Name: Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-08T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Lernen Sie eine quantitative Laterallinien-Regenerationsanalyse für adulte Zebrafisch-Krankheitsmodelle. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Neuromasten- und Haarzellregeneration mit Gentamycin-induzierter Ablatio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Alle Verfahren werden nach den in &quot;Principles of Laboratory Animal Care&quot; beschriebenen Richtlinien durchgeführt (National Institutes of Health Veröffentlichung nicht. 85-23, überarbeitet 1985) und der genehmigte Rosalind Franklin Universität Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss Tier Protokoll 08-19. 1. Gentamicin-Induktion von Haarzell Nekrose <ol><li> Vorbereitung Gentamicinsulfat in normaler Salzlösung in einer Endkonzentration von 0,004% (4,32 mM). </li><li> Zeigen erwachsenen Fischen (D. rerio, 4-6 Monate alt) in einem Behälter, der die 0,004% (4,32 mM), Gentamicin-Lösung. Einem Behälter verwendet werden, aber wir von einem Pharmacal Wasser-System, das in 7 breit, 6 in hohen und lang ist in 7 mit einem Fischbehälter. Stellen Sie den Behälter mit Fisch in einem Brutschrank bei 28 ° C für 24 h eingestellt. Stellen Sie das gesamte Fluidvolumen in dem Tank auf einem ausreichenden Niveau, um Fische in einem lebensfähigen Zustand für den Zeitraum von 24 Std. erhalten. Hinweis: Die Belüftung des Gentamicin-Flüssigkeit nicht necessar Falls genügend Volumen für die Anzahl der zu behandelnden Fisch verwendet. </li></ol> 2. Vital Färbung der Haarzellen <ol><li> Vorbereitung einer 0,08% Konzentration (in normaler Kochsalzlösung) des Fluoreszenzvitalfarbstoff [4-4-Diethylaminostyryl)-N-methylpyridiniumiodid (485 nm Anregung und 603 nm, λ Emission λ in Methanol) von einer Arbeitsstammlösung von 15 mg / ml in Ethanol. </li><li> Um festzustellen, ob die Behandlung wirksam war Gentamicin eine Teilmenge der Kontrolle und Gentamicin behandelten Fische werden sofort, indem sie Fische in der Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte, die den Vitalfarbstoff angefärbt. Verwenden Sie eine ausreichende Anzahl von Fischen (und Kulturplatten für statistische Signifikanz erreicht werden benötigt. Basierend auf der Prüferin Geschwindigkeit von Neuromasten zählen, den Fisch in den Platten gestaffelt im Laufe der Zeit, so dass die Fische nicht mehr als 75 min angefärbt wie in Schritt 2.3 beschrieben. </li><li> Legen Sie die Platten aus Schritt 2.2 in einer Tischschublade von dem Fluoreszenzmikroskopzur Untersuchung von gefärbten Neuromasten verwendet werden. Schalten Sie die Raumbeleuchtung auf Löschung der Vitalfarbstoff über die 1 Stunde Färbung Zeitraum bei Raumtemperatur zu verhindern. </li><li> Bereiten Sie sowohl Farbstoff Wash-out-und Anästhesiewassertanks. Dye Wash-out-Wasser ist normal, Wasser und Fisch für Narkose Wasser, fügen Sie genügend 2-Phenoxyethanol, so dass eine 1:1000 Verdünnung in normalen Fischwasser erreicht. </li><li> Zeigen Fisch über normale Fische, um überschüssiges Wasser spülen Vitalfarbstoff, und fahren Sie zur Beobachtung der Vitalfarbstoff angefärbt Fisch Schritt 3.1. </li><li> Um die Regeneration der Neuromasten zu untersuchen, zu übertragen Gentamicin-behandelte Fische, die in normalen Fischwasser in einen Inkubator für zwischen 8-16 h bei 28 ° C gewaschen </li><li> Zu verschiedenen Zeitpunkten zwischen 8-16 h werden die Fische aus dem Inkubator entfernt, gewaschen und gefärbt, wie in den Schritten 2.1-2.4 angegeben. Gehen Sie zur Beobachtung der