Name: Elektrophysiologische Aufnehmen von Drosophila Labellar Geschmack Sensillen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Lernen Sie die elektrophysiologische Aufzeichnung von Geschmacksneuronen an Drosophila-Labella. Diese Methode ermöglicht die direkte Messung neuronaler Antworten auf verschiedene Geschmacksstoffe.

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Diese Arbeit wurde durch ein Promotions NRSA Zuschuss 1F31DC012985 (RD) und NIH Zuschüsse an JC unterstützt Wir danken Herrn Dr. Weiss Linnea für hilfreiche Kommentare zum Manuskript, Dr. Joseph Ryan um Hilfe Kompilieren Zahlen danken und Dr. Frederic Marion-Poll für hilfreiche technische Beratung. Wir würden auch gerne die hilfreichen Kommentare von vier Rezensenten bestätigen.

Das folgende Protokoll erfüllt alle Richtlinien der Tierpflege von der Yale University. 1. Reagenzien und Vorbereitung der Ausrüstung <ol><li> Aufnahmegeräte-Setup (Abbildung 1A). <ol><li fo:keep-together.within-page="always"> Wählen Sie einen Raum für Rig-Setup, das frei von großen Schwankungen der Temperatur und Luftfeuchtigkeit und auch aus Quellen von elektrischen und mechanischen Geräusche, wie Kühlschränke und Zentrifugen getrennt ist. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51355/51355fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51355/51355fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. (A) Übersicht über die Aufnahme rig-Setup. Stereomikroskop (a) auf Anti-Vibrationsplattform (b). Referenzelektrodenhalter (c) auf der Plattform gegenüber der heads (d) montiert über Mikromanipulatoren montiert. Ein Auslass Kunststoffrohr (e) liefern befeuchteten an der Fliege Vorbereitung gerichteten Luftstrom wird auch auf T montierter-Plattform. Die heads ist mit dem Verstärker (F), die mit dem digitalen Akquisitionssystem (DAS) (g), die mit einem PC (h) verbunden ist, verbunden ist. (B) Konfiguration der Elektroden-und Auslaufrohr:. Referenzelektrode auf der linken Seite, der Aufnahme-Elektrode auf der rechten Seite, und Luftstrom Austrittsrohr beim Fliegen Vorbereitung gerichtet <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> </li><li> Berg-Stereomikroskop zum Zentrum der Anti-Vibrationstisch oder Plattform. </li><li> Befestigen Mikromanipulatoren für die Referenzelektrode / Insekten Herstellung und heads / Aufzeichnungselektrode auf der linken und rechten Seite des Mikroskops, jeweils mit magnetischen steht. </li><li> Rähmchenauslass Kunststoffrohr in einem dritten Mikromanipulator auf der Rückseite des Mikroskops ausgerichtet, daß die Öffnung des Rohres in Richtung Lage des Fliegen prep hingewiesen (siehe Fig. 1B). </li><li> Mit flexiblen Kunststoffschlauch, antach Steckdose Kunststoffrohr mit einem Vakuumkolben teilweise mit Wasser gefüllt. Verbinden eine kleine Aquariumpumpe auf Luftblase durch das Wasser in den Kolben gegeben, wodurch eine befeuchtete Luftstrom durch den Auslaß in Richtung des Kunststoffrohrs Fliege. </li><li> Berg Faseroptik-Lichtquelle aus dem Vibrationstisch, Ausrichten der Ausgänge durch die Reflexion von Licht über ein Stück weißes Papier-Karte direkt unterhalb der Vorbereitung beleuchten die Vorbereitung. Stellen Sie sicher, dass die Lichtquelle nicht auf dem Tisch liegen. Hinweis: der Nutzen spiegelt die Lichtquelle auf einer Papierscheibe ist zweifach: Sie verbessert den Kontrast, so dass Sensillen leichter zu visualisieren, und