Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Entwicklung eines quantitativen Assays zur Regeneration von Seitenlinien, der auf ein Modell der adulten Zebrafischkrankheit angewendet werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst die Seitenlinie erwachsener Zebrafische abgetragen wird, indem sie 24 Stunden lang mit Gentamycin behandelt werden. Als nächstes wird das Gentamycin ausgewaschen und die Fische dürfen ihre Neuromasten verschiedene Male im Süßwasser regenerieren.

Die Fische werden dann mit einem vitalen Farbstoff gefärbt, um die Wiederherstellung der Seitenlinien zu bestimmten Zeitpunkten zu visualisieren. Um zu bestätigen, dass das Medikament bei der Ablation von Neuromasten wirksam war, sollten einige Fische unmittelbar nach dem Auswaschen von Gentamycin gefärbt werden. Dann werden die Neuromasten der Seitenlinien an Fischen oder Hautpräparaten anhand von Bildern gezählt, die mit einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop aufgenommen wurden.

Abschließend werden die Versuchsgruppen quantitativ mit der Kontrollgruppe verglichen, wobei eine regenerative Neuromast-Standardkurve verwendet wird. Letztendlich wird die Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie verwendet, um die Regeneration der Seitenlinie in erwachsenen Zebrafisch-Krankheitsmodellen zu überwachen. Wir haben diese Technik entwickelt, um einen quantitativen Assay für die Untersuchung der neuronalen Regeneration in erwachsenen Zebrafisch-Krankheitsmodellen bereitzustellen Um Haarzellnekrose zu induzieren, beginnen Sie mit der Zugabe einer Lösung von 50 Milligramm pro Milliliter Gentamycinsulfat in Fischwasser bis zu einer Endkonzentration von 0,004 %Unter Verwendung eines Behälters, der groß genug ist, um vier bis sechs Monate alte Zebrafische ohne Belüftung zu beherbergen, Füllen Sie es mit Gentamycin-Lösung.

Legen Sie den Fisch hinein und brüten Sie ihn 24 Stunden lang bei 28 Grad Celsius. Bereiten Sie ein Aquarium mit normalem Fischwasser vor, um das Gentamycin auszuwaschen. Nach dem Auswaschen des Gentamycins legen Sie den Fisch in normales Fischwasser und stellen Sie ihn für acht bis 16 Stunden aus einer 15 Milligramm pro Milliliter Arbeitsstofflösung des fluoreszierenden Vitalfarbstoffs in den 28 Grad Celsius heißen Inkubator zurück.

Vier Dathyl-Amino-Styro und Methylperidiumiodid oder vier Farbstoffe zwei A. Bereiten Sie eine Konzentration von 0,08 % im Fischwasser vor Nach der festgelegten Erholungszeit nach der Gentamycin-Behandlung legen Sie jeden Fisch in die Vertiefung einer Kulturplatte mit sechs Vertiefungen, die den lebenswichtigen Farbstoff enthält. Decken Sie die Platten ab und legen Sie sie in eine Tischschublade neben dem Fluoreszenzmikroskop, um verschmutzte Neuromasten zu untersuchen. Schalten Sie das Licht aus, um ein Löschen des lebenswichtigen Farbstoffs zu verhindern, und inkubieren Sie es eine Stunde lang zur gewählten Stunde, nachdem das Gentamycin ausgewaschen wurde.

Betäuben Sie jeden Fisch, indem Sie ihn in Narkosewasser legen und warten Sie, bis seine Schwimmbewegung etwa ein bis zwei Minuten aufhört. Tupfen Sie dann jeden Fisch auf ein Papiertuch und legen Sie ihn auf ein Stück angefeuchtetes Filterpapier, das mittig auf dem Deckel einer Plastikpetrischale liegt. Legen Sie dann den Deckel auf den Tisch eines fluoreszierenden Stereomikroskops und verwenden Sie die zweifache Vergrößerung, um Bilder für die quantitative Analyse aufzunehmen. Um das Ausmaß der Regeneration zu bestimmen, zählen Sie die Anzahl der sichtbaren Neuromasken innerhalb der vier dafür vorgesehenen Stiche auf der untersten ventralen Seite des Fisches direkt neben der rechten Brustflosse.

Verwenden Sie den T-Test oder die ANOVA des Schülers für die statistische Analyse und wiederholen Sie alle Experimente dreimal mit mindestens fünf Fischen pro Versuch. Wenn die quantitative Analyse auf der Ebene des Neuromastes nicht signifikant ist, kann die Analyse auf der Ebene der einzelnen Haarzelle auch verwendet werden, um einen höheren Auflösungsgrad zu erzielen. Nachdem Sie die Fische gefärbt und ausgewaschen haben, verwenden Sie eine Verdünnung von zwei Phenoxyethanol von eins bis 500, um sie unter gedämpftem Licht einzuschläfern.

