Name: Identifizierung neuer Gene, die mit Alginat-Produktion verbunden in Pseudomonas aeruginosa Mit Mini- Himar1 Mariner Transposon-vermittelte Mutagenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Erfahren Sie die Identifizierung neuer Alginate-Regulatoren in Pseudomonas aeruginosa mittels Mini-Himar1-Transposon-Mutagenese. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung hochdichter Mutantenbibliotheken zur Gencharakterisierung.

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Diese Arbeit wurde von der National Aeronautics and Space Administration West Virginia Raum Zuschuss Consortium (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) und NIH P20RR016477 und P20GM103434 an die West Virginia IDeA Netzwerk für Biomedical Research Excellence unterstützt. Wir danken Vonya M. Eisinger für die technische Unterstützung bei dieser Arbeit.

1. Vorbereitung der Bakterienstämme und biparental Konjugation <ol><li> Impfen E. coli SM10/λpir/pFAC in 5 ml Luria Broth (LB) mit 15 ug / ml Gentamicin und in einem Schüttelinkubator über Nacht bei 37 ° C ergänzt </li><li> Impfen P. aeruginosa Stamm PAO1 in 5 ml LB, und in einem Schüttelinkubator über Nacht bei 42 ° C </li><li> Messen OD 600 von Nacht-Kulturen und mischen gleiche Mengen von PAO1 und E. coli PFAC so daß das Endvolumen zwischen 1-1,4 ml. </li><li> Zentrifuge Mischung bei 6.000 × g für 5 min. </li><li> Inzwischen trocknen LB-Platten für die Konjugation: Lassen Platten in Inkubator offen bei 37 ° C für 10-15 min. </li><li> Entfernen Sie alle 50 ul Überstand von Zellgemisch. </li><li> Zellpellet in den verbleibenden 50 ul Überstand und Pipette auf eine trockene LB-Platte in einem kompakten Tröpfchen. </li><li> Die Platte vorsichtig in einem Abzug zu (IMPO trocknenRTANT Hinweis: Lassen Sie sich nicht Zellen über die Platte verteilt, wird dies deutlich die Effizienz der Konjugation verringern). </li><li> Sobald der Tropfen trocken ist, kehren die LB-Platte und bei 37 ° C für 4-6 Stunden. </li><li> Während die Zellgemisch inkubiert, bereiten große (150 mm x 15 mm) PIA-Platten mit 300 ug / ml Gentamycin. Vor der Verwendung die Restfeuchte zu entfernen, indem sie in einem Inkubator bei 37 ° C für 15-20 min. </li><li> Nach der Inkubation der Zellmischung vollständig ist, sammelt die Zellen mit einer sterilen Impföse und in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml LB-und Wirbel oder Pipette, um gründlich zu mischen. </li><li> Verbreiten Sie die Zellen gleichmäßig auf die großen Platten enthalten PIA 300 ug / ml Gentamicin. (WICHTIG: Bei diesem Schritt ist es am besten, steigenden Volumina der Zellgemisch in den Platten zu trennen (zB Plate 1: 10 ul, Platte 2: 50 ul, Teller 3: 100 ul, Teller 4: 500 ul, etc.) . </li><li> Inkubieren über Nacht bei 37° C. </li></ol> 2. Erkennung und Isolierung von Kolonien Schleimige <ol><li> Platten entfernen und untersuchen Inkubator für schleimige Kolonien. </li><li> Isolieren einer schleimigen Kolonie und Streifen für die Isolierung auf kleinen Tellern (100 mm x 10 mm) mit PIA und 300 ug / ml Gentamycin. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.2 auf der vorherigen Nacht-Kultur. