Name: Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-10T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Lernen Sie ein standardisiertes Proteinextraktionsprotokoll aus menschlichem und murinem Gehirngewebe für die Proteomanalyse mittels 2D-DIGE und Mini-2DE-Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Identifizierung von Proteinen und posttranslationalen Modifikationen.

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Diese Arbeit wurde von INSERM, Universität Lille 2 unterstützt, MEDIALZ, LABEX (Exzellenz Labor-Programm zu investieren für die Zukunft) und DISTALZ (Entwicklung innovativer Strategien für eine transdisziplinäre Ansatz zur Alzheimer-Krankheit). FJ.FG ist derzeit ein Empfänger Gemeinschaft von ANR (Französisch National Research Agency / NeuroSplice de Projet Tau ANR-2010-BLAN-1114 01), aber diese Arbeit im Rahmen der Unterstützung von einem Stipendium der JCCM (Spanien) war.

1. Homogenisierung und Gesamtproteinextraktion aus Mensch und Maus Gehirngewebe <ol><li> Hirngewebe Homogenisierung. Homogenisieren des Gehirngewebes 10% (w / v) in 8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff und 1% w / v SDS-Puffer (UTS) mit einem Potter-Glas (für menschliche Proben) oder Teflon-Homogenisator (für Mäuse Proben). Ultraschallbad bei 60 Hz 30 Impulse mit einer Ultraschallgenerator, indem 0,5 sec für die Gesamt Gewebe Zerfall 13, 14. <ol><li> Bestimmen Proteinkonzentration mit Bradford-Test, mit BSA als Standard. Diese Extraktionspuffer UTS ist völlig kompatibel mit einer Dimension SDS-PAGE solange Lysaten nicht überhitzt zu Carbamylierung 15 zu vermeiden. </li><li> 1% (w / v) und Amberlite inkubieren unter leichtem Mischen während 10 min bei Raumtemperatur. Danach auf 0,22 um Spritzenfilter filtern und schließlich auf die Harnstoff / Thioharnstoff-Lösung fügen Sie den SDS. Dieser Schritt die Menge von Harnsäure und Isocyansäure, die in equilibr sind reduziertium mit Harnstoff in Lösung und deren Abbau erleichtern. </li></ol></li><li> Chloroform / Methanol-Proteinfällung. Man fällt zwischen 100-150 ug Protein für 11 cm IPG-Streifen und 1 bis 1,5 mg für 18 cm Einsen (unabhängig vom pH-Bereich gewählt, um die IEF durchzuführen). <ol><li> Alle Schritte auf Eis oder bei 4 ° C. Kühlen Chloroform und Methanol bei 4 ° C für 30 min vor dem Beginn der Fällungsverfahren. </li><li> Hinzufügen von drei Volumina Methanol und einem Volumen Chloroform zu einem Volumen UTS Lysat. Schütteln Sie die Mischung manuell und fügen Sie drei Volumina kaltem Wasser. Wirbel während 1 min pelle die Proteine ​​durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Verwerfen des Überstandes mit einer Pasteurpipette und fügen Sie drei Volumina kaltem MeOH. Wirbel immer Zentrifuge bei 12.000 × g während 30 min bei 4 ° C. Schließlich Stand verwerfen und das Pellet trocknen unter N 2. </li></ol></li><li> Herstellung von Proteinen für die 2D-Analyse.Resuspendieren des Protein-getrocknete Pellet in 2D-Puffer (8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff mit 4% CHAPS ergänzt). Waschen der Lösung mit Amberlite wie oben angegeben, und versuchen, den Anteil von 500 &amp;mgr; g Protein pro 200 ul Puffer für 2D-2D-DIGE halten. Hinweis: 2D-Puffer bei -80 º C gelagert oder bei 4 ° C während einer Woche gehalten (Harnstoffabbau zu verhindern) werden. <ol><li> Ultraschallbad und speichern die Proben bei -80 ° C bis die Durchführung der folgenden Schritt. Bemerkenswert, kann dieses Protokoll verwendet werden, nachdem Ameisensäure Solubilisierung von Protein-Aggregate 10. Kurz gesagt, verdampfen Ameisensäure unter N 2 und das Pellet wie beschrieben. </li></ol></li></ol> 2. 