Vitalfarbstoff angefärbt Fisch Schritt 3.1. </li></ol> 3. Anästhesie Fisch und Fluorescent Auszählung der Neuromasten <ol><li&gt; Tupfen Sie jeden Fisch auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und dann legen Sie sie auf einem feuchten Stück Filterpapier, das auf dem Deckel einer Petrischale aus Kunststoff zentriert ist. </li><li> Setzen Sie den Deckel auf der Bühne eines Fluoreszenzstereomikroskop, um ein digitales Bild der Vitalfarbstoff gefärbten Neuromasten der Mitte der Körper Stiche erhalten. </li><li> Verwenden Sie eine Digitalkamera auf dem Fluoreszenzstereomikroskop gelegt gesetzt eine Vergrößerung von 2X, um Bilder für die anschließende quantitative Analyse zu erfassen. Hinweis: Die Vergrößerungseinstellung des Stereomikroskops kann auf die Marke von Mikroskop verwendet werden, hängen, aber die Einstellung ist die einfache Anzeige und Zählung der einzelnen Neuromasten in der Mitte der Körper Stiche zu ermöglichen. </li><li> Bestimmung der Regenerationsmenge durch Zählen der Anzahl sichtbarer Neuromasten in den vier benannten Maschen auf der untersten Bauchseite des Fisches proximal der rechten Brustflosse (siehe Abbildung 1). Für die statistische Analyse verwenden Sie eine geeignete Test wie ANOVA or des Student-T-Test. Experimente sollte ein Minimum von 5 Fische pro Zeitpunkt nutzen und alle Experimente sollte mindestens 3x wiederholt werden. </li><li> Basierend auf der Neuromasten Regenerationszeit-Kurve (siehe Abbildung 3), zählen Neuromasten zwischen 8-16 Stunden nach Gentamicin-wash-out innerhalb der linearen Phase der Regeneration Kurve. Hinweis: Die Verwendung der linearen Zeitphase ermöglicht die richtige quantitative Analyse zwischen der Kontroll-und Versuchsgruppen. </li></ol> 4. Fluorescent Zählen einzelner Haarzellen zur Gewinnung Höhere Auflösung des Quantitative Analyse, wenn die Neuromasten Analyse statistisch nicht signifikant <ol><li> Wenn die quantitative Analyse auf der Ebene der Neuromasten nicht signifikant ist, kann die Analyse auf der Ebene der einzelnen Haarzellen auch verwendet werden, um eine höhere Auflösung zu erhalten. Wählen Fisch zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Gentamicin-wash-out (Zeitpunkt auf der Basis der früheren Studien Neuromasten), Vitalfarbstoff stain den Fisch in Protokoll 2 beschrieben, und einschläfern den Fisch mit 2-Phenoxyethanol in einer Verdünnung von 1:500 für 1-5 min dann. </li><li> In gedämpftem Licht zu Abschrecken zu vermeiden, stellen vier Einschnitte, so dass ein Quadrat Hautlappen Zubereitung wird wie folgt hergestellt. Einen Einschnitt entlang der oberen Rippen der Fische, bis es mit den Afterflossen ausgerichtet ist, dann machen Sie einen Schnitt über den Bauch und schließlich, stellen zwei vertikale Schnitte auf jeder Seite dieser Einschnitte, so das Quadrat Hautlappen wird erstellt. Hinweis: Diese Vorbereitung der Haut wird die Mitte Körper Stiche in den Neuromasten Experimente verwendet zu integrieren. </li><li> Legen Sie die Hautprobe auf einem Objektträger und legen Sie dann einen kreisförmigen Deckglas über die Haut ausgeschnitten Probe Anker helfen und glätten das Gewebe für die anschließende digitale Bildbearbeitung. </li><li> Mit den Hautproben von Schritt 4.3, erhalten digitale Bilder von den Haarzellen in jedem Neuromasten der Mitte der Körper Stiche. Nehmen Sie Bilder mit einer Vergrößerung von mindestens 60X und dann zählen die Haare cells innerhalb einzelner Neuromasten für vergleichende quantitative Analyse der Kontroll-und Versuchsgruppen (siehe Abbildung 4). </li></ol>