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.4 zwei weitere Male um die Stabilität des schleimigen Isolats zu bestimmen. </li><li> Nach dem letzten Schritt Isolat, impfen 4,5 ml LB mit einer einzigen schleimige Kolonie und Inkubation über Nacht im Schüttler bei 37 ° C </li><li> Am nächsten Tag, Label 3 Mikrozentrifugenröhrchen für jede schleimige Mutante. </li><li> Bereiten Sie zwei 1,25 ml Aliquots von Übernachtkultur in 2 Röhren für genomische DNA-Extraktion und Identifizierung der Transposon-Insertion-Website (siehe Protokoll Nr. 3). </li><li> Darüber hinaus archiviert jede schleimige Mutante durch Pipettieren von 1 ml Übernachtkultur in ein ANGEMESSENEly-markierten Kryoröhrchen, das ein gleiches Volumen von 10% Magermilch. Lagerung bei -86 ° C. </li></ol> 3. gDNA Restriktionsverdau und Ligation <ol><li> Extrahieren aus der gDNA schleimige Mutante mit einer beliebigen Methode (zB. Phenol-Chloroform-Spin-Säule, etc.). </li><li> Bestimmung der Konzentration der gDNA, Digest insgesamt 2 ug mit 1 &amp;mgr; l der Restriktionsendonuklease SalI, 0,5 &amp;mgr; l Rinderserumalbumin, 5 ul Enzym SalI-Puffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM Dithiothreitol (DTT), pH 7,9 bei Raumtemperatur), und das entsprechende Volumen von dH 2 O auf ein Gesamtvolumen von 50 &amp;mgr; l zu erreichen. </li><li> Digest-DNA über Nacht bei 37 ° C (HINWEIS:. Abhängig von der Effizienz des Restriktionsenzyms kann es notwendig sein, eine zusätzliche 1 &amp;mgr; l der über Nacht zu verdauen und inkubieren bei 37 ° C für 1-2 h Dies ist zusätzlich zu dem Verdau über Nacht.) </li><li> Reinige den digeSTED-DNA unter Verwendung einer beliebigen Methode (z. B. Agarosegel-Reinigung, Spin-Säulen) und Eluieren mit 25 ul Puffer. </li><li> Ligation der verdauten DNA durch Mischen von 11 ul der gereinigten DNA mit einer bevorzugten Konzentration von ~ 10-20 ng / ul, 1,5 ul Ligationspuffer (330 mM Tris-Acetat pH 7,5, 660 mM Kaliumacetat, 100 mM Magnesiumacetat, 5 mM DTT), 1,5 ul 100 mM ATP und 1 ul DNA-Ligase. </li><li> Inkubieren der Mischung für 15 min bei Raumtemperatur und dann inaktiviert das Enzym durch Inkubieren für 15 min bei 70 ° C. (Anmerkung: Die Inkubation der Mischung bei Raumtemperatur für längere kann den Erfolg der Ligation zu erhöhen). </li></ol> 4. Inverse PCR (iPCR) und Sequenzanalyse <ol><li> Führen iPCR auf Ligationsprodukt mit dem folgenden Vor-und Rückwärts-Primer und Thermocycling Bedingungen: -Forward Primer (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA -Reverse Primer (Gm5OUT) GACTGCCCTGCTGCGTAACA Thermocycler Condigen: 1. 94 ° C für 1 min. 2. 94 ° C für 1 min. 3. 58 ° C für 2 min. 4. 72 ° C für 2 min. 5. 72 ° C für 8 min. 6. 10 ° C halten. Wiederholen Sie die Schritte 2-4 für 34 Zyklen. (HINWEIS: Amplified iPCR Produkte können bei 4 ° C aufbewahrt werden) </li><li> Führen Agarose-Gelelektrophorese zur erfolgreichen iPCR Verstärkung bestätigen. </li><li> Führen Sie auf der Sequenzierung iPCR Produkt unter Verwendung der Gm3OUT Gm5OUT und Grundierungen. Die Insertionsstelle und die Orientierung himar1 werden zeichnet. </li></ol>

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</ol>

Der Autor Yu Hongwei D. ist der Chief Science Officer und Mitbegründer von Progenesis Technologies, LLC.