2D-DIGE <ol><li> Proben testen Qualität. Dose Proben erneut mit Ford-Methode. Verdünnen Sie 15 ug von Proteinen in LDS-Probenpuffer, Wärme bei 37 ° C 15 und laden auf 4-12% Polyacrylamid-Gelen. </li><li> Coomassie-Färbung. Fleck-Polyacrylamid-Gel mit 0,1% (w / v) CoomassieBlue G-250, 50% EtOH und 10% (v / v) Essigsäure-Lösung für mindestens 1 Stunde. Hintergrund ließ über Nacht in 7% Essigsäure und 10% (v / v) Ethanollösung entfärben. </li><li> Pre-elektrophoretische Kennzeichnung der Proben. Vor der Durchführung Cyaninfarbstoff Kennzeichnung, ob der pH-Wert der Probe, die Basis-oder auch neutral sein sollte, da die N-Hydroxysuccinimid-Substitution ist effizienter bei basischem pH-Wert und bei optimaler pH 8,6 sein. <ol><li> Beschriften Sie die minimal zwei Proben Studie mit Cy3 oder Cy5 Fluoreszenzfarbstoffe mit einem Verhältnis von 50 ug protein/400 pmol Farbstoff und halten für 1 h bei 4 ° C in der Dunkelheit, die NHS-Ester reaktiven Gruppe der Cyanine mit der unprotonierten Amin erleichtern Gruppen der Lysine. </li><li> Reduzieren Probe Variationen, einen Quer Markierung mit Cy3 und Cy5 Farbstoffen, die Vermeidung einer Vorzugs Kupplung einer Probe zu einem bestimmten Cyanin. Beachten Sie, dass die Cyanin-Farbstoff minimale Markierung kann für kleine Menge an Proteinen, unter Beibehaltung der Menge von 1 ug pro angepasst werdenotein je 8 pmol Cyanin-Farbstoff. Wenn ja, kann das Mini-2DE-System anstelle des großen 2D-Gel-System verwendet werden. Damit wird die 2D-DIGE Analyse einer kleinen Menge von Hirngewebe. </li><li> Kennzeichnen einen Pool von beiden Proben mit der gleichen Menge von Protein (50 ug insgesamt) mit Cy2 Fluoreszenzfarbstoff und als interner Standard verwendet. Verwenden Sie die gleichen Bedingungen wie zuvor angegeben. </li><li> Vollständiges zu einem Gesamtvolumen 350 ul mit 2D-Puffer, enthaltend 1,1% Destreak Reagenz, 1,2% IPG-Puffer und Spuren von Bromphenolblau die Gesamt 150 ug markierte Proteine ​​(50 ug Cy2, Cy3 50 ug und 50 ug Cy2). Führen Sie diesen Schritt in vierfacher Ausfertigung mit vier unabhängigen Streifen. Außerdem bereiten zwei zusätzliche nicht-markierten Streifen (eine für jede Probe) mit 350-450 &amp;mgr; g Protein für den präparativen Gelen. </li><li> Lassen Sie die sechs geladenen Streifen mit Mineralöl über Nacht für passive Rehydrierung bedeckt. </li></ol></li><li> Isoelektrofokussierung. Führen Sie die IEF bei 206; C Bei einem pH-Wert von 3-11NL, 18 cm Streifen des Protokolls ist: maximale Stromeinstellung ist 50 uA / Band während 8 Etappen: 1) 150 V Schritt 1 h, 2) 200 V Schritt 5 Stunden, 3) 500 V Gradient für 2 Stunden, 4), 1000 V Gradienten für 2 Stunden, 5), 2000 V Gradienten für 2 Stunden, 6) 4.000 V Gradienten für 2 Stunden, 7) 8.000 V Gradienten für 2 Stunden und 8) für insgesamt 24.000 V · h Schritt . Nach IEF, Versand den Überschuss der Mineralöl-Chromatographie mit Papier und die Streifen bei -20 ° C bis in die zweite Dimension. </li><li> IPG-Streifen Ausgleich. Äquilibrieren Streifen in 6 M Harnstoff, 2% SDS, 30% Glycerol, 50 mM Tris-HCl pH 8,6-Puffer mit 1% DTT für 15 min und nach mit 4,7% Jodacetamid in dem gleichen Puffer ohne DTT. </li><li> Zweite Dimension oder SDS-PAGE-Elektrophorese. Stellen die sechs 12% SDS-PAGE-Gelen (1,5 M Tris-HCl pH 8,6, 12% Acrylamid / Bisacrylamid, 0,1% (w / v) SDS, 0,072% (w / v) APS und 0,1% (v / v) TEMED ) in der gleichen Zeit mit einem großen 2D-System mit vier Low-Fluoreszenz-Glasplatten für die strips mit Fluoreszenzproben und zwei weitere Glasplatten mit 1,5 mm Dicke für präparative Gele, um die Protein-Spots herauszuschneiden. <ol><li> Laden die sechs IPG-Streifen auf der Oberseite der Gele und überschichtet mit 0,5% (w / v) Agarose. Laufpuffer aus 25 mM Tris, 192 mM Glycin und 0,1% (w / v) SDS besteht. Führen Sie die Migration bei 2,5 W / Gel über Nacht mit einem Kühlsystem auf 4 ° C 16,17 gesetzt. </li></ol></li><li> Fluoreszenzbilder Erfassung und Analyse. Verwenden Sie einen Typhoon 9400-Scanner, um