es verhindert Erwärmung der Vorbereitung, die von direktem Licht führen würde. </li><li> Stecken tastePROBE Verstärker in den digitalen Erfassungssystem (DAS) und der DAS in einem Personal Computer, laut Hersteller-Handbuch. Stecken Fußpedal Auslöser und vereinbaren Sie unter Arbeitsbereich. Hinweis: Galvanisch getrennte Steckdosen für den Verstärker und DAS sind sehr wünschenswertLage. </li><li> Elektrisch Masse Mikroskop, Mikromanipulatoren und Lichtquelle durch Verbinden von Metallkomponenten Tabelle mit Krokodilklemmen und Längen von isolierten elektrischen Draht und Isolierband. Elektrisch Masse Metall-Plattform durch den Anschluss an Baugrund oder DAS, die durch Netzstecker geerdet ist. </li><li> Installieren Sie geeignete Erfassungssoftware für den DAS der Wahl auf dem PC. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die digitale Erfassung Treiber mit dem Betriebssystem auf dem PC kompatibel sind. </li><li> Konfigurieren Sie die Software-Amplifikation (10-100x), Signalfilterung, und Abtastrate (mindestens 10 KHz) (in der Regel ein Bessel-Bandpassfilter von 100 Hz-3, 000 Hz). Hinweis: Signalamplituden von Geschmacks-Neuronen sind in der Regel im Bereich von 0,5 bis 2 mV, so dass die Anzeigeskala ist auf ihre Visualisierung zu erleichtern. Hinweis: Die 100-Hz-Filter hilft, fremde elektrische Störungen auszuschließen, aber die Form der Spikes verändert und können erweiterte Spitze Sortier mor machene Herausforderung. Alternativ kann ein 1-Hz-Filter verwendet werden. </li><li> Optional kann ein Faraday-Käfig rund um die ganze Vibrationstisch gesetzt werden. Allerdings sind kleine Platten aus Aluminiumfolie in der Regel ausreichend, um keinen Lärm von der äußeren Umgebung oder Prüfer erzeugt reduzieren. </li></ol></li><li fo:keep-together.within-page="always"> Glaselektrodenvorbereitung <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51355/51355fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51355/51355fig2.jpg" /> Abbildung 2. Referenz-und Aufzeichnungselektroden. Fotografie unter Vergrößerung der Glas Kapillaren in Referenzelektrode gezogen, mit (A) und ohne (B) Spitze gebrochen und Aufzeichnungselektrode (C). Weiße Balken stellt 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <ol><li> Ziehen Sie den ReferenzElektrode aus einer Glaskapillare mit einer Pipette Abzieher Instrument. Hinweis: Die genauen Einstellungen der Pipette Abzieher-Programm wird von Gerät zu Gerät variieren. Versuchen Sie, eine sehr lange allmähliche Verjüngung zu erzielen. Die Porengröße an der Spitze ist nicht entscheidend, da die Spitze werden vor Flugvorbereitung (2A und 2B) gebrochen werden, aber stellen Sie sicher, dass der Durchmesser des konischen Länge der Elektrode ist weder zu dünn, was nicht für eine ausreichende erlauben Immobilisierung der Lippe, noch zu groß ist, die die Geschmacksnervenzellen schädigen oder zerstören die Speicheldrüsen können. </li><li> Ziehen Aufzeichnungselektrode aus einer Kapillare aus Borosilikatglas mit Filament mit einer Pipette Abzieher Instrument. Versuchen, eine Verjüngung, die flacher ist als die der Referenzelektrode ist, und einem Porendurchmesser von etwa 10-15 um (2C) 28 zu erreichen. </li></ol></li><li> Geschmacksstoff-Lösungen Vorbereitung <ol><li> Verwenden Sie Beadle-Ephrussi Ringer Lösungtion (B &amp; E) als Referenzelektrode Elektrolyten. Zu einem Liter B &amp; E zu machen, lösen sich 7,5 