Machen Sie einen Schnitt quer über den Bauch und machen Sie zwei vertikale Schnitte auf jeder Seite der ersten beiden Schnitte. Machen Sie dann einen quadratischen Hautlappen, indem Sie einen Schnitt entlang der oberen Rippen des Fisches machen, bis er mit den Analflossen ausgerichtet ist. Legen Sie die Hautprobe auf einen Objektträger, legen Sie Aros darauf und legen Sie dann einen kreisförmigen Glasabdeckschirm darüber, um das Gewebe zu verankern und abzuflachen.

Für die anschließende digitale Bildgebung. Verwenden Sie ein 60-fach-Objektiv, um digitale Bilder der Haarzellen in jedem Neuromast der Mittelkörperstiche aufzunehmen. Zählen Sie dann die Haarzellen in einzelnen Neuromasken für die vergleichende und quantitative Analyse der Kontroll- und Versuchsgruppen.

Wie hier zu sehen ist, hat der Zebrafischkopf eine signifikant höhere Anzahl von Neuromasten im Vergleich zum Mittelteil oder zum Schwanz, wobei die Schwanzregion die geringste Anzahl von Neuromasken aufweist, wie in diesem Bild gezeigt. Da das Muster der Stiche im Kopf kompliziert und in der Anzahl der Neuromasken deutlich größer ist, eignete es sich nicht als Region für eine quantitative Analyse. Darüber hinaus war unabhängig von der getesteten Gentamycin-Konzentration eine vollständige Ablation von Neuromasken im gesamten Kopf selten möglich, so dass nach der Behandlung mit Gentamycin, wie zuvor berichtet, Flecken von Neuromasken beobachtet wurden.

Im Gegensatz dazu hat der Schwanz zwei wenige Neuromasken, und als solche wählten wir die Körpermittelregion aus, um die Regeneration des Neuromastes quantitativ zu analysieren. Bei den Erwachsenen in dieser Region identifizierten wir vier Stiche direkt hinter der lateralen Brustflosse, die bei allen Erwachsenen in der Anzahl der Neuromasten konsistent waren. Wichtig ist, dass wir in der Lage waren, die Neuromasten dieser Region durch eine 24-Stunden-Behandlung mit 0,004 % Gentamycin, wie zuvor berichtet, konsistent und vollständig abtragen, was eine anschließende genaue Bestimmung der Neuromastregeneration ermöglichte, wie in dieser Abbildung gezeigt. Die Regeneration wurde überwacht, nachdem alle Neuromasken innerhalb der vier Mittelkörperstiche nach einer 24-stündigen Gentamycin-Behandlung abgetragen wurden, und die positive Regeneration wurde durch das Auftreten von mindestens drei Neuromasten innerhalb einer Stich bis acht Stunden nach Gentamycin.

Etwa ein Drittel der Fische zeigte Anzeichen einer Erholung. Obwohl, wie hier zu sehen ist, die Intensität der Neurome in den regenerierenden Stichen schwach war. Die Anzahl der Neuromasten und ihre Intensität nahmen linear weiter zu, bis die Regeneration 16 Stunden nach Gentamycin ein Plateau erreichte.

Wenn die Ergebnisse der Neuromanalyse zwischen der Kontroll- und der Versuchsgruppe statistisch nicht signifikant sind, kann man diese Studien auf die Ebene der einzelnen Haarzellen ausdehnen, um einen höheren Auflösungsgrad für quantitative Vergleiche bei acht Stunden, 10 Stunden und 12 Stunden Regenerationszeit zu erhalten. Wir fanden heraus, dass die Kontrollgruppen einen Bereich von null bis vier Haarzellen pro Neuromast im mittleren Körperbereich aufwiesen, wie es für Kontrollgruppen bei der quantitativen Analyse zu erwarten war. Es wurde kein statistischer Unterschied zwischen den Neuromen in Bezug auf die Anzahl der Haarzellen pro Neuromast zu diesen Zeitpunkten festgestellt.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich immer der Zeit bewusst zu sein. Lassen Sie den Fisch nicht länger als 24 Stunden in Genamicin oder lebenswichtigen Farbstoff länger als 75 Minuten nach seiner Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der regenerativen Medizin den Weg, die Regeneration der Seitenlinien im Krankheitszustand im Vergleich zum Normalzustand und dem Zebrafischmodell zu untersuchen.