die Fluoreszenz Gele Bilder (12 Bilder zu einem Experiment) zu erhalten. Scan Cy2, Cy3 und Cy5 Bilder für jedes Gel bei 488/520 nm 532/580 nm und 630/670 nm Anregung / Emissionswellenlängen auf. Verwenden Informatik-Software, um die Bilder zu analysieren. Daten sind repräsentativ für die Veränderungen der Spot Volumen der Verteilung des Signals über die vier Gele zwischen den beiden untersuchten Proben verbunden. </li><li> Coomassie-Färbung für große Gele. Befestigen Sie die präparative Gele in 50% (v / v) EtOH und 3% (V / V) Orthophosphorsäure-Lösung für mindestens 24 Stunden. Dann, nach zweimal waschen mit ultrareinem Wasser für 20 min. Führen Färbung in 34% (v / v) MeOH, 17% (w / v) Ammoniumsulfat und 2% Orthophosphorsäure 1 h vor der Zugabe von 0,1% (w / v) Coomassie-Blue G-250. Halten Sie die Gele in der Färbung für mindestens 48 h und in ultrareinem Wasser entfärbt. <ol><li> Spots für MS-Identifikation. Sobald Fluoreszenzbildern analysiert, stellt die Software eine Liste von Punkten, deren Expression statistisch unterschiedlich. Manuelles auszuschneiden diese Flecken aus den präparativen Gelen. Dieses Verfahren erfordert Übung und etwas Fingerfertigkeit, um Keratin Kontamination zu vermeiden. Proben können dann in Wasser bei -20 ° C bis zum Senden MS gehalten werden. Spot-Identifikation ist vollkommen kompatibel mit Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) und Relevanz der Protein-Identitäten nach der Wahrscheinlichkeit basiert Mowse-Score mit einem p-Wert von 0,05 (p &lt;0,05) 18 berechnet beurteilt. </li> &lt;/ Ol&gt; </li></ol> 3. Qualitative Mini-2DE Assay <ol><li> Resuspendieren maximal 100 ug Proteinprobe in 2D-Puffer bis zu einem Endvolumen von 200 &amp;mgr; l einer 11 cm IPG-Streifen. Im Falle der Überexpression System oder gereinigtes Protein, kann die Ausgangsmenge an 20 ug gesenkt werden. </li><li> Hinzufügen von 1,1% (v / v) Destreak Reagenz, 0,55% (v / v) IPG-Puffer und Spuren von Bromphenolblau bis zu einem Endvolumen von 200 ul. Dann Wirbel, stellen einen schnellen Spin und laden zu einem IPG-Streifen für passive Rehydrierung über Nacht mit Mineralöl bedeckt (um den Streifen in seine ursprüngliche Dicke mitbringen). Anmerkung: Der Anteil der IPG-Puffer ist für alle gleich dem Intervall des gewünschten pH (pH 3-11, 4-7, 7-11, usw.), aber seine Zusammensetzung variiert in Abhängigkeit von dem pH-Bereich gewählt. </li><li> Isoelectrofocalisation. Führen IEF bei 20 ° C Die Programmdauer ist abhängig vom pH-Bereich gewählt. Bemerkenswert, Parameter wie Elektroendosmose kann die IEF-Profil stören und in diesen FällenOptimierung in electrofocalisation Zeit erforderlich ist 19. Hinweis: es ist nicht unbedingt eine längere IEF, die bessere Ergebnisse liefert, aber die Verkürzung der Zeit von IEF kann auch die Auflösung zu verbessern. Nach IEF kann IPG-Streifen bei -20 ° C über Monate gelagert werden. </li><li> IPG-Streifen Ausgleich. Äquilibrieren der Streifen in einem Puffer, der 25 mM Tris-HCl pH 6,8, 20 mM DTT, 10% Glycerin, 5% SDS, 0,05% Bromphenolblau. Machen Sie drei Gleichgewichts badet für 15 min mit der Änderung der Pufferlösung zwischen jedem Bad. </li><li> SDS-PAGE. Die IPG-Streifen Schicht auf ein Fertig Gel (IPG ein gut 11 cm IPG-Streifen) mit einem Anteil von Polyacrylamid in Abhängigkeit von der MW des Proteins von Interesse gewählt. Dann tupfen Sie das Gel auf eine Nitrocellulose / PVDF-Membran bei 100 mV bei 33 min. </li><li> Inkubation über Nacht mit der erforderlichen Antikörper und Visualisierung von Peroxidase-Aktivität. Führen Sie die Ausrichtungen der Immunoblots mit nicht verwandten Polypeptiden, die durch den sekundären Antikörper enthüllt. Erreiche eine halb quantittive Analyse durch Densitometrie des Volumens und der Intensität der Spuren / Spots mit ImageJ Software. </li></ol>