Es ist wichtig zu beachten, dass diese Methode auch in anderen Pseudomonas-Arten mit diesen Änderungen verwendet werden: P. inkubieren fluorescens und P. putida bei 30 ° C und P. stutzeri bei 42 ° C; P. stuzeri sollte auf LB-Platten mit 150 ug / ml Gentamycin ergänzt kultiviert werden; Schritt auf 1.11 P. stutzeri Zellen sollten in 500 ul LB statt 1 ml übertragen. Zusätzlich gibt es zwei kritische Schritte für dieses Protokoll. Erstens sollte der Empfängerst...

Die Fähigkeit des opportunistischen, Gram-negative Erreger Pseudomonas aeruginosa zu Alginat überproduzieren ist ein wichtiger Faktor in der Fähigkeit, einen Biofilm zu schaffen. Die Überproduktion von Alginat ein Phänotyp oft als mucoidy bezeichnet. Die Isolierung der schleimigen Kolonien von der Sputum von Patienten mit zystischer Fibrose (CF) betroffen ist, der eine chronische Infektion, und ist direkt mit einem generellen Rückgang in der Gesundheits 1 des Patienten verbunden. Gegenwärtig ist zu verstehen, daß die Regelung und die Produktion von Alginat in P. aeruginosa tritt vor allem bei zwei Operonen. Die erste ist die Alginat-Biosynthese-Operon, die 12 Gene enthält (ALGD - alg8 - alg44 - algK - ALGE - algG - algX - algL - ALGI - algJ - algF - Alge), die für die Synthese und den Export des Alginatpolymer über verantwortlich sind das Periplasma der extrazellulären environment 5.2. Die zweite Operon ist ein Cluster von Genen, beginnend mit dem alternativen Sigmafaktor Algu / T und Weiterbildung mit Muça, mucB und mucD. Algu / T ist ein positiver Regulator, während mucAB-D werden als negative Regulatoren der Alginat-Produktion 8.6 eingestuft. Zusätzlich Transkriptionsregulatoren, wie ALGB, AlgQ, ALGR und RpoN sowie post-Transkriptions-und post-translationale Modifikation von Katabolitrepression Kontrolle, Kinase-Aktivität (Kinb) und Intramembranproteolyse haben auch gezeigt, dass in Alginat einbezogen werden Regulierung 14.09. Die Mini-himar1 Transposon-Vektor als PFAC bekannt wurde ursprünglich in Dr. Mekalanos &#39;Labor an der Harvard Medical School 15 erstellt. Die PFAC Plasmid besteht aus einem transponierbaren Element von zwei invertierten Wiederholungen von 27 bps und einem Gentamycin-Resistenzkassette in der Mitte (aacC1: 534 bp) flankiert, die ein Gen kodiert, hyperactive mariner Transposase 16, und ein Gen β-Lactamase (bla) (Abbildung 1). Sequenzinformationen für das Element des Transposons PFAC ist an der GenBank-Zugangsnummer zur Verfügung: DQ366300 13. In PFAC gibt es eine multiple Klonierungsstelle (MCS) hinter dem aacC1-Gen, das für die Identifizierung des chromosomalen Insertionsstelle mit inversen PCR verwendet. Ein großer Vorteil bei der Verwendung des Mini-himar1 Transposon keine spezifischen Wirtsfaktoren sind für die Umsetzung (Mutagenese) erforderlich. Darüber hinaus besteht eine hohe Häufigkeit der TA-Dinukleotid Insertionsstellen im gesamten Genom von P. gefunden aeruginosa. Zum Beispiel, TA-Dinukleotid Insertionsstellen auftritt 94.404 und 100.229 mal in der PAO1 (6.264.404 bps, GenBank-Zugangsnummer NC_002516.2) und PA14 (6.537.648 bps; GenBank Zugangsnummer NC_008463) Genome sind. Aufgrund der Fülle von TA-Dinukleotid im Genom, Mini himar1 </em&gt; Transposon kann die hohe Dichte und zufällige Mutagenese, die besonders geeignet für die Analyse der Virulenz-Gene und die Gene, die stark reguliert ist, verursachen. Theoretisch kann die Mini-himar1 Transposons in jeder nicht-essentiellen Gens im Genom von P. einfügen aeruginosa. Dies bietet etwa 18 TA Insertionsstellen pro offene Leserahmen in der PAO1 Genom. Hier ein Protokoll mit Mini-himar1 Transposon-vermittelte Mutagenese neue Regulatoren der mucoidy in P. identifizieren beschreiben wir aeruginosa. Genauer gesagt, wir biparentally konjugiert PFAC den Vektor, der ein Mini-Transposon aus E. himar1 coli SM10/λpir in die nonmucoid prototrophen Stamm PAO1. Nachdem das Transposon in das Genom integriert