Identifizierung neuer Gene, die mit Alginat-Produktion verbunden in

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neue Gene zu identifizieren, die mit der Produktion des Exopolysaccharids Alginsäure in Pseudomonas aeruginosa unter Verwendung der Mini-Himar1-Transposon-vermittelten Mutagenese assoziiert sind. Dies wird erreicht, indem zunächst zwei getrennte Übernachtkulturen des Donorstamms, E. coli Lambda pir, tragend das PAC-Plasmid, und der Rezipientenzellen, Pseudomonas aeruginosa, PAO1, angezogen werden. Anschließend wird das PAC-Plasmid durch Koreinkultur von E. coli Lambda pir mit Pseudomonas aeruginosa konjugiert.

PAO1 und Transkonjugate werden auf Pseudomonas-Isolieragar ausgewählt, anschließend werden moidartige Kolonien auf PIA-Platten identifiziert und isoliert. Schließlich wird die Lage und Orientierung des Mini-He-Mar1-Transposons an der Insertionsstelle innerhalb des Pseudomonas-aeruginosa-PAO1-Genoms bestimmt. Letztendlich ermöglicht die Anwendung der durch Mini-He-R1-Transposon vermittelten Mutagenese die Identifizierung und Charakterisierung der Gene, die mit der Produktion von Alginsäure in Pseudomonas aeruginosa assoziiert sind.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen in den Bereichen Mikrobiologie und Bakteriengenetik beantworten, beispielsweise die Identifizierung genetischer Loci, die an der Regulation unterschiedlicher zellulärer Funktionen beteiligt sind, wie die Durchführung des Verfahrens mit Widers demonstriert. Ein Doktorand aus meinem Labor, The mini he R one Mariner-Transposon-Vektor P fac, enthält 227 Basenpaar lange invertierte Wiederholungen mit TA-Einbruchsstellen, die die A CC one-Gentamicin-Resistenzkassette flankieren, zusammen mit ihrem Sigma-70-abhängigen Promotor upstream einer Mehrfachklonierungsstelle. Der PFAC-Vektor enthält außerdem Gene, die für die hochaktive he R one-Transposase, Beta-Lactamase sowie die TRA-Transferoperation kodieren.

Die TA-Einfügestellen ermöglichen eine effiziente Integration in das Genom von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen. Die Genauigkeit bei der Identifizierung und Auswahl von OID-Mutanten ist entscheidend für den Gesamterfolg bei der Bestimmung der an der Alginate-Regulation beteiligten Genloci. Um Bakterienstämme vorzubereiten, impfen Sie zunächst E. coli SM10 λ pir pfac in fünf Milliliter LB, ergänzt mit 15 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin, und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius im schüttelnden Inkubator am selben Tag.

Inokulieren Sie den Posa-Stamm PO1 in fünf Milliliter LB und stellen Sie ihn am folgenden Tag über Nacht in einen schüttelnden Inkubator bei 42 Grad Celsius. Messen Sie den OD600 der Übernachtkulturen und mischen Sie gleiche Mengen von PAO1 und E. coli P fac, sodass das Endvolumen zwischen einem und 1,4 Milliliter liegt. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 6.000 × g für fünf Minuten.

Unterdessen trocknen Sie LB-Platten für die Konjugation, indem Sie sie offen im Inkubator bei 37 Grad Celsius 10 bis 15 Minuten lang stehen lassen. Entfernen Sie das Überstandsvolumen aus der Zellmischung bis auf 50 Mikroliter. Dann resuspendieren.

Suspendieren Sie das Zellpellet in den verbleibenden 50 Mikrolitern Überstand und pipettieren Sie es auf eine trockene LB-Platte. Platzieren Sie die Platte in einem kompakten Tropfen vorsichtig in einer Abzugshaube zum Trocknen. Lassen Sie die Zellen nicht über die Platte ausbreiten.

Dies wird die Effizienz der Konjugation erheblich verringern. Sobald der Tropfen trocken ist, das LB-Plättchen umdrehen und vier bis sechs Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren, während die Zellmischung inkubiert wird. Große Pseudomonas-Isolier-Agar-Platten oder PIA-Platten mit 300 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin vorbereiten.