<ol><li>Dambly-Chaudire, C., Sapde, D., Soubiran, F., Decorde, K., Gompel, N., Ghysen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lateral+Line+of+Zebrafish%3A+a+Model+System+for+the+Analysis+of+Morphogenesis+and+Neural+Development+in+Vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The Lateral Line of Zebrafish: a Model System for the Analysis of Morphogenesis and Neural Development in Vertebrates.</a> Biol. Cell. 95 (9), 579-587 (2003).</li>
<li>Montgomery, J., Carton, G., Voigt, R., Baker, C., Diebel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+Processing+of+Water+Currents+by+Fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+Royal+Soc.+London+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensory Processing of Water Currents by Fishes.</a> Phil. Trans. Royal Soc. London B Biol. Sci. 355 (1401), 1325-1327 (2000).</li>
<li>Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W., Whitfield, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ototoxin-Induced+Cellular+Damage+in+Neuromasts+Disrupts+Lateral+Line+Function+in+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">Ototoxin-Induced Cellular Damage in Neuromasts Disrupts Lateral Line Function in Larval Zebrafish.</a> Hearing Res. 284 (1-2), 1-2 (2012).</li>
<li>Engelmann, J., Hanke, W., Mogdans, J., Bleckmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Stimuli+and+the+Fish+Lateral+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Stimuli and the Fish Lateral Line.</a> Nature. 408 (6808), 51-52 (2000).</li>
<li>Olszewski, J., Haehnel, M., Taguch, M., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Larvae+Exhibit+Rheotaxis+and+Can+Escape+a+Continuous+Suction+Source+Using+Their+Lateral+Line%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line.</a> PloS One. 7 (5), e36661(2012).</li>
<li>Raible, D. W., Kruse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+Lateral+Line+System+in+Embryonic+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization of the Lateral Line System in Embryonic Zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 421 (2), 189-198 (2000).</li>
<li>Coffin, A. B., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. Extracellular Divalent Cations Modulate Aminoglycoside-Induced Hair Cell Death in the Zebrafish Lateral. 253 (1-2), 1-2 (2009).</li>
<li>Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).</li>
<li>Ma, E. Y., Rubel, E. W., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+Signaling+Regulates+the+Extent+of+Hair+Cell+Regeneration+in+the+Zebrafish+Lateral+Line%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Notch Signaling Regulates the Extent of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral Line).</a> J. Neurosci. 28 (9), 2261-2273 (2008).</li>
<li>Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feathers+and+Fins%3A+Non-Mammalian+Models+for+Hair+Cell+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Feathers and Fins: Non-Mammalian Models for Hair Cell Regeneration.</a> Brain Res. 1277, 12-23 (2009).</li>
<li>Bibliowicz, J., Tittle, R. K., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+Better+Understanding+of+Human+Eye+Disease+Insights+From+the+Zebrafish%2C+Danio+Rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Toward a Better Understanding of Human Eye Disease Insights From the Zebrafish, Danio Rerio.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 100, 287-330 (2011).</li>
<li>Mione, M. C., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+As+a+Model+for+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish As a Model for Cancer.</a> Dis. Model. Mech. 3 (9-10), 9-10 (2010).</li>
<li>Norton, W., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Zebrafish+As+a+Model+Organism+for+Behavioural+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult Zebrafish As a Model Organism for Behavioural Genetics.</a> BMC. Neurosci. 11, (2010).</li>
<li>Mathur, P., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Zebrafish+As+a+Model+to+Understand+Mechanisms+of+Addiction+and%5BTitle%5D)+AND+%22Complex+Neurobehavioral+Phenotypes.+Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Use of Zebrafish As a Model to Understand Mechanisms of Addiction and.</a> Complex Neurobehavioral Phenotypes. Neurobiol. Dis. 40 (1), 66-72 (2010).</li>
<li>Ignatius, M. S., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+As+a+Model+for+Cancer+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Zebrafish As a Model for Cancer Self-Renewal.</a> Zebrafish. 6 (4), 377-387 (2009).</li>
