Laserinduzierte Plasmaspektroskopie: ein neuer Ansatz für die Nanopartikel-Mapping und Quantifizierung in Organgewebe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine einfache und robuste Methode bereitzustellen, um organische und anorganische Elemente in biologischem Gewebe mithilfe einer Tischplatten-Instrumentierung abzubilden und zu quantifizieren, die vollständig mit herkömmlicher optischer Mikroskopie kompatibel ist. Dies wird erreicht, indem ein Laserpuls auf die Probe fokussiert wird, um die Zerstörung und Funkenbildung des Materials auszulösen. Das Plasma emittiert Strahlung, die anschließend mit einem Spektrometer analysiert wird.

Der zweite Schritt besteht darin, die spektralen Linien auszuwählen und zu identifizieren, die den Elementen von Interesse entsprechen, und die Oberfläche der Probe abzuscannen. Anschließend führen Sie Kalibrierungsmessungen durch, um die Elementkonzentrationen bestimmen zu können. Der letzte Schritt ist die Erstellung der elementaren Abbildung des Probenmaterials aus allen aufgezeichneten Spektren mithilfe einer relativen Intensität oder einer Konzentrationsskala.

Schließlich wird die laserinduzierte Durchbruchsspektroskopie verwendet, um die Gewebeverteilung verschiedener Elemente ohne jegliche Markierung darzustellen. Im Vergleich zu anderen bestehenden Methoden wie Mikro-Röntgenfluoreszenz oder massenspektroskopischen Techniken ist die laserinduzierte Durchbruchsspektroskopie oder LIPS einfach zu implementieren, arbeitet bei Umgebungsdruck und ist mit den meisten optischen Mikroskopsystemen kompatibel.

Außerdem ermöglicht es eine Empfindlichkeit im PPM-Bereich bei einer Auflösung im Mikrometerbereich. Diese Methode kann helfen, eine zentrale Frage der Nanotechnologie in biologischen Studien zu beantworten, beispielsweise die Verteilung von Nanopartikeln, die metallische Elemente enthalten, in einer Gewebeprobe, ohne dass eine Markierung der Nanopartikel erforderlich ist. Die Technik kann auf die Pathologie ausgeweitet werden, da sie eine niedrige Nachweisgrenze für die Detektion abnormaler metallischer Elemente wie Kupfer, Eisen und Aluminium aufweist, die in verschiedenen Organen des Körpers, insbesondere im Gehirn, vorkommen können. Mithilfe dieser Methode lassen sich Erkenntnisse zur Detektion und Identifizierung von Nanopartikeln gewinnen.

Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie beispielsweise die Detektion anorganischer Elemente in TCU oder die Untersuchung heterogener Elementverteilungen. Wissenschaftler, die solche Experimente durchführen müssen, werden mit den Einstellungen für die Datenerfassung hadern müssen, um ein möglichst starkes Signal zu erhalten, ohne die Proben allzu sehr zu beschädigen. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie die Probenträger für dieses Protokoll vorbereiten.

Entnehmen Sie Organe von tumorbehafteten Mäusen, die mit einer Gadolinium-Nanopartikellösung injiziert wurden, um Präparate herzustellen. Legen Sie 100 Mikrometer dicke Schnitte der Organe auf eine Quarzglasplatte oder eine Petrischale. Bewahren Sie die Präparate stets bei minus 80 Grad Celsius auf.

Bereiten Sie als Nächstes die Proben für die Kalibrierung vor. Beschriften Sie mehrere Gefäße mit Konzentrationen, beginnend bei null Nanomolar und endend bei fünf Millimolar. Für jedes Gefäß bereiten Sie 100 Mikroliter einer Mischung aus Gadolinium in Wasser mit der entsprechenden Konzentration vor.

Wenn dies erledigt ist, bereiten Sie einen Objektträger vor. Entnehmen Sie fünf Mikroliter aus der ersten Vial und geben Sie sie auf den Quarzobjektträger oder die Petrischale. Achten Sie darauf, den Tropfen für die spätere Verwendung zu kennzeichnen.

Bewegen Sie sich drei Millimeter entlang des Umfangs und geben Sie fünf Mikroliter der nächsten Konzentration auf den Objektträger. Wiederholen Sie dies für jede der verbleibenden Lösungen. Lassen Sie den Inhalt des Objektträgers 20 Minuten bei Raumtemperatur trocknen.

Dieser LIP-Aufbau verwendet einen Nanosekunden-Neodym-Yttrium-Aluminium-Granat-Laser, der einen Strahl mit einer Wellenlänge von 1064 Nanometern erzeugt. Verwenden Sie einen Teil des Strahls, um das Spektrometersystem zu synchronisieren. Leiten Sie den anderen Teil durch einen computergesteuerten Dämpfer, der zur Einstellung und Stabilisierung der Laserpulsenergie während des gesamten Experiments dient.

Als Nächstes lenken Sie den Strahl in den Probenbereich dort. Fokussieren Sie den Strahl auf die softwaregesteuerte Translationsstufe. Diese wird die Probenträgerhalterung halten, an der eine CCD-Kamera befestigt ist, um die Oberfläche des Probenträgers zu überwachen.