Nach der Inkubation sammeln Sie mit einer sterilen Inokulationsnadel diesen einzelnen Tropfen an Zellen in einem Mikrozentrifugenröhrchen, das ein Milliliter LB enthält. Vortexen oder pipettieren Sie, um gründlich zu mischen, bevor Sie die Zellen gleichmäßig auf den großen PIA-Platten verteilen. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Entnehmen Sie die Platten dem Inkubator und untersuchen Sie sie auf OID-Kolonien.

Isolieren Sie eine einzelne moid-Kolonie und streichen Sie zur Isolation auf kleinen Platten mit PIA und 300 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin. Am nächsten Tag isolieren Sie erneut eine einzelne moid-Kolonie und wiederholen das Stricheln. Wiederholen Sie die Einzelkolonie-Isolierung zwei weitere Male, um die Stabilität des moid-Isolats nach der initialen Isolierung zu bestimmen.

Schritt: Inokulieren Sie 4,5 Milliliter LB-Medium mit einer einzelnen OID-Kolonie und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Schüttelinkubator. Am nächsten Tag beschriften Sie drei Mikrozentrifugenröhrchen für jeden OID-Mutanten. Bereiten Sie zwei Aliquote zu je 1,25 Milliliter der Übernachtkultur zur genomischen DNA-Extraktion und Identifizierung der Transposon-Einbaustelle vor.

Archivieren Sie zusätzlich jeden OID-Mutanten, indem Sie ein Milliliter Übernachtkultur in ein entsprechend beschriftetes Kryoröhrchen pipettieren, das ein gleiches Volumen an 10 %iger Magermilch enthält. Lagern Sie bei minus 86 Grad Celsius. Nachdem die GDNA aus dem MOID-Mutanten extrahiert wurde.

Digestieren Sie insgesamt zwei Mikrogramm mit einem Mikroliter der Restriktionsendonuklease S eins in einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern über Nacht bei 37 Grad Celsius, wobei die Konzentration mit einer beliebigen bevorzugten Methode bestimmt wird. Nach der Reinigung der digerierten DNA mittels einer beliebigen bevorzugten Methode in ein Gesamtvolumen von 25 Mikrolitern bereiten Sie eine Ligationsreaktion unter Verwendung von etwa 11 Mikrolitern DNA vor und inkubieren das Gemisch mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend inaktivieren Sie die Reaktion bei 70 Grad Celsius für 15 Minuten, und führen Sie eine IPCR am Ligationsprodukt unter Verwendung der folgenden Vorwärts- und Rückwärtsprimer sowie der angegebenen Thermocycling-Bedingungen durch.

Danach die Amplifikation an einem AROS-Gel überprüfen, bevor abschließend die GM-three-out- und GM-five-out-Primer zur Sequenzierung der Reaktion verwendet werden. Beispiele für MOID- und Nicht-MOID-Isolate sind in dieser Abbildung dargestellt. Basierend auf dem in diesem Video gezeigten Protokoll sollte jede Konjugation aufgrund der Überproduktion von Alginsäure einen Klonpool von etwa 20.000 Mutanten auf 15 bis 20 großen Platten ergeben.

Die moid-Kolonie sollte klar oder weißlich sein und ein cremiges oder schleimiges Aussehen aufweisen. Wenn die Mutagenese und die DNA-Amplifikation erfolgreich waren, sollte ein einzelnes Amplikon in der entsprechenden Größe vorliegen, wie in dieser Abbildung dargestellt. Bei PAO eins fehlt das IPCR-Amplikon.

Jedoch detektieren wir ein einzelnes Amplifikat von etwa 1.400 Basenpaaren bzw. etwa 1000 Basenpaaren in PA, O one VE two und PA O one VE 13. Die Größe dieser Amplifikate entspricht der Insertion des HE R one mariner-Transposons in den Promotorbereich von PA 4 0 3 3 in PA oh one VE two und intern in PA 5 4 84 in PA oh one VE 13 PA oh one genomischer DNA. DNA, die einer Restriktion, Verdauung und Ligierung unterzogen wurde, kann als Negativkontrolle verwendet werden.

Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in drei oder vier Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Bakterienstämme vor der bio-parentalen Konjugation bei geeigneter Temperatur zu inkubieren.