g NaCl, 0,35 g KCl und 0,279 g CaCl 2 ∙ 2H 2 O in einem Liter Reinstwasser. Bewahren kleineren Aliquots bei -20 ° C. </li><li> Verwenden 30 mM tricholine Citratlösung (TCC) als Aufzeichnungselektrode und Elektrolytlösungsmittel für Geschmacksstoff-Lösungen 25, wenn bitteren oder Zucker GRN Antworten gemessen werden. Alternativ kann 1-3 mM Kaliumchloridlösung verwendet werden, wenn Reaktionen des Wasserzelle zu messen sind. </li><li> Um Geschmacksstoff-Lösungen machen, wiegen entsprechende Menge an Geschmacksstoff in Pulverform und in den TCC, um eine anfängliche Konzentration Lager zu machen. Verwenden Sie diese serielle Verdünnungen von diesem Anfangsbestand machen, um die gewünschte Konzentration zum Testen zu erhalten. Hinweis: Wenn tastants nicht leicht in Wasser auflösen, ein anderes Lösungsmittel, wie Ethanol, können verwendet werden, um Anfangsbestand Konzentration zu machen. Eine entsprechende Kontrolllösung von TCC und Lösungsmittel ohne GeschmacksträgerIn diesem Fall verwendet werden. </li><li> Shop Aliquots langfristig bei -20 ° C Speicherung eines Werk Aliquot einer Geschmacksstoff-Lösung bei 4 ° C für die Aufzeichnung für die Verwendung bis zu einer Woche, abhängig von der chemischen Eigenschaften der Geschmacksstoff. </li></ol></li></ol> 2. Drosophila Vorbereitung <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51355/51355fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51355/51355fig3.jpg" /> Abbildung 3. Vorbereitung von Flug für die Aufnahme. (A) Insertion Position der Referenzelektrode in der dorsalen Thorax Fliege. Der weiße Pfeil zeigt die Referenzelektrode. (B) Zwischenposition der Referenzelektrode: über Hals und Kopf fortgeschritten, Rüssel noch nicht verlängert. (C, D) mit Referenzelektrode in der Endposition mit Spitze des Elektrode innerhalb Lippe und Rüssel Flyvoll ausgefahren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <ol><li> Sammeln Sie neu geschlüpften Fliegen für die Aufnahme von gepflegten fly Kulturen, unter Temperatur-und Luftfeuchtigkeits-kontrollierten Bedingungen aufgewachsen, und sie altern 5-10 Tage in frischem Kulturflaschen vor der Aufnahme. </li><li> Chill-Mikroskop Platte auf Eis für 15-30 min vor der Zubereitung Fliege. </li><li> Backfill Glasbezugselektrode mit B &amp; E-Lösung mit einer langen, dünnen Nadel aus Kunststoff von 0,5 mm Durchmesser, wie z. B. eine Rücken Nadel und 1-ml-Spritze und klopfen Sie leicht keine Blasen. Brechen kleine Menge von Spitze mit einer Pinzette aus und verwenden Sie Kapillarwirkung mit einem Gewebe ziehen alle verbleibenden Luftblasen, die Beobachtung unter Binokular. </li><li> Slide B &amp; E-gefüllte Referenzelektrode auf Draht Bezugselektrodenhalter, kümmert sich nicht um Luftblasen einzuführen. </li><li> Saugen Sie fliegen in ein P200 Pipettenspitze, unter Verwendung von Flugsauger gebautvon Schlauch-, Mesh-und Pipettenspitze; 29. Platz im Eiskübel und Chill für 30-60 sek. </li><li> Entfernen Mikroskop Platte von Eis, wischen Sie Feuchtigkeit und Position unter Mikroskop. Klopfen Sie fliegen aus der Pipettenspitze auf Mikroskop Platte. Hinweis: die Fliege sollte ausreichend immobilisiert, leicht zu manipulieren. </li><li> Bei niedriger Vergrößerung, entfernen Sie vorsichtig die Vorderbeine mit einer Pinzette, während die Thorax stabil mit der anderen Zange halten. Positionieren Sie die Fliege auf seiner Bauchseite, Rückenseite nach oben