Eine weitere Möglichkeit, um das Plasma-Plume zu überwachen. Analysieren Sie das Licht aus der Probenaufschlussreaktion in einem Drehspiegelspektrometer mit einer ICCD-Kamera, die auf minus 26 Grad Celsius gekühlt wird. Starten Sie für die Messung die Stabilisierung des Lasers und die Kühlung der Kamera auf minus 26 Grad Celsius.

10 Minuten vor dem Experiment. Wenn bereit, verwenden Sie den Dämpfer, um die Pulsenergie auf fünf Millijoule zu stabilisieren. Danach entnehmen Sie eine Probenplatte zur Untersuchung und bereiten Sie deren Montage auf dem Probentisch vor.

Befestigen Sie die Probe am motorisierten Probenhalter. Danach kehren Sie zum Computer zurück. Um die Probe zu positionieren, bewegen Sie den Probentisch, sodass sich ein Teil der Probe im Laserstrahl befindet.

Stellen Sie den Laserfokus auf etwa 100 Mikrometer unterhalb der Probenoberfläche ein. Wenn dies erfolgt ist, erzeugt der Laser Krater mit einem Durchmesser von 50 Mikrometern oder weniger. Stellen Sie mithilfe des Computers den Eingangsspalt des Spektrometers auf 40 Mikrometer ein und konfigurieren Sie die ICCD-Parameter für die Abbildungsmessung.

Passt die Position des Haltes an, um einen Bereich der Probe anzusteuern. Erstellt ein hochauflösendes Panoramabild der Probe mit einer Lichtquelle mit breitem Spektrum. Anschließend definiert mithilfe der Software und des aufgenommenen Bildes den LIBS-Scanning-Bereich und die Auflösung.

Hier beträgt das Raster 100 mal 100 mit 100 Mikrometern zwischen den Punkten. Starten Sie die automatisierte Erfassung der Daten an jedem Punkt des Rasters. Ein Spektrum wird gemessen und in einer Datei gespeichert.

Wenn die Messungen in etwa 30 Minuten abgeschlossen sind, machen Sie ein zweites Bild der Proben-Scheibe, anschließend konsolidieren Sie alle Spektren in einer Datendatei für die spätere Verwendung. Danach entfernen Sie die Proben-Platte und bereiten Sie sich darauf vor, die Kalibrationsproben zu montieren. Sichern Sie die Quarz-Platte mit den Kalibrationsproben auf der Translationsstufe zurück am Computer.

Platzieren Sie das Zentrum der ersten Kalibrierprobe im Laserstrahlweg. Beibehaltung der Experimentparameter und Aufnahme eines Spektrums. Führen Sie dasselbe für jede der verschiedenen Proben mit Gadoliniumkonzentration durch.

Dies sind Beispiele für Einzelaufnahmen-Spektren, die aus verschiedenen Bereichen von Nierengewebe aufgezeichnet wurden. Das blaue Spektrum wurde im zentralen Bereich der Niere aufgezeichnet. Das rote Spektrum entspricht der Nierenmembran und das grüne Spektrum dem peripheren Bereich.

Die injizierten, auf Gadolinium basierenden Nanopartikel bestehen aus einer Polys-laane-Matrix, wobei Gadoliniumionen an der Oberfläche durch DOCA-Liganden chelatisiert sind. Im verwendeten Spektralbereich von 286 Nanometern bis 320 Nanometern können Gadolinium, Calcium, Eisen, Silizium und Aluminium nachgewiesen werden. Beachten Sie, wie sich die Intensitäten in den verschiedenen Regionen der Probe unterscheiden, was auf eine große Heterogenität der Konzentrationen dieser Elemente hinweist. Die Gewebemapping von Gadolinium, Silizium und Eisen in einer Mausnierenscheibe wurde mithilfe der LIBS-Daten mit einer Auflösung von etwa 100 Mikrometern durchgeführt.

Die Skalenintensität wird in einer willkürlichen Einheit angegeben. Dies ist ein Bild im natürlichen Licht. Zum Vergleich wurden ähnliche Ergebnisse mit Tumorproben erzielt.

Wie bei dieser Aufnahme von Gadolinium und SQ 20 B Tumorgewebe wurde eine Falschfarbendarstellung auf das Bild im natürlichen Licht gelegt. Bei diesem Experiment wurden Nanopartikel direkt in den Tumor injiziert. Nach einer Stunde wurde der Tumor entfernt und zur Analyse vorbereitet.

Beachten Sie, dass ungefähr die Hälfte des Tumorvolumens einige Partikel auf Masters enthält. Diese Technik kann in weniger als einer Stunde für Proben von einem Quadratzentimeter mit einer Auflösung von 100 Mikrometer durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung von Lips ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Messungen aus dem laserinduzierten Plasma stammen und es entscheidend ist, alle Parameter während des gesamten Experiments nach der Vorgehensweise zu kontrollieren.

Es können auch andere Methoden wie Immunhistochemie an benachbarten Schnitten durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Zelltypen am untersuchten Prozess nach seiner Entwicklung beteiligt sind. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Nanotechnologie in der Biologie und Medizin den Weg, um die Verteilung von Verbindungen mit metallischen Elementen in biologischem Gewebe zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Lips-Technik verwendet wird, um mehrere Elemente in biologischen Geweben abzubilden.