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</ol>

Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Entdecken pathologischen Expression von Proteinen, die Suche nach Biomarkern und die Modulation der möglichen Pfade für pharmakologische Targets gehören zu den Zielen der Neuroproteomics 30 nähert. Unter den Schwellenwerkzeuge, ergänzt das Feld 2DE eine vielversprechende Erwartungs. Dennoch sollte ein Konsens, um die Variabilität zu minimieren und die Reproduzierbarkeit der Experimente erreicht werden. Entsprechend dieser Idee ein standardisiertes Protokoll, um 2D-DIGE (Abbildung 2) und die a...

Psychische und neurologische Störungen repräsentieren 13% der globalen Krankheitslast, müssen neue Herausforderungen wie die pathophysiologischen Mechanismen, Risikofaktoren und Biomarker erforscht prodromal 1 werden. Im Einklang mit diesem Ziel, Proteomik-Studien des menschlichen Gehirns unverzichtbar geworden, um molekulare Signalwege in Prozesse wie Gedächtnis, Verhalten, Emotionen und neuronale Plastizität zum Beispiel, nicht nur für die physiologische, sondern auch für pathologische Zustände beteiligt aufzudecken. Daher ist die Verwendung von Tiermodellen und insbesondere die transgenen Mäuse, bringt eine Vielzahl von Möglichkeiten, um die Entstehung von menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen 2 nachzuahmen. Proteomics Ansätze sind, um diese neue Perspektiven im Bereich der Neurowissenschaften zu erreichen heutzutage. Zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) ist ein potenter und wahrscheinlich einfache Methode, um das Proteom von einer Vielzahl von Proben vergleichen können. Darüber hinaus ist es auch eineleistungsfähige Methode, um ein Protein aus einem komplexen Gemisch, um zu identifizieren und zu isolieren, weiter zu analysieren, durch Massenspektrometrie. Diese Technik besteht im wesentlichen in zwei aufeinanderfolgenden Stufen: 1) Proteintrennung nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI) von Isoelektrofokussierung (IEF). Genauer gesagt, wird ein elektrisches Potential über die Immobilin Acrylamid Streifen unter einem pH-Gradienten aufgetragen und dann Proteine ​​wandern und sich auf einen bestimmten pI in Abhängigkeit von ihrer globalen Nettoladung. 2) isoelektrisch fokussiert Proteine ​​denaturiert und negativ durch die Zugabe von Natriumdodecylsulfat (SDS geladen), wodurch Proteine ​​in ihrer ersten Struktur werden je nach ihrem scheinbaren Molekulargewicht (MW) von SDS-PAGE 3 getrennt. Diese zwei unterschiedlichen Eigenschaften ermöglichen es uns, einen double-Wert, weiter in der Studie des Proteoms gehen zu bewältigen. Auf der einen Seite dieser Ansatz bietet die Möglichkeit, eine quantitative Analyse mit minimalen Farbstoffe 2D-DIGE-Verfahren durchzuführen, und auf der anderen Seite ein qualitaive Analyse von Mini-2DE zu Western-Blot gekoppelt. Quantitative Analyse von 2D-DIGE verleiht Protein-Expression ändert sich über die Probe Proteom. Kurz gesagt werden Proben mit drei Cyanine (Cy2, Cy3 und Cy5) Emission bei drei verschiedenen Wellenlängen (blau, grün und rot) markiert. Diese Fluor minimal Farbstoffe N-Hydroxy Succinimidylester-Gruppe enthaltenden reagieren mit der ε-Aminogruppe der Lysinreste von Proteinen, was zu kovalenter Amid-Bindungen 4. Lysinreste werden nur zwischen 1-3% und damit verhindert, dass mehrere Etiketten zusätzlich pro Protein und die wichtigsten Änderungen der Nettoladung 5, 6 gekennzeichnet. Cy3 und Cy5 werden oft verwendet, um zwei unabhängige Stichproben zu kennzeichnen, während Cy2 Tags eine Mischung aus gleichen Teilen der Proben zu vergleichen. Die beiden wichtigsten Vorteile sind, dass alle markierten Proben werden gemischt und IEF und SDS-PAGE sind in ein Gel auf einmal für jeden Schritt durchgeführt, die Vermeidung der inter Variabilität unter Experimente durch Vergleich geliert. Darüber hinaus stellt es eine hohe Detektionsschwelle von rund 1 Femtomol von Protein 7. Gele werden gescannt und 2D-Software vergleicht die 2D-Gel-Fluoreszenzbilder, wo Cy2 dient als interner Standard, die eine Identifizierung der statistischen Unterschiede zwischen den Stellen für ihren hinteren Identifizierung durch Massenspektrometrie. Das 2D-Analyse-Software mit dem internen Standard erreicht eine schnelle Erkennung von weniger als 10% der Unterschiede zwischen den Proben mit mehr als 95% der statistischen Vertrauens 8. Qualitative Analyse von Mini-2DE ist ein entscheidender Schritt für die Proteincharakterisierung. Das Prinzip ist das gleiche, wie zuvor für PI-und MW-Trennung beschrieben, aber in diesem Fall Proteine ​​werden von einer kleinen Polyacrylamid-Gel auf eine Membran übertragen und Immunoblot wird danach durchgeführt. Während einer Dimension Gelelektrophorese stellt Veränderungen in der Proteinexpression für ein oder mehrere Protein-Epitope in Funktion des Antikörpers, der INFORMATIOn von Mini-2DE verleiht mit zwei zusätzlichen Parametern. Erstens ändern die Protein isovariants in Abhängigkeit von der pI, die anzeigt, dass post-translationale Modifikationen stattfinden könnten. Zweitens kann die Massenspektrometrie Identifizierung bezeichnend für plausibel Zymogene und Abbauprodukte von Proteinen sein. Daher sind durch 2D-DIGE beobachtet Modifikationen wahrscheinlich ein Indikator für die zugrunde liegenden Mechanismen Veränderungen in der globalen Proteom-Profil. Alignments von Immunoblots unter mehreren Proben für das gleiche Protein-Epitop / s Mini-2DE kann Säure Veränderungen beleuchten in post-translationale Variationen etwas beobachtet oder gar nicht von eindimensionalen Immunoblotting 9, 10 reflektieren. Darüber hinaus informiert diese Analyse über die möglichen Spaltstellen aufgrund der Kenntnis des pI und MW der Stoffwechselrückstände 11,12. Die Kombination dieser beiden Techniken eine komplementäre Proteomik-Analyse. Auf der einen Seite 2D-DIGE bietet einen typ.e von Unterschieden ermöglicht eine präzise Trennung von Polypeptiden, deren Expression ist anders. Diese Unterschiede bestehen im wesentlichen in das Auftreten oder Verschwinden eines Flecks oder Zunahme / Abnahme der Intensität einer durch eine Software-Analyse der Fluoreszenz Gele. Jedoch sind diese Beobachtungen selbst kaum die Natur der beobachteten Änderung erklären. Aus diesen Gründen einmal das Polypeptid isoliert und durch Massenspektrometrie identifiziert, die Verwendung von Mini-2DE ermöglicht, genau zu bestätigen 1) die Identität des Proteins isoliert und 2) die Art der Unterschied: Änderung in der isovariant / Isoform Niveau Expression, posttranslationale Modifikationen und Spaltprozesse zum Beispiel. Jedoch ist es notwendig, einen Ausgangs Lysepuffer sowohl 2D-DIGE und mit Mini-2DE kompatibel sein, um die möglichen Dispersionen durch die Verwendung von Extraktionsprotokollen, die sehr unähnlich zu begrenzen entwickeln. In dem vorliegenden Artikel werden wir debeschrieben eine angepasste Protokoll für die Vorbereitung, Extraktion und die Leistung der 2D-DIGE und Mini-2DE Techniken zur Gehirnproteine ​​aus humanen und Maus-Gewebe.