ein. Hinweis: Achten Sie stets auf berühren Sie nicht die Lippe mit der Zange zu jeder Zeit während des Herstellungsverfahrens gegen mechanische Beschädigungen zu minimieren. </li><li> Während mit einer Pinzette hält die Fliege im Ort, legen Sie die Referenzelektrode an der Mittellinie der hinteren dorsalen Thorax. Eine vorgeschlagene Eintrittswinkel beträgt etwa fünfundvierzig Grad in der Richtung des Kopfes (3A). </li><li> Sichern Sie die Referenz electrodE Halter mit Modelliermasse, so dass die Fliege unter dem Mikroskop bei hoher Vergrößerung sichtbar ist. Manöver und Winkel der Glaselektrode durch den Hals und Kopf, indem die Fliege auf den Referenzelektrodenhalter mit zwei Pinzetten. Hinweis: Arbeiten Sie schnell, aber gleichmäßig, es ist einfacher, diesen Schritt, während die Fliege ist immer noch von der Kälte (3B) immobilisiert. </li><li> Sanft erweitern die Rüssel mit einer Pinzette, während Sie die Fliege weiter unten auf der Glasreferenzelektrode, bis die Spitze der Elektrode im Inneren der Lippe und der Rüssel ausgefahren (3C und 3D). Hinweis: Achten Sie darauf, jeden Teil der Rüssel Gewebe durchbohren oder zu dehnen den Rand der Lippe mit der Referenzelektrode, da dies die Fliege beschädigen und / oder schmecken Neuronen und Einfluss auf die Aufnahmequalität. </li></ol> 3. Aufnahme von Labellar Sensillen <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51355/51355fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51355/51355fig4.jpg" /> Abbildung 4. Aufnahme von Fliege. (A) Lippe der Flugvorbereitung auf links mit Aufnahme-Elektrode für den Kontakt mit rechts, unter hoher Vergrößerung ausgerichtet ist. (B) Aufnahme-Elektrode und Einzel Sensillum auf Lippe in Kontakt, unter hoher Vergrößerung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <ol><li> Immer erden Sie sich vor dem Berühren einer Ausrüstung während der Aufnahme-Prozess Berühren der Metalloberfläche des Anti-Vibrationstisch oder Plattform! Hinweis: Es ist extrem wichtig, nicht um eine statische Ladung auf die heads liefern, wie dass die Schaltung beschädigen. </li><li> Sichere Bezugselektrodenhalter zu Mikromanipulator auf Lufttisch von recordin montiertg rig. Position ein Lappen der Lippe in der Mikroskopfeld, unter hoher Vergrößerung (in der Regel mindestens 140X), und im Einklang mit befeuchteten Luftstrom. </li><li> Schalten Sie befeuchteten Luftstrom, Computer, DAS und Verstärker. Offene Erfassungssoftware. </li><li> Spülen und füllen Glas Aufzeichnungselektrode mit der gewünschten Geschmacksträger. <ol><li> Spülen Glas Aufzeichnungselektrode mit hochreinem Wasser unter Verwendung einer Spritze und Kunststoffrohr 28, um kleine Mengen von Wasser durch das Rohr mindestens zehnmal ziehen. </li><li> Spülen Aufzeichnungselektrode mit Geschmacksstoff mindestens fünfmal. Füllen Aufzeichnungselektrode etwa ein Drittel bis zur Hälfte voll mit Geschmacksträger und von Schlauch zu entfernen. Wenn es Luftblasen, tippen zu lösen oder einfach nachfüllen Elektrode. </li><li> Schieben Elektrode auf Silberdraht des heads schnell und reibungslos, so dass keine Luftblasen einzuführen. </li></ol></li><li> Stimulieren Einzel Sensillum mit Geschmacksstoff gefüllten Aufzeichnungselektrode. <ol><li> Verwenden Sie die micromaniputor, um die Aufnahme-Elektrode mit Sensillum von Interesse ausgerichtet zu bringen. </li><li> Drücken Sie Fußpedal, um Erfassungsmodus des Verstärkers auslösen. </li><li> Schieben Sie den Aufnahme-Elektrode mit der Feindrehknopf der Mikromanipulator vorsichtig, bis sie Kontakt mit Spitze des Sensillum und die Aufnahme beginnt. </li><li> Entfernen Elektrode nach 1-2 sek. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.5 mit anderen Sensillen, wenn gewünscht. Hinweis: Warten Sie mindestens 1 min zwischen Präsentationen auf den gleichen Sensillum. Wenn die Aufzeichnung mit einer einzigen Geschmacksstoff über einen längeren Zeitraum kann die Geschmacksstoff-Lösung und trocknet die Lösung in der Spitze kann stärker konzentriert werden. Dies kann durch leichtes Kontakt mit der Spitze der Glaselektrode mit glatten Papier, eine kleine Menge von Flüssigkeit durch Kapillarwirkung entfernen behoben werden. </li></ol></li><li> Um Antworten auf die anderen Geschmacksträger aufnehmen, spülen und Lastaufnahmeelektrode mit neuen Geschmacksträger und wiederholen Sie Schritt 3.4. Hinweis: Gründlich Spülen der Elektrode zwischen tastants ist absolutely entscheidend, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. </li><li> Speichern Sie Dateien regelmäßig mit identifizierende Informationen wie Datum, Genotyp und Geschmacksstoffe. Hinweis: Es ist wichtig, eine schriftliche Aufzeichnung der Geschmacksträger und Sensillum Identität der Präsentation während der Aufnahme-Session für die Datenanalyse zu halten. </li></ol>

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<li>Marion-Poll, F., Tobin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+filter+for+detecting+spikes+superimposed+on+a+fluctuating+baseline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Software filter for detecting spikes superimposed on a fluctuating baseline.</a> Journal of neuroscience. 37, 1-6 (1991).</li>
<li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+individual+firing+frequencies+of+two+neurons+recorded+with+a+single+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode.</a> Chem Senses. 28, 671-679 (2003).</li>
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<li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+coding+of+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Peripheral coding of bitter taste in Drosophila.</a> Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Labellar sensilla unterscheiden sich in der Leichtigkeit der Aufnahme aufgrund von Unterschieden in der Morphologie und Anatomie Organisation. Manchmal ist ein Sensillum auf keine Geschmacksstoffe reagieren, auch eine, die dafür bekannt ist, eine positive Antwort zu entlocken. Die Häufigkeit, mit der dies geschieht, hängt von der Aktivität Sensillum. L Sensillen sind durchweg ansprechend und sind relativ einfach, aufgrund ihrer Länge zugreifen. Im Allgemeinen sind die S Sensillen konsequent reagiert, aber ihre kurze Län...

Der Geschmackssinn kann ein Insekt eine breite Palette von lösliche Chemikalien zu erkennen und spielt eine wichtige Rolle bei der Akzeptanz einer nahrhaften Substanz oder die Ablehnung eines schädlichen oder giftigen ein. Geschmack ist auch gedacht, um eine Rolle bei der Partnerwahl spielen, durch den Nachweis von Pheromonen 1-5. Diese wichtige und vielfältige Funktionen haben das Insekt Geschmack System ein überzeugendes Ziel von Ermittlungen, wie sensorische Systeme übersetzen Umweltreize in relevante Verhaltens Ausgänge gemacht. Die Primäreinheit der Drosophila melanogaster Geschmack System