Teflon-Homogenisator, um das jeweilige Homogenat zu zerkleinern. Sonizieren Sie es bei 60 Hertz mit 30 halbsekündigen Impulsen. Bestimmen Sie anschließend die Proteinkonzentration mittels eines Bradford-Assays unter Verwendung von BSA als Standard.

Sammeln Sie nun die Lösungen für die Chloroform-Methanol-Fällung in einem Eisbehälter. Planen Sie etwa 125 Mikrogramm für 11 cm IPG-Streifen oder etwa 1,25 Milligramm für 18 cm IPG-Streifen ein. Sobald sich die Lösungen auf vier Grad Celsius abgekühlt haben, führen Sie die Fällung vollständig auf Eis durch.

Fügen Sie zunächst drei Volumina Methanol, dann eines Chloroform hinzu. Schütteln Sie diese Mischung. Geben Sie anschließend drei Volumina kaltes Wasser hinzu.

Vortexen Sie diese Mischung eine Minute lang, zentrifugieren Sie das Probenröhrchen anschließend 30 Minuten bei 12.000 G und vier Grad Celsius. Aspirieren und verwerfen Sie den Überstand. Geben Sie dann das Dreifache des Volumens Methanol hinzu, vortexen Sie erneut und zentrifugieren Sie die Proteine auf die gleiche Weise.

Trocknen Sie das gesammelte Proteinpellet unter Stickstoffgas vor der 2D-DIGE-Analyse. Lösen Sie das Protein in 2D-Puffer mit einer Konzentration von 2,5 Milligramm pro Milliliter. Anschließend werden die Proben wie zuvor durch Ultraschall behandelt, bis sie verwendet werden.

Lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bevor Sie mit diesem Schritt beginnen, und nach der Proteinfällung. Es ist erforderlich, die Protein-Konzentration erneut mittels Bradford-Assay zu bestimmen. Gehen Sie dabei genauso vor wie zuvor vor der Markierung mit dem Psy-Farbstoff.

Die Qualität der Proteinprobe wird zu diesem Zweck mittels SDS-Gelelektrophorese überprüft. Verdünnen Sie 15 Mikrogramm Protein in LDS und heizen Sie es 37 Grad Celsius in einem Wasserbad oder Block auf. Anschließend werden sie auf einem Polyacrylamidgel aufgetragen und das Gel mindestens eine Stunde lang mit Coomassie-Blau-Lösung angefärbt.

Anschließend das Gel über Nacht in einer 7 %igen Essigsäure, 10 %igem Ethanol-Lösung fixieren. Sobald die Qualität der Proteinprobe bestätigt ist, wird am nächsten Tag das SD-Markierungsverfahren begonnen. Zunächst wird der pH-Wert des Lysats gemessen, der basisch bis neutral sein sollte.

Der optimale pH-Wert für nachfolgende Reaktionen beträgt 8,6. Bereiten Sie danach die Farbstoff-Konjugationsreaktionen für jede Proteinprobe vor. Mischen Sie 50 Mikrogramm mit 400 Pikomol S3-Farbstoff und 50 Mikrogramm mit 400 Pikomol S5-Farbstoff.

Führen Sie dies im Vierfach durch, insgesamt acht D-Kopplungsreaktionen pro Probe. Für jede getestete Probe bereiten Sie einen komplementären Satz von DI-Kopplungsreaktionen unter Verwendung von Protein aus der Kontrolle zu, beispielsweise aus einem erkrankten Gehirn. Richten Sie dann für jedes Reaktionspaar eine interne Kontrollreaktion mit 400 Pikomol CY zwei und einer gleichmäßigen Darstellung aller Proteine, die insgesamt 250 Mikrogramm betragen, ein.

Die SAI-Markierung wird erreicht, indem alle Reaktionsgemische eine Stunde lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubiert werden. Nach der Inkubation werden alle Sätze der drei verschiedenen Cyan-Reaktionen zu jeweils 150 Mikroliter vereinigt und mit je 200 Mikroliter 2D-Puffer versetzt. Anschließend werden die Schritte der zweidimensionalen Elektrophorese durchgeführt.

Beginnen Sie mit der Herstellung unmarkierter Proteinpulösungen für das präparative Gel, aus dem Proteinpunkte für jede Probe und die positive Kontrolle ausgeschnitten werden. Aliquotieren Sie 300 bis 350 Mikrogramm unmarkiertes Protein in 2D-Puffer und lassen Sie es in Kontakt mit dem IPG-Strip rehydrieren. Laden Sie anschließend die IPG-Strips und überführen Sie das markierte und das unmarkierte Protein in eine Rehydrierung.