<table><tbody><tr><td>CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo</td><td>GE Healtcare</td><td>25-8010-65</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip</td><td>GE Healtcare</td><td></td><td>Referenz in Abhängigkeit vom pH-Intervall/Größe</td></tr><tr><td>IPG Buffer, pH X-X</td><td>GE Healtcare</td><td></td><td>Referenz in Abhängigkeit vom pH-Intervall gewünscht</td></tr><tr><td>AMBERLITE IRN-150L MISCHBETTHARZ 1&nbsp;</td><td>GE Healtcare</td><td>551797N</td><td></td></tr><tr><td>DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l</td><td>GE Healtcare</td><td>17-1335-01</td><td></td></tr><tr><td>KIT BOX IPG 1 * 1 KIT</td><td>GE Healtcare</td><td>28-9334-92</td><td>Kunststoffbox zur passiven Rehydratisierung&nbsp;</td></tr><tr><td>MILLEX GS Filter</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td></td></tr><tr><td>Criterion XT Fertiggele 13,3 x 8,7 cm (B x L)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Referenz in Abhängigkeit von der MW zur Trennung</td></tr><tr><td>IPGphor III Isoelektrische Fokussiereinheit</td><td>GE Healtcare</td><td>11-0033-64</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTsix Large Elektrophorese</td><td>System GE Healtcare</td><td>80-6485-08</td><td></td></tr><tr><td>OneTouch 2D Gel SpotPicker 1,5 mm&nbsp;</td><td>Gel-Firma</td><td>P2D1.5</td><td></td></tr></tbody></table>

konsens brain-derived protein, extraktionsprotokoll für das studium der human-und maus-gehirn-proteome mit sowohl 2d-dige-und mini-2de immunoblotting

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Proteom Änderungen möglicherweise zu verschiedenen physiologischen oder pathologischen Bedingungen im Zusammenhang aufzudecken. Grundsätzlich ist dieses Verfahren auf die Trennung von Proteinen entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt in einem ersten Schritt, und zum anderen nach ihrem Molekulargewicht durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) auf. In diesem Bericht ein optimiertes Protokoll für die Probenvorbereitung kleine Menge von menschlichen post-mortem Hirngewebe und Maus beschrieben. Dieses Verfahren ermöglicht es, sowohl die Fluoreszenzdifferenz-Gelelektrophorese zweidimensionalen (2D-DIGE) und Mini-2DE-Immunoblotting durchzuführen. Die Kombination dieser Ansätze ermöglicht es, nicht nur neue Proteine ​​und / oder Proteinmodifikationen finden in ihrem Ausdruck durch seine Kompatibilität mit Massenspektrometrie-Erkennung, sondern auch einen neuen Einblick in die Marker-Validierung. So, Mini-2DE zu Western-Blot-Genehmigungen verbunden zu identifizieren und zu validieren Post-Translationale Modifikationen, Proteine ​​Katabolismus und bietet einen qualitativen Vergleich zwischen den verschiedenen Bedingungen und / oder Behandlungen. Hier stellen wir eine Methode, um Komponenten von Proteinaggregaten in AD und Lewy-Körper-Demenz, wie der Amyloid-beta-Peptid und dem Alpha-Synuclein gefunden studieren. Unser Verfahren kann somit für die Analyse des Proteoms angepasst und unlösliche Proteine ​​extrahiert aus menschlichem Hirngewebe und Mäuse-Modellen zu. Parallel dazu kann es nützliche Informationen für die Untersuchung von molekularen und zellulären Signalwege bei neurodegenerativen Erkrankungen sowie potenzielle neue Biomarker und therapeutische Targets beteiligt sind.