ist, ist die Empfängerstamm kultiviert auf Pseudomonas Isolation Agar (PIA), die Triclosan, die das Wachstum von E. hemmt coli. Somit wird eine Bibliothek von Mutanten <em&gt; P. aeruginosa durch das Wachstum auf PIA Platte mit Gentamycin und die Anwesenheit des schleimigen ergänzt Phänotyp ausgewählt werden. Beachten Sie, dass eine wahre Transposon-vermittelte gegen eine Integration Mutante eine Gentamicin resistent und Carbenicillin-sensitiven Phänotyp haben. In dieser Studie wurden rund 80.000 Insertionsmutanten von PAO1 durch vier separaten Konjugationen isoliert. Wir dann gesiebt für schleimige Isolate und bestimmt die Stelle der Insertion mittels Restriktionsenzym-Verdau, Ligation und inverse PCR. Wir führten Southern-Blot-Analyse unter Verwendung des Gentamycin-Resistenz-Kassette als eine Sonde, die Anzahl der Einführungs pro Genom zu sehen. Wir haben festgestellt, dass mehr als 90% der Mutanten pro Konjugation mit diesem Protokoll erhalten hatte nur eine einzige Kopie des himar1 im Genom und angezeigt die Gentamicin resistent und Carbenicillin-sensitiven Phänotyp. Insgesamt 32 schleimige Isolate wurden identifiziert, von denen 22 wurden zu verschiedenen Loci des P. zugeordnet aeruginosa PAO1Chromosom. Diese Rate der Einführung bietet eine ausreichende Abdeckung zu mehreren neuartigen Regulatoren der Alginat-Überproduktion zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>Luria Broth</td><td>Difco</td><td>240230</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas Isolations-Agar</td><td>Difco</td><td>292710</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Kleine Platten (100 O.D. x 10 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>Große Platten (150 O.D. x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Tisch-Schüttelinkubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4080</td><td>Schütteln bei 200 U/min</td></tr><tr><td>Schrank-Inkubator</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>Tisch-Mikrozentrifuge</td><td>Sorvall</td><td>75-003-287</td><td>über Fisher</td></tr><tr><td>Scientific SmartSpec Plus Spektralphotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>oder bevorzugte Methode/Anbieter</td></tr><tr><td>Einweg-Impfösen</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Kryofläschchen</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>15 ml Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Magermilch</td><td>Difco</td><td>DF0032-17-3</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>DNeasy Blut und Gewebe (250)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>oder bevorzugte Methode/bevorzugter Anbieter:</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>oder bevorzugte Methode/bevorzugter Anbieter</td></tr>: <tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>oder bevorzugte Methode/bevorzugter Anbieter:</td></tr><tr><td>FastLink II DNA Ligation Kit</td>, <td>Epicentre Technologies</td><td>LK6201H</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Accu Block Digital Dry Bath&nbsp;</td><td>Labnet</td><td>NC0205808</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sal1, Restriktionsendonuklease</td><td>New England BioLabs</td><td>R0138L</td><td></td></tr><tr><td>EasyStart Micro 50</td><td>Molecular BioProducts</td><td>6020</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>iCycler, Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8740</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>Genemate</td><td>3120-500</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Gentamycinsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Kryofläschchen</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>über Fisher Scientific</td></tr></tbody></table>

identifizierung neuer gene, die mit alginat-produktion verbunden in<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; mit mini-<em&gt; himar1</em&gt; mariner transposon-vermittelte mutagenese