ist der Geschmack Haar oder Sensillum. Moleküle geben Sie die Sensillum über eine Poren an seiner Spitze 2,6. Sensillen auf der Lippe, der Beine, der Flügel-Marge und des Rachens 6 gefunden. Auf der Lippe, wird die Anzahl und Lage der Sensillen stereotyp. Es gibt drei Klassen von morphologischen Sensillen je nach Länge: die Länge (L), Mittelstufe (I) und kurze (S<html> ) Sensillen 7,8. Jeder Sensillum enthält entweder zwei (I-Typ) oder vier (L-und S-Typ) Geschmacksrezeptorzellen (KNS) 9. Verschiedene KNS reagieren auf verschiedene Kategorien von Geschmack Reize: bitter, Zucker, Salz und Osmolarität 7,10 und Express unterschiedliche Untergruppen von Geschmacksrezeptoren 8,11-13. Nur I und S-Typ-Sensillen enthalten Bitter-responsive KNS 8,10. Die KNS Projekt auf die Unterschlundganglion Ganglion (SOG) und deren Aktivierung durch Geschmacksmoleküle auf den höheren zentralen Nervensystems für die Decodierung weitergeleitet, was zu einer Verhaltensreaktion 6. Die relativ kleine Zahl von Neuronen und die Zugänglichkeit für Molekular-und Verhaltensanalyse machen den Geschmack Drosophila-System ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Geschmacks-Systeme im Allgemeinen. Die relative Leichtigkeit, mit der das System über genetische Mutation oder der GAL4-UAS Expressionssystem manipuliert werden, dient auch als ein wertvolles Werkzeug 14,15. NHALT &quot;&gt; Da diese Sensillen ragen aus der Oberfläche der Lippe, machen sie hervorragende Ziele für die Elektrophysiologie. Das Brennen der KNS kann mit extrazellulären Aufnahme überwacht werden. Historisch gesehen, die Seitenwand-Aufzeichnungsverfahren, das eine Glaselektrode in die eingelegte verwendet Sensillum neuronale Aktivität aufzuzeichnen, 26 verwendet. Jedoch ist dieses Verfahren technisch schwierig zu führen, und es ist schwierig, lange von jedem Präparat aufzunehmen. Die Spitze-Aufzeichnungsverfahren, das die Reaktion der Neuronen mit einer Elektrode Maßnahmen, gleichzeitig liefert ein Geschmacksträger ist, da die Methode der Wahl 9,16 zu werden. Es wurde verwendet, um den Geschmack System von Drosophila melanogaster 8,10,17,18 sowie eine Reihe von anderen Insektenarten 19-23 zu untersuchen. Es hat wurde durch die Entwicklung der tastePROBE Verstärker, der eine der wichtigsten Nachteile der Spitze-Aufzeichnungsverfahren durch Kompensation erleichtert wandDie große Potentialdifferenz zwischen der Bezugselektrode und der Insekten Sensillum, so dass die GRN Aktionspotentiale ohne übermäßige Verstärkung oder Filterung 24 aufgezeichnet werden. Eine weitere wichtige Entwicklung war die Verwendung von Citrat als tricholine der Aufnahme Elektrolyt 25. TCC unterdrückt Antworten von der Osmolarität empfindlichen GRN und nicht stimulieren die salzempfindlichen GRN, so dass Reaktionen, die durch bittere Geschmacksstoffe und Zucker erzeugt viel einfacher zu analysieren 25. Hier beschreiben wir, wie Spitze Aufnahme von Drosophila labellar Sensillen ist derzeit in der Carlson Labor durchgeführt. Dieses Protokoll wird erklären, wie man einen geeigneten Elektrophysiologie rig, wie die Fliege vorzubereiten, und wie man Geschmack Aufnahmen durchführen zu etablieren. Auch bei der Verwendung dieses Wir präsentieren einige durch die Aufnahme von Teilmengen von Drosophila Sensillen, sowie einige häufig auftretende Probleme und mögliche Lösungen, die auftreten können, erhalten repräsentative DatenTechnik.