Proteomics auf Hirngewebe bleibt eine Herausforderung, da keine ideale Puffer vorhanden, um 100% von Proteinen, insbesondere Membran-assoziierten Proteine ​​oder Zellskelett erholen. Der erste Satz von Experimenten wurde die Suche nach einem geeigneten Lyse-Puffer mit beiden Ansätze und der mit einem großen Panel von Protein erholen können kompatible konzentriert. Somit wurden drei Lysepuffer untersucht, um die am besten geeignete zu bestimmen. Erstens ist die gemeinsame biochemische und molekularbiologische Puffer Tris...

Eine gemeinsame Proteinextraktionsprotokoll unter Verwendung von Harnstoff / Thioharnstoff / SDS Puffer für Mensch und Maus Hirngewebe ermöglicht indentification von Proteinen mittels 2D-DIGE und ihre anschließende Charakterisierung von Mini 2DE Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht es, mehr reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse aus menschlichen Biopsien und experimentellen Modellen zu erhalten.

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Proteine aus menschlichem und murinem Hirngewebe für die Proteomanalyse zu extrahieren. Dies wird durch die Verwendung eines gängigen Lysepuffers erreicht, um eine für zweidimensionale Elektrophoreseverfahren geeignete Proteinextraktion durchzuführen. Anschließend erfolgt die Trennung der Proteine mittels zweidimensionaler Fluoreszenz-Differenz-Gelelektrophorese zur Identifizierung durch Massenspektrometrie.Anschließend erfolgt eine miniaturisierte zweidimensionale Gelelektrophorese mit Immunschichtblotting zur Identifizierung posttranslationaler Modifikationen. Die Ergebnisse können die globale Proteinausprägung zeigen. Wirtsübersetzungsänderungen aller Ligamentierungen und katalytischen Produkte basieren auf den Unterschieden im isoelektrischen Punkt und im Molekulargewicht.Die Kombination aus 2D-DASH und 2D-Monolo kann uns dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neuroproteomik zu beantworten, indem gleichzeitig Informationen über Expressionsänderungen, posttranslationale Modifikationen und Katabolismus in Produkten bereitgestellt werden. Beginnen Sie mit der Gewinnung und Homogenisierung des Gehirngewebes. Bereiten Sie das Gewebe im Verhältnis von 10 % Gewicht zu Volumen in Extraktionspuffer für menschliches Gehirngewebe auf.Homogenisieren Sie das Gewebe mithilfe einer Glaspipette; verwenden Sie jedoch für Nagetiergewebe einen Teflon-Homogenisator, um das jeweilige Homogenat zu zerkleinern. Sonizieren Sie es bei 60 Hertz mit 30 halbsekündigen Impulsen. Bestimmen Sie anschließend die Proteinkonzentration mittels eines Bradford-Assays unter Verwendung von BSA als Standard.Sammeln Sie nun die Lösungen für die Chloroform-Methanol-Fällung in einem Eisbehälter. Planen Sie etwa 125 Mikrogramm für 11 cm IPG-Streifen oder etwa 1,25 Milligramm für 18 cm IPG-Streifen ein. Sobald sich die Lösungen auf vier Grad Celsius abgekühlt haben, führen Sie die Fällung vollständig auf Eis durch.Fügen Sie zunächst drei Volumina Methanol, dann eines Chloroform hinzu. Schütteln Sie diese Mischung. Geben Sie anschließend drei Volumina kaltes Wasser hinzu.Vortexen Sie diese Mischung eine Minute lang, zentrifugieren Sie das Probenröhrchen anschließend 30 Minuten bei 12.000 G und vier Grad Celsius. Aspirieren und verwerfen Sie den Überstand. Geben Sie dann das Dreifache des Volumens Methanol hinzu, vortexen Sie erneut und zentrifugieren Sie die Proteine auf die gleiche Weise. Trocknen Sie das gesammelte Proteinpellet unter Stickstoffgas vor der 2D-DIGE-Analyse. Lösen Sie das Protein in 2D-Puffer mit einer Konzentration von 2,5 Milligramm pro Milliliter. Anschließend werden die Proben wie zuvor durch Ultraschall behandelt, bis sie verwendet werden.Lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bevor Sie mit diesem Schritt beginnen, und nach der Proteinfällung. Es ist erforderlich, die Protein-Konzentration erneut mittels Bradford-Assay zu bestimmen. Gehen Sie dabei genauso vor wie zuvor vor der Markierung mit dem Psy-Farbstoff.Die Qualität der Proteinprobe wird zu diesem Zweck mittels SDS-Gelelektrophorese überprüft. Verdünnen Sie 15 Mikrogramm Protein in LDS und heizen Sie es 37 Grad Celsius in einem Wasserbad oder Block auf. Anschließend werden sie auf einem Polyacrylamidgel aufgetragen und das Gel mindestens eine Stunde lang mit Coomassie-Blau-Lösung angefärbt. Anschließend das Gel über Nacht in einer 7 %igen Essigsäure, 10 %igem Ethanol-Lösung fixieren. Sobald die Qualität der Proteinprobe bestätigt ist, wird am nächsten Tag das SD-Markierungsverfahren begonnen. Zunächst wird der pH-Wert des Lysats gemessen, der basisch bis neutral sein sollte.Der optimale pH-Wert für nachfolgende Reaktionen beträgt 8,6. Bereiten Sie danach die Farbstoff-Konjugationsreaktionen für jede Proteinprobe vor. Mischen Sie 50 Mikrogramm mit 400 Pikomol S3-Farbstoff und 50 Mikrogramm mit 400 Pikomol S5-Farbstoff.Führen Sie dies im Vierfach durch, insgesamt acht D-Kopplungsreaktionen