<li>Milan, D. J., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Genetic+Models+for+Arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Biophys.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Genetic Models for Arrhythmia.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 98 (2-3), 2-3 (2008).</li>
<li>Van Trump, W. J., Coombs, S., Duncan, K., McHenry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentamicin+Is+Ototoxic+to+All+Hair+Cells+in+the+Fish+Lateral+Line+System%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Gentamicin Is Ototoxic to All Hair Cells in the Fish Lateral Line System.</a> Hear. Res. 261 (1-2), 1-2 (2010).</li>
<li>Littleton, R. M., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+Nontraditional+Model+of+Traditional+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a Nontraditional Model of Traditional Medicine.</a> J. Ethnopharmacol. 145 (3), 677-685 (2013).</li>
<li>Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).</li>
<li>Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Larvae+Exhibit+Rheotaxis+and+Can+Escape+a+Continuous+Suction+Source+Using+Their+Lateral+Line%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line).</a> PLoS One. 7 (5), 36661-36 (2012).</li>
<li>Liang, J., Wang, D., Renaud, G., Wolfsberg, T. G., Wilson, A. F., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stat3%2FSocs3a+Pathway+Is+a+Key+Regulator+of+Hair+Cell+Regeneration+in+Zebrafish+%5BCorrected%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Stat3/Socs3a Pathway Is a Key Regulator of Hair Cell Regeneration in Zebrafish [Corrected.</a> J. Neurosci. 32 (31), 10662-10673 (2012).</li>
<li>Nakae, M., Asaoka, R., Wada, H., Sasaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Dye+Staining+of+Neuromasts+in+Live+Fishes%3A+An+Aid+to+Systematic+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Ichthyol+Res%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Dye Staining of Neuromasts in Live Fishes: An Aid to Systematic Studies.</a> Ichthyol Res. , 286-290 (2012).</li>
<li>Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Probes+That+Stain+Living+Nerve+Terminals%5BTitle%5D)+AND+%22The+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Probes That Stain Living Nerve Terminals.</a> The J. Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).</li>
<li>Owens, K. N., Coffin, A. B., Hong, L. S., Bennett, K. O., Rubel, E. W., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Mechanosensory+Hair+Cells+of+the+Zebrafish+Lateral+Line+to+Aminoglycosides+Reveals+Distinct+Cell+Death+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Response of Mechanosensory Hair Cells of the Zebrafish Lateral Line to Aminoglycosides Reveals Distinct Cell Death Pathways.</a> Hear. Res. 253 (1-2), 1-2 (2009).</li>
<li>Namdaran, P., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. Identification of Modulators of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral. 32 (10), 3516-3528 (2012).</li>
<li>Herrera, A. A., Banner, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+and+Effects+of+Vital+Fluorescent+Dyes%3A+Observation+of+Motor+Nerve+Terminals+and+Satellite+Cells+in+Living+Frog+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">The Use and Effects of Vital Fluorescent Dyes: Observation of Motor Nerve Terminals and Satellite Cells in Living Frog Muscles.</a> J. Neurocytol. 19 (1), 67-83 (1990).</li>
<li>Hickey, P. C., Jacobson, D., Read, N. D., Louise Glass,, L, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+of+Vegetative+Hyphal+Fusion+in+Neurospora+Crassa%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal.+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging of Vegetative Hyphal Fusion in Neurospora Crassa.</a> Fungal. Genet. Biol. 37 (1), 109-119 (2002).</li>
<li>Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limb+Regeneration+Is+Impaired+in+an+Adult+Zebrafish+Model+of+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Limb Regeneration Is Impaired in an Adult Zebrafish Model of Diabetes Mellitus.</a> Wound Repair Regen. 18 (5), 532-542 (2010).</li>
<li>Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+Transmission+of+Diabetic+Metabolic+Memory+in+Zebrafish+Correlates+With+DNA+Hypomethylation+and+Aberrant+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression.</a> Diabetes. 61 (2), 485-491 (2012).</li>
</ol>

Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium der Iacocca Family Foundation, der National Institutes of Health Grant DK092721 (an R.V.I.) und Startkapital der Rosalind Franklin University unterstützt. Es wurden keine potenziellen Interessenkonflikte gemeldet, die für diesen Artikel relevant sind. G.C.P., S.M.M. und N.D. recherchierten Daten. M.P.S. Jr. und RI beaufsichtigten das Projekt, trugen zur Diskussion der Daten bei und beaufsichtigten das Schreiben und Lektorat des Manuskripts.

Basierend auf den umfangreichen Bestand an Literatur, die für die Analyse der Seitenlinie (LL) Regeneration in embryonalen und larvalen Zebrafisch 8,24,25 festgestellt wurde, das Ziel unserer Studie war es, einen quantitativen Test zur Seitenlinie Regeneration im Zebrafisch zu entwickeln, könnte Krankheitsmodelle, die am besten in der erwachsenen Fische untersucht werden angewendet werden. Wir haben festgestellt, dass bestimmte kritische Punkte sind wichtig, wenn Anwendung von Verfahren für die embryonale / F...

Die Seitenlinie (LL)-System ist ein mechanosensorischen Orgel in beiden Fische und Amphibien, die für Gehör, Gleichgewicht, rheotaxis und vermittelnde Verhaltensweisen wie Schul-und Raubvermeidung 5.1 verantwortlich ist gefunden. Es wird der Cluster von Haarzellen von Stützzellen umgeben sind, sind die beide in Strukturen genannt Neuromasten 6 angeordnet. Diese Neuromasten sind in der Regel in vertikalen Linien entlang der Längsachse des Körpers und der Schwanz mit einigen im Kopf der Fische beobachtet horizontale Stiche organisiert (genannt Stiche). Beim Erwachsenen sind Neuromasten in der Anzahl deutlich größer innerhalb der Stiche im Vergleich zu embryonalen oder Fischlarven 6. Biomedizinische Studien haben in Zebrafisch über die Wirkung der Behandlung mit Antibiotika, lärmbedingtem Trauma, chronische Infektion, usw. konzentriert. Haarzellen auf 7,8 in einem Versuch, besser ihre Wirkung beim Menschen zu verstehen. Anders als die meisten Wirbeltiere, teleosts wie Zebrafisch (Danio rerio), haben die Fähigkeit, verlorene Haarzellen zu regenerieren. Zebrafische sind wegen ihrer schnellen Entwicklungszeit und hohe Regenerationsfähigkeit besonders geeignet. Bis heute ist jedoch; Zebrafisch-Studien an der Seitenlinie Entwicklung und / oder der Regeneration haben vor allem die Embryonal-und Larvenstadium Fisch aufgrund der reduzierten Anzahl der Seitenlinie Neuromasten, die für einfachere Zählung und Analyse ermöglicht 6,9,10 genutzt. Allerdings sind viele Zebrafisch-Modelle von neurologischen und nicht-neurologischen Erkrankungen 11-16 in der erwachsenen Fische und nicht die Larven untersucht, konzentrierten wir uns auf die Entwicklung einer Seitenlinie regenerative Test bei erwachsenen Zebrafisch mit Gentamicin (ein Aminoglykosid zuvor in Zebrafisch-Larven und neuerdings mit 17 erwachsenen Fischen verwendet wird), so dass ein Test zur Verfügung, dass den aktuellen erwachsenen Zebrafisch-Krankheitsmodelle angewandt werden könnten. Während früher durch Van Trump e veröffentlichten Verfahrent al. 17. wurden die Bedingungen für die Haarzell Ablation in der erwachsenen Fische, haben sie nicht eine Standardkurve für Neuromasten, die Regeneration für die quantitative Vergleich zwischen Kontroll-und Versuchsgruppen wie bei der Verwendung von transgenen Zebrafischlinien oder pharmakologisch induzierten Krankheitszuständen erforderlich ist, zu etablieren 18 im Zebrafisch. Wir haben daher die Verfahren, gefolgt von Van Trump et al. Für 17 Haarzelle Ablation, aber auf ihre Arbeit gebaut, um eine Standardkurve von Neuromasten Regeneration Ermittlern ermöglichen, unsere Daten, wie mit erwachsenen Zebrafisch Krankheitsmodelle beim Vergleich Kontroll-und Versuchsgruppen einsetzen . Der Assay wurde auch entworfen, um Erweiterung der Analyse auf die einzelnen Haarzelle zu ermöglichen, wenn eine höhere Auflösung erforderlich ist.