Bedecken Sie dann jede Vertiefung mit einem IPG-Reaktionsstreifen. Fügen Sie eine Überlagerung mit Mineralsöl hinzu und lassen Sie die Streifen über Nacht bei maximal 25 Grad Celsius passiv mit der Proteiniösung rehydratisieren. Führen Sie am nächsten Tag die isoelektrische Fokussierung der IPG-Streifen durch.

Entfernen Sie dann das Öl und lagern Sie die IPG-Streifen bei minus 20 Grad Celsius, um die IPG-Streifen zu equilibrieren. Tauchen Sie sie 15 Minuten lang in Puffer zur Equilibrierung ein. Überführen Sie anschließend die Streifen in 4,7 % IDO-Acetamid im Equilibrierpuffer, ohne DTT, während die Streifen darin baden.

Verwenden Sie ein großes 2D-Gelelektrophorese-System, um vier 12 % SDS-PAGE-Gele pro Probe auf fluoreszenzarmen Glasplatten für die markierten Proteine aufzutragen. Gießen Sie außerdem je ein 12 % SDS-PAGE-Gel in 1,5 Millimeter dicke Standardglasplatten für die unmarkierten Proteine. Dies sind die präparativen Gele.

Nach dem Abkühlen der Gele die Streifen auf die Oberseite der Gele übertragen und die Streifen nach dem Abkühlen mit 0,5 % Aros bedecken; anschließend die Gele über Nacht bei 2,5 Watt und vier Grad Celsius laufen lassen und am nächsten Tag analysieren. Viele 2D-Reaktionen können mit Proteininproben durchgeführt werden, die für die präparativen Gele verwendet wurden. Weniger als 100 Mikrogramm Probe in 200 Mikroliter 2D-Puffer abmessen.

Vortexen Sie die Probenmischungen anschließend kräftig und zentrifugieren Sie sie kurz. Geben Sie die Proben auf 11 cm lange IPG-Streifen und lassen Sie diese am folgenden Tag über Nacht passiv unter einer Schicht Mineralsöl rehydrieren. Führen Sie die isoelektrische Fokussierung durch.

Danach die Streifen nacheinander durch drei Bäder mit Equilibrierungspuffer bewegen, jeweils 15 Minuten pro Bad. Anschließend werden die Streifen auf 2D-SDS-PAGE-Gelen laufen gelassen. Jeden Streifen auf ein vorgefertigtes Gel mit dem entsprechenden molekularen Gewicht auftragen.

Polyacrylamid für das Protein der Interesse. Übertragen Sie anschließend die Gele auf eine NITROCELLULOSE-PVDF-Membran und analysieren Sie sie mit Antikörpern im Rahmen der Entwicklung dieses Protokolls. Drei verschiedene Lyseverfahren.

Es wurden Puffer getestet. Zunächst ein gängiger biochemischer und molekularbiologischer Puffer. Tris-SDS wurde getestet.

Tris-SDS wies im Vergleich zu einem anderen getesteten Puffer, UTS, eine schlechte Auflösung auf. Der dritte Puffer wurde als nicht testbar ausgeschlossen, da mit ihm keine Testproben hergestellt werden konnten. Anschließend wurden die Proteome von menschlichem und murinem Gehirn untersucht.

Menschliche Kontrollcortexproben und AD-Cortexproben wurden verglichen. Maushirnproteine von Mäusen mit AD-ähnlicher Tau-Pathologie wurden ebenfalls anhand der menschlichen Probe untersucht. SCI zwei wurde unabhängig ausgewertet, ebenso wie S SI drei und sci fünf für jedes D. Die hohe Punktauflösung erleichterte die Ausrichtung.

Mittels qualitativer Mini-2D-Analyse wurden posttranslationale Modifikationen untersucht, und eine Ligamentisierung von Alpha-Synuclein im AD-Gewebe wies ein normales Profil auf, wurde jedoch auch als Dimer gefunden, das mit einem Sternchen gekennzeichnet ist. Pfeile zeigen die Positionen an, an denen Alpha-Synuclein nachgewiesen wurde. Ubiquitiniertes amyloides Vorläuferprotein wurde ebenfalls mittels Mini-2D sichtbar gemacht.

Spontanes AD wurde mit familiärem AD verglichen. Beim familiären AD sind Beta-Amyloid 1-42 und die ISO-Variante aufgrund der bei acht Kilodalton gefundenen Ligamerformen in ihrer Konzentration niedriger. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Proteom untersucht, um komplexe Proben durch die Messung von Proteinexpressionsveränderungen zu vergleichen.