pro Probe. Für jede getestete Probe bereiten Sie einen komplementären Satz von DI-Kopplungsreaktionen unter Verwendung von Protein aus der Kontrolle zu, beispielsweise aus einem erkrankten Gehirn. Richten Sie dann für jedes Reaktionspaar eine interne Kontrollreaktion mit 400 Pikomol CY zwei und einer gleichmäßigen Darstellung aller Proteine, die insgesamt 250 Mikrogramm betragen, ein.Die SAI-Markierung wird erreicht, indem alle Reaktionsgemische eine Stunde lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubiert werden. Nach der Inkubation werden alle Sätze der drei verschiedenen Cyan-Reaktionen zu jeweils 150 Mikroliter vereinigt und mit je 200 Mikroliter 2D-Puffer versetzt. Anschließend werden die Schritte der zweidimensionalen Elektrophorese durchgeführt.Beginnen Sie mit der Herstellung unmarkierter Proteinpulösungen für das präparative Gel, aus dem Proteinpunkte für jede Probe und die positive Kontrolle ausgeschnitten werden. Aliquotieren Sie 300 bis 350 Mikrogramm unmarkiertes Protein in 2D-Puffer und lassen Sie es in Kontakt mit dem IPG-Strip rehydrieren. Laden Sie anschließend die IPG-Strips und überführen Sie das markierte und das unmarkierte Protein in eine Rehydrierung.Bedecken Sie dann jede Vertiefung mit einem IPG-Reaktionsstreifen. Fügen Sie eine Überlagerung mit Mineralsöl hinzu und lassen Sie die Streifen über Nacht bei maximal 25 Grad Celsius passiv mit der Proteiniösung rehydratisieren. Führen Sie am nächsten Tag die isoelektrische Fokussierung der IPG-Streifen durch.Entfernen Sie dann das Öl und lagern Sie die IPG-Streifen bei minus 20 Grad Celsius, um die IPG-Streifen zu equilibrieren. Tauchen Sie sie 15 Minuten lang in Puffer zur Equilibrierung ein. Überführen Sie anschließend die Streifen in 4,7 % IDO-Acetamid im Equilibrierpuffer, ohne DTT, während die Streifen darin baden.Verwenden Sie ein großes 2D-Gelelektrophorese-System, um vier 12 % SDS-PAGE-Gele pro Probe auf fluoreszenzarmen Glasplatten für die markierten Proteine aufzutragen. Gießen Sie außerdem je ein 12 % SDS-PAGE-Gel in 1,5 Millimeter dicke Standardglasplatten für die unmarkierten Proteine. Dies sind die präparativen Gele.Nach dem Abkühlen der Gele die Streifen auf die Oberseite der Gele übertragen und die Streifen nach dem Abkühlen mit 0,5 % Aros bedecken; anschließend die Gele über Nacht bei 2,5 Watt und vier Grad Celsius laufen lassen und am nächsten Tag analysieren. Viele 2D-Reaktionen können mit Proteininproben durchgeführt werden, die für die präparativen Gele verwendet wurden. Weniger als 100 Mikrogramm Probe in 200 Mikroliter 2D-Puffer abmessen.Vortexen Sie die Probenmischungen anschließend kräftig und zentrifugieren Sie sie kurz. Geben Sie die Proben auf 11 cm lange IPG-Streifen und lassen Sie diese am folgenden Tag über Nacht passiv unter einer Schicht Mineralsöl rehydrieren. Führen Sie die isoelektrische Fokussierung durch.Danach die Streifen nacheinander durch drei Bäder mit Equilibrierungspuffer bewegen, jeweils 15 Minuten pro Bad. Anschließend werden die Streifen auf 2D-SDS-PAGE-Gelen laufen gelassen. Jeden Streifen auf ein vorgefertigtes Gel mit dem entsprechenden molekularen Gewicht auftragen.Polyacrylamid für das Protein der Interesse. Übertragen Sie anschließend die Gele auf eine NITROCELLULOSE-PVDF-Membran und analysieren Sie sie mit Antikörpern im Rahmen der Entwicklung dieses Protokolls. Drei verschiedene Lyseverfahren.Es wurden Puffer getestet. Zunächst ein gängiger biochemischer und molekularbiologischer Puffer. Tris-SDS wurde getestet.Tris-SDS wies im Vergleich zu einem anderen getesteten Puffer, UTS, eine schlechte Auflösung auf. Der dritte Puffer wurde als nicht testbar ausgeschlossen, da mit ihm keine Testproben hergestellt werden konnten. Anschließend wurden die Proteome von menschlichem und murinem Gehirn untersucht.Menschliche Kontrollcortexproben und AD-Cortexproben wurden verglichen. Maushirnproteine von Mäusen mit AD-ähnlicher Tau-Pathologie wurden ebenfalls anhand der menschlichen Probe untersucht. SCI zwei wurde unabhängig ausgewertet, ebenso wie S SI drei und sci fünf für jedes D. Die hohe Punktauflösung erleichterte die Ausrichtung.Mittels qualitativer Mini-2D-Analyse wurden posttranslationale Modifikationen untersucht, und eine Ligamentisierung von Alpha-Synuclein im AD-Gewebe wies ein normales Profil auf, wurde jedoch auch als Dimer gefunden, das mit einem Sternchen gekennzeichnet ist. Pfeile zeigen die Positionen an, an denen Alpha-Synuclein nachgewiesen wurde. Ubiquitiniertes amyloides Vorläuferprotein wurde ebenfalls mittels Mini-2D sichtbar gemacht.Spontanes AD wurde mit familiärem AD verglichen. Beim familiären AD sind Beta-Amyloid 1-42 und die ISO-Variante aufgrund der bei acht Kilodalton gefundenen Ligamerformen in ihrer Konzentration niedriger. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Proteom untersucht, um komplexe Proben durch die Messung von Proteinexpressionsveränderungen zu vergleichen.