<table><tbody><tr><td>Gentamicinsulfatlösung (50 mg/ml)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>2 Phenoxyethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>4-4-Diethylaminostryl-N-methylpyridiniumiodid (4-Di-2-Asp) in Methanol</td><td>Aldrich</td><td>D-3418</td><td>485 nm Anregung &lambda; und 603 nm Emission &lambda;</td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Mid Sci</td><td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterschalen mit Glasboden</td><td>Matek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Präparieren&nbsp; Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TMZ-1500</td><td>Jedes Präpariermikroskop ist in Ordnung.</td></tr><tr><td>Kamera für die Bildgebung</td><td>Nikon</td><td>Q Bildgebung</td><td>Jede Kamera ist geeignet.</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institutes of Health</td><td>NIH Image</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>Jede Bildgebungssoftware ist geeignet.</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV10i</td> Jedes hochauflösende <td>Fluoreszenzmikroskop ist geeignet</td></tr><tr><td>Aquatic System</td><td>KG Aquatics ZFS Rack System</td><td></td><td>Jedes aquatische System kann verwendet werden</td></tr></tbody></table>

ein test für laterallinie regeneration im erwachsenen zebrafisch

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Aufgrund der klinischen Bedeutung von Hör-und Gleichgewichtsstörungen bei Menschen, Modellorganismen wie Zebrafisch wurden zur Seitenlinie Entwicklung und Regeneration zu studieren. Der Zebrafisch ist wegen seiner schnellen Entwicklungszeit und die hohe Regenerationsfähigkeit für solche Untersuchungen besonders attraktiv. Bisher wurden Zebrafisch-Studien Seitenlinie Regeneration vor allem wegen der geringeren Anzahl von Neuromasten in diesen Phasen genutzt Fische der Embryonal-und Larvenstadien. Dies hat quantitative Analyse der Seitenlinie Regeneration und / oder der Entwicklung leichter in den früheren Entwicklungsstadien gemacht. Da viele Zebrafisch Modelle von neurologischen und nicht-neurologischen Krankheiten im erwachsenen Fisch und nicht im Embryo / Larven untersucht, auf die Entwicklung eines quantitativen Seitenlinie regenerative Assay in erwachsenen Zebrafisch konzentrierten wir uns damit wurde ein Assay zur Verfügung, um Strom angelegt werden kann erwachsenen Zebrafisch Krankheitsmodelle. Aufbauend auf früheren Studien von Van TrumS. et al 17, dass die Verfahren zur Ablation von Haarzellen im erwachsenen mexikanischen blinde Höhlenfische und Zebrafisch (Danio rerio) beschrieben. wurde unser Test zur quantitativen Vergleich zwischen Kontroll-und Versuchsgruppen zu ermöglichen. Dies wurde durch die Entwicklung eines regenerativen Neuromasten Standardkurve, basierend auf dem Prozentsatz der Neuromasten Wieder über einen 24 Stunden Zeitraum nach Gentamicin-induzierte Nekrose von Haarzellen in einem definierten Bereich der Seitenlinie erreicht. Der Assay wurde auch entworfen, um Erweiterung der Analyse auf die einzelnen Haarzellebene, wenn eine höhere Auflösung erforderlich ist, zu ermöglichen.

Optimierung der Verfahren zur Quantifizierung von Neuromasten Regeneration der Seitenlinie bei erwachsenen Zebrafisch. Die Neuromasten von Zebrafisch-Larven sind leicht quantifizierbar; jedoch hat die Seitenlinie des erwachsenen Zebrafisch eine viel größere Anzahl von Neuromasten pro Stich Herstellung quantitative Analysen schwieriger 6,17,19,20. Wie in 1A zu sehen ist, hat der Kopf eine deutlich höhere Anzahl von Neuromasten im Vergleich zu entwe...

Da viele Zebrafisch-Modellen der neurologischen und nicht-neurologischen Erkrankungen sind in der erwachsenen Fischen nicht der Embryo / Larven untersucht, entwickelten wir eine quantitative Seitenlinie regenerative Assay, die erwachsenen Zebrafisch Krankheitsmodelle angewendet werden können. Der Test beteiligt Beschluss der 1) Neuromasten und 2) einzelne Haarzelle Ebenen.

Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen quantitativen Nachweis für die Regeneration der Seitenlinie zu entwickeln, der auf ein Erwachsenen-Zebrafisch-Krankheitsmodell angewendet werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst die Seitenlinie erwachsener Zebrafische durch eine 24-stündige Behandlung mit Gentamycin abgetötet wird. Anschließend wird das Gentamycin ausgespült, und die Fische erhalten die Möglichkeit, ihre Neuromasten über unterschiedliche Zeiträume im Frischwasser regenerieren zu lassen.Die Fische werden anschließend mit einem Vitalfarbstoff gefärbt, um die Regeneration der Seitenlinie zu definierten Zeitpunkten sichtbar zu machen. Um zu bestätigen, dass das Medikament wirksam zur Ablation der Neuromasten eingesetzt wurde, sollten einige Fische unmittelbar nach dem Ausspülen von Gentamycin gefärbt werden. Anschließend werden die Neuromasten der Seitenlinien an Fischen oder Hautpräparationen anhand von Bildern gezählt, die mit einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop aufgenommen wurden.Schließlich werden die experimentellen Gruppen mithilfe einer standardisierten Regenerationskurve für neuromastale Zellen quantitativ mit der Kontrollgruppe verglic