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa ist ein Gram-negatives, Umwelt Bakterium mit vielfältigen Stoffwechselfunktionen. P. aeruginosa ist ein opportunistischer bakteriellen Krankheitserreger, der chronische Lungeninfektionen bei Patienten mit zystischer Fibrose (CF) herstellt. Die Überproduktion von Kapsel-Polysaccharid Alginat genannt, die auch als mucoidy bekannt, fördert die Bildung von schleimigen Biofilms, die resistenter als Planktonzellen antibiotische Chemotherapie und Wirtsabwehr sind. Außerdem ist die Umwandlung von der nonmucoid zu schleimige Phänotyp ein klinischer Marker für die Entstehung von chronischen Infektionen bei Mukoviszidose. Alginat Überproduktion von P. aeruginosa ist ein Prozess, der endergonische Zellenergie stark besteuert. Deshalb wird Alginat Produktion hoch in P. geregelt aeruginosa. Alginat Regulation besser verstehen, ein Protokoll unter Verwendung des Mini-himar1 Transposon-Mutagenese für die Identifizierung von neuen Alginat Regler beschreiben wirs in einer prototypischen Stamm PAO1. Das Verfahren besteht aus zwei Schritten. Zuerst vom Host E. übertragen wir die Mini-Transposon himar1 (PFAC) coli SM10/λpir in Empfänger P. aeruginosa PAO1 über biparental Konjugation an ein High-Density-Insertionsmutante-Bibliothek, die auf Pseudomonas Isolation Agar-Platten mit Gentamycin ergänzt ausgewählt wurden, erstellen. Zweitens, gesiebt und isoliert die schleimige Kolonien, um die Einstichstelle durch inverse PCR Karte mit DNA-Primer zeigt vom Gentamycinkassette und DNA-Sequenzierung nach außen wir. Über dieses Protokoll haben wir zwei neue Alginat-Regulatoren, mucE (PA4033) und Kinb (PA5484), in Stamm PAO1 mit einem Wildtyp-Muça Codieren der Anti-Sigma-Faktor Muça für die Master-Alginat Regler Algu (ALGT, σ 22) identifiziert . Dieses High-Throughput-Mutagenese-Protokoll kann für die Identifizierung von anderen Virulenz-Genen verursacht Änderung Colo modifiziert werdenny Morphologie.

Wie in Fig. 1 dargestellt, der Mini-Transposon-Vektor himar1 mariner, PFAC enthält zwei 27 bp invertierten Wiederholungen mit TA Insertion flankieren das aacC1 Gentamycin-Resistenz-Kassette, mit σ 70-abhängigen Promotor und eine multiple Klonierungsstelle (MCS). Zusätzlich enthält der Vektor Gene PFAC die hochaktiven himar1 Transposase, β-Lactamase (bla) und das Übertragungs tra-Operon codiert. Die TA Einführungsstellen ermöglichen eine effiziente ...

Hier beschreiben wir ein Protokoll, mit dem Mini-himar1 mariner Transposon-vermittelte Mutagenese zur Erzeugung einer hohen Dichte Insertionsmutante Bibliothek-Bildschirm, zu isolieren und zu identifizieren Roman Alginat-Regulatoren in der prototypischen Pseudomonas aeruginosa Stamm PAO1.