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Forschung

JoVE Journal

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Neurowissenschaften

Die Identifizierung von Molekülen und Signalwegen, die die synaptische Plastizität und das Gedächtnis steuern, ist immer noch eine große Herausforderung in den Neurowissenschaften. Hier wird ein Arbeitsablauf beschrieben, der sich mit der relativen Quantifizierung von synaptischen Proteinen befasst, die angeblich an der molekularen Reorganisation von Synapsen während des Lernens und der Gedächtniskonsolidierung in einem auditorischen Lernparadigma beteiligt sind.

Hohe Auflösung Quantitative Synaptische Proteome Profilieren von Maus Hirnregionen Nach Auditory Diskriminierung Lernen

Eine abgekürzte Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn wird beschrieben.

Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn

Hier präsentieren wir Ihnen eine zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS) zu trennen und menschlichen Hypophysen Adenom Gewebe Proteom, stellt eine gute und reproduzierbare 2DE Muster identifizieren. Viele Proteine werden in jedem 2DE Fleck beobachtet, bei der Analyse von komplexen Krebs Proteome mit dem Einsatz von hochempfindlichen MS.

Zweidimensionaler Gelelektrophorese gekoppelt mit Massenspektrometrie Methoden für eine Analyse der menschlichen Hypophyse Adenom Gewebe Proteom

Hier beschreiben wir einen quantitativen Ansatz zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein im Verhältnis zu einer Marker Protein mit Immunfluoreszenz-Färbung, konfokalen Mikroskopie und Computer-basierte Analyse.

Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Diese Methode beschreibt, einen stabile und reproduzierbaren Ansatz für den Vergleich der Proteingehalte in verschiedenen Geweben und an verschiedenen Entwicklungsstörungen Zeitpunkten mit einem standardisierten quantitativen westlichen befleckenden Ansatz.

Robuste Vergleich der Proteingehalte in Gewebe und in der gesamten Entwicklung mit standardisierten quantitativen Western Blotting

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das nahezu infrarote Farbstoffe in Verbindung mit Immunhistochemie und hochauflösendem Scannen verwendet, um Proteine in Hirnregionen zu untersuchen.

Einsatz von Infrarot-Fluoreszenz und hochauflösendem Scannen zur Messung des Protein-Expression im Rodentrains

Das Protokoll zielt darauf ab, die Verwendung eines Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometers für die Mehrfachreaktionsüberwachung (MRM) von Proteinen aus klinischen Proben einzuführen. Wir haben einen systematischen Workflow von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse für klinische Proben mit allen notwendigen Vorsichtsmaßnahmen bereitgestellt.

Quantitativer Proteomik-Workflow mit multipler Reaktionsüberwachung basierender Detektion von Proteinen aus menschlichem Hirngewebe

Diese biochemische Reinigungsmethode mit massenspektrometriebasierter Proteomanalyse erleichtert die robuste Charakterisierung von Amyloidfibrillenkernen, was die Identifizierung von Zielen zur Vorbeugung der Alzheimer-Krankheit beschleunigen kann.

Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn

In diesem Artikel untersuchen wir die Auswirkungen der Theta-Burst TMS Stimulation auf die kortikale Plastizität bei Menschen leiden Fragile X-Syndrom und Einzelpersonen auf dem autistischen Spektrum.

TMS: Mit dem Theta-Burst-Protokoll zu Mechasnism der Plastizität in Individuen sich mit Fragile X-Syndrom und Autismus

Lernen Sie ein standardisiertes Proteinextraktionsprotokoll aus menschlichem und murinem Gehirngewebe für die Proteomanalyse mittels 2D-DIGE und Mini-2DE-Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Identifizierung von Proteinen und posttranslationalen Modifikationen.

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting (Video) | JoVE Journal

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

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