an-assay-for-lateral-line-regeneration-in-adult-zebrafish

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nach Durchtrennung des Rücken, erwachsenen Zebrafisch haben die funktionelle Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der Larven Transparenz und schnellere Erholung zu nehmen, stellen wir ein Verfahren zur Durchtrennung des Rückenmarks Larven. Nach Durchtrennung beobachten wir sensorischen Erholung ab 2 Tage nach der Verletzung, und C-Bogen-Bewegung um 3 Tage nach der Verletzung.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Um die zellulären und molekularen Mechanismen der Neurogenese und Regeneration adulter Zebrafische zu beleuchten, haben wir ein Protokoll für invasive Operationen entwickelt, die mechanische Verletzungen im adulten Telencephalon des Zebrafisches verursachen, und die anschließende Überwachung von Veränderungen in der gestochenen Hemisphäre durch Immunhistochemie oder in situ Hybridisierung.

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erfassung der Dynamik der Regeneration von Schwanzflossen von Zebrafischlarven auf einer Ganzgewebeskala mit Hilfe von Hellfeld-basierter Stereomikroskopie. Diese Technik ermöglicht es, die Regenerationsdynamik mit einer Einzelzellauflösung zu erfassen. Diese Methodik kann an jedes Stereomikroskop angepasst werden, das mit einer CCD-Kamera und einer Zeitraffer-Software ausgestattet ist.

Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

Hier skizzieren wir den Arbeitsablauf für die Verwendung des TetON-Systems, um eine gewebespezifische Genexpression in der adulten regenerierenden Zebrafisch-Schwanzflosse zu erreichen.

Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

Laserablation ist eine weit verbreitete Technologie zur Untersuchung der Regeneration in biologischen Systemen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt den Einsatz eines Standard-Laserscanning-Konfokalmikroskops zur Laserablation und anschließender Zeitraffer-Bildgebung regenerierender Interneuromastzellen in der Zebrafisch-Seitenlinie.

Konfokale Mikroskop-basierte Laserablation und Regenerationstest in Zebrafisch Interneuromastzellen

Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, die bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie beeinträchtigt sind, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Der erwachsene Zebrafisch ist in der Lage, sich nach einer Rückenmarksverletzung funktionell zu erholen und ist ein erstklassiges Modellsystem zur Aufklärung der angeborenen Mechanismen der neuronalen Regeneration. Hier beschreiben wir Schwimmausdauer- und Schwimmverhaltensassays als funktionelle Auslesungen der Rückenmarksregeneration.

Beurteilung der Schwimmausdauer und des Schwimmverhaltens bei erwachsenen Zebrafischen

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion gewebespezifischer und hochreproduzierbarer Verletzungen in Zebrafischlarven unter Verwendung eines Laserläsionssystems in Kombination mit einer automatisierten mikrofluidischen Plattform für die Larvenhandhabung.

Kontrollierte halbautomatische laserinduzierte Verletzungen zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischlarven

Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme und Visualisierung von elasmoiden Schuppen von Zebrafischen während der in vivo Regeneration. Darüber hinaus wird die ex vivo Kultur dieser Schuppen für bis zu 7 Tage nach der Ernte vorgestellt.

Regeneration von Zebrafischschuppen in Toto- und Ex-vivo-Schuppenkultur

Hier zeigen wir, wie retro-orbitalen Injektion bei erwachsenen Zebrafisch zu tun.

Retro-Orbital-Injection in Adult Zebrafisch

Lernen Sie eine quantitative Laterallinien-Regenerationsanalyse für adulte Zebrafisch-Krankheitsmodelle. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Neuromasten- und Haarzellregeneration mit Gentamycin-induzierter Ablatio.

Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch

Weitere Videos entdecken