Identifizierung neuer Gene, die mit Alginat-Produktion verbunden in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Mit Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon-vermittelte Mutagenese

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neue Gene zu identifizieren, die mit der Produktion des Exopolysaccharids Alginsäure in Pseudomonas aeruginosa unter Verwendung der Mini-Himar1-Transposon-vermittelten Mutagenese assoziiert sind. Dies wird erreicht, indem zunächst zwei getrennte Übernachtkulturen des Donorstamms, E. coli Lambda pir, tragend das PAC-Plasmid, und der Rezipientenzellen, Pseudomonas aeruginosa, PAO1, angezogen werden. Anschließend wird das PAC-Plasmid durch Koreinkultur von E. coli Lambda pir mit Pseudomonas aeruginosa konjugiert.PAO1 und Transkonjugate werden auf Pseudomonas-Isolieragar ausgewählt, anschließend werden moidartige Kolonien auf PIA-Platten identifiziert und isoliert. Schließlich wird die Lage und Orientierung des Mini-He-Mar1-Transposons an der Insertionsstelle innerhalb des Pseudomonas-aeruginosa-PAO1-Genoms bestimmt. Letztendlich ermöglicht die Anwendung der durch Mini-He-R1-Transposon vermittelten Mutagenese die Identifizierung und Charakterisierung der Gene, die mit der Produktion von Alginsäure in Pseudomonas aeruginosa assoziiert sind.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen in den Bereichen Mikrobiologie und Bakteriengenetik beantworten, beispielsweise die Identifizierung genetischer Loci, die an der Regulation unterschiedlicher zellulärer Funktionen beteiligt sind, wie die Durchführung des Verfahrens mit Widers demonstriert. Ein Doktorand aus meinem Labor, The mini he R one Mariner-Transposon-Vektor P fac, enthält 227 Basenpaar lange invertierte Wiederholungen mit TA-Einbruchsstellen, die die A CC one-Gentamicin-Resistenzkassette flankieren, zusammen mit ihrem Sigma-70-abhängigen Promotor upstream einer Mehrfachklonierungsstelle. Der PFAC-Vektor enthält außerdem Gene, die für die hochaktive he R one-Transposase, Beta-Lactamase sowie die TRA-Transferoperation kodieren.Die TA-Einfügestellen ermöglichen eine effiziente Integration in das Genom von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen. Die Genauigkeit bei der Identifizierung und Auswahl von OID-Mutanten ist entscheidend für den Gesamterfolg bei der Bestimmung der an der Alginate-Regulation beteiligten Genloci. Um Bakterienstämme vorzubereiten, impfen Sie zunächst E. coli SM10 λ pir pfac in fünf Milliliter LB, ergänzt mit 15 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin, und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius im schüttelnden Inkubator am selben Tag.Inokulieren Sie den Posa-Stamm PO1 in fünf Milliliter LB und stellen Sie ihn am folgenden Tag über Nacht in einen schüttelnden Inkubator bei 42 Grad Celsius. Messen Sie den OD600 der Übernachtkulturen und mischen Sie gleiche Mengen von PAO1 und E. coli P fac, sodass das Endvolumen zwischen einem und 1,4 Milliliter liegt. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 6.000 × g für fünf Minuten.Unterdessen trocknen Sie LB-Platten für die Konjugation, indem Sie sie offen im Inkubator bei 37 Grad Celsius 10 bis 15 Minuten lang stehen lassen. Entfernen Sie das Überstandsvolumen aus der Zellmischung bis auf 50 Mikroliter. Dann resuspendieren.Suspendieren Sie das Zellpellet in den verbleibenden 50 Mikrolitern Überstand und pipettieren Sie es auf eine trockene LB-Platte. Platzieren Sie die Platte in einem kompakten Tropfen vorsichtig in einer Abzugshaube zum Trocknen. Lassen Sie die Zellen nicht über die Platte ausbreiten.Dies wird die Effizienz der Konjugation erheblich verringern. Sobald der Tropfen trocken ist, das LB-Plättchen umdrehen und vier bis sechs Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren, während die Zellmischung inkubiert wird. Große Pseudomonas-Isolier-Agar-Platten oder PIA-Platten mit 300 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin vorbereiten.Nach der Inkubation sammeln Sie mit einer sterilen Inokulationsnadel diesen einzelnen Tropfen an Zellen in einem Mikrozentrifugenröhrchen, das ein Milliliter LB enthält. Vortexen oder pipettieren Sie, um gründlich zu mischen, bevor Sie die Zellen gleichmäßig auf den großen PIA-Platten verteilen. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Entnehmen Sie die Platten dem Inkubator und untersuchen Sie sie auf OID-Kolonien. Isolieren Sie eine einzelne moid-Kolonie und streichen Sie zur Isolation auf kleinen Platten mit PIA und 300 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin. Am nächsten Tag isolieren Sie erneut eine einzelne moid-Kolonie und wiederholen das Stricheln. Wiederholen Sie die Einzelkolonie-Isolierung zwei weitere Male, um die Stabilität des moid-Isolats nach der initialen Isolierung zu bestimmen.Schritt: Inokulieren Sie 4,5 Milliliter LB-Medium mit einer einzelnen OID-Kolonie und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Schüttelinkubator. Am nächsten Tag beschriften Sie drei Mikrozentrifugenröhrchen für jeden OID-Mutanten. Bereiten Sie zwei Aliquote zu je 1,25 Milliliter der Übernachtkultur zur genomischen DNA-Extraktion und Identifizierung der Transposon-Einbaustelle vor.Archivieren Sie zusätzlich jeden OID-Mutanten, indem Sie ein Milliliter Übernachtkultur in ein entsprechend beschriftetes Kryoröhrchen pipettieren, das ein gleiches Volumen an 10 %iger Magermilch enthält. Lagern Sie bei minus 86 Grad Celsius. Nachdem die GDNA aus dem MOID-Mutanten extrahiert wurde.Digestieren Sie insgesamt zwei Mikrogramm mit einem Mikroliter der Restriktionsendonuklease S eins in einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern über Nacht bei 37 Grad Celsius, wobei die Konzentration mit einer beliebigen bevorzugten Methode bestimmt wird. Nach der Reinigung der digerierten DNA mittels einer beliebigen bevorzugten Methode in ein Gesamtvolumen von 25 Mikrolitern bereiten Sie eine Ligationsreaktion unter Verwendung von etwa 11 Mikrolitern DNA vor und inkubieren das Gemisch mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend inaktivieren Sie die Reaktion bei 70 Grad Celsius für 15 Minuten, und führen Sie eine IPCR am Ligationsprodukt unter Verwendung der folgenden Vorwärts- und Rückwärtsprimer sowie der angegebenen Thermocycling-Bedingungen durch.Danach die Amplifikation an einem AROS-Gel überprüfen, bevor abschließend die GM-three-out- und GM-five-out-Primer zur Sequenzierung der Reaktion verwendet werden. Beispiele für MOID- und Nicht-MOID-Isolate sind in dieser Abbildung dargestellt. Basierend auf dem in diesem Video gezeigten Protokoll sollte jede Konjugation aufgrund der Überproduktion von Alginsäure einen Klonpool von etwa 20.000 Mutanten auf 15 bis 20 großen Platten ergeben.Die moid-Kolonie sollte klar oder weißlich sein und ein cremiges oder schleimiges Aussehen aufweisen. Wenn die Mutagenese und die DNA-Amplifikation erfolgreich waren, sollte ein einzelnes Amplikon in der entsprechenden Größe vorliegen, wie in dieser Abbildung dargestellt. Bei PAO eins fehlt das IPCR-Amplikon.Jedoch detektieren wir ein einzelnes Amplifikat von etwa 1.400 Basenpaaren bzw. etwa 1000 Basenpaaren in PA, O one VE two und PA O one VE 13. Die Größe dieser Amplifikate entspricht der Insertion des HE R one mariner-Transposons in den Promotorbereich von PA 4 0 3 3 in PA oh one VE two und intern in PA 5 4 84 in PA oh one VE 13 PA oh one genomischer DNA. DNA, die einer Restriktion, Verdauung und Ligierung unterzogen wurde, kann als Negativkontrolle verwendet werden.Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in drei oder vier Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Bakterienstämme vor der bio-parentalen Konjugation bei geeigneter Temperatur zu inkubieren.

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Research

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