<table><tbody><tr><td>Stereo-Zoom-Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX12 DFPLFL1,6x PF-Okulare: WHN10x-H/22</td><td>mit ~150-facher Vergrößerung mit großem Arbeitsabstand Tischhalterungsständer</td></tr><tr><td>Antivibrationsdämpfer Tisch</td><td>Kinetic Systems</td><td>BenchMate2210</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatoren</td><td>Narishige</td><td>NMN-21</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Ständer</td><td>ENCO</td><td>Modell #625-0930</td><td></td></tr><tr><td>Referenz Elektrodenhalter</td><td>Harvard Apparatur</td><td>ESP/W-F10N</td><td>Kann auf 5 ml serologische Pipette für erweiterte Reichweite montiert</td></tr><tr><td>werden Silver Wire</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW1510</td><td>0,3-0,5 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>Retortenständer</td><td></td><td></td><td>generisch</td></tr><tr><td>Auslass Kunststoff Schlauch</td><td></td><td></td><td>generisch, 1 cm Durchmesser</td></tr><tr><td>Flexibler Kunststoffschlauch</td><td>Nalgene</td><td>8000-0060</td><td>VI Klasse 1/4 im Innendurchmesser&nbsp;</td></tr><tr><td>500 ml Konuskolben</td><td></td><td></td><td>generisch, mit Seitenarm</td></tr><tr><td>Aquarienpumpe</td><td>Aquatische Gärten</td><td>Luftpumpe 2000</td><td></td></tr><tr><td>Lichtquelle</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Fiber-Lite 2100</td><td></td></tr><tr><td>White Card/Paper</td><td>Whatman</td><td>1001-110</td><td></td></tr><tr><td>Digitales Erfassungssystem</td><td>Syntech</td><td>IDAC-4</td><td>Alternative: National Instruments NI-6251 &nbsp;</td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Syntech</td><td>DTP-1</td><td>Tasteprobe</td></tr><tr><td>Tasteprobe Verstärker</td><td>Syntech</td><td>DTP-1</td><td>Tasteprobe</td></tr><tr><td>Krokodilklemmen</td><td>Grainger</td><td>1XWN7</td><td>Jede Marke ist in Ordnung</td></tr><tr><td>Isoliertes elektrisches Kabel</td><td></td><td></td><td>Generische</td></tr><tr><td>Gold Steckverbinder Pins</td><td>World Precision Instruments</td><td>5482</td><td></td></tr><tr><td>Personal Computer</td><td>Dell</td><td>Vostro</td><td>Kompatibilität mit digitalen Erfassungssystemen und Software</td></tr> prüfen <tr><td>Erfassungssoftware</td><td>Syntech</td><td>Autospike</td><td>Autospike funktioniert mit IDAC-4; alternativ können Sie LabView mit NI-6251</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie und/oder Faradayscher Käfig</td><td></td><td></td><td>verwenden Abschirmung gegen elektromagnetisches Rauschen</td></tr><tr><td>Borosilikatglas Kapillaren</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Modell P-87 Flammender/Brauner Mikropipettenabzieher</td><td></td></tr><tr><td>Beadle und Ephrussi Ringer Lösung</td><td></td><td></td><td>Siehe Rezept im Protokollabschnitt</td></tr><tr><td>Tricholincitrat, 65%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0252-100G</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>VMZ 1x-4x</td><td>mit 10-40-facher Vergrößerung</td></tr><tr><td>Eiskübel</td><td></td><td></td><td>Generische</td></tr><tr><td>p200 Pipettenspitzen</td><td></td><td></td><td>Generische</td></tr><tr><td>Spinalnadel</td><td>Terumo</td><td>SN * 2590</td><td></td></tr><tr><td>1 ml</td><td>Spritze Beckton-Dickenson</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>Fliegenaspirator</td><td></td><td></td><td>Zusammengesetzt aus P1000 Pipettenspitzen, flexiblen Kunststoffschläuchen und Netz</td></tr><tr><td>Modelliermasse</td><td></td><td></td><td>Generic</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools By Dumont</td><td>11252-00</td><td>#5SF (superfeine Spitzen)</td></tr><tr><td>10 ml Spritze</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffschlauch</td><td>Tygon</td><td>R-3603</td><td></td></tr></tbody></table>

elektrophysiologische aufnehmen von<em&gt; drosophila</em&gt; labellar geschmack sensillen

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Die periphere Geschmack Reaktion der Insekten können kraftvoll mit elektrophysiologischen Methoden untersucht werden. Die hier beschriebene Methode ermöglicht es dem Forscher, Geschmacks Antworten direkt und quantitativ zu messen, was die sensorischen Input, dass die Insektennervensystem erhält von Geschmack Reize in seiner Umgebung. Dieses Protokoll beschreibt alle wichtigen Schritte bei der Durchführung dieser Technik. Die kritischen Schritte in die Montage eines Elektrophysiologie-rig, wie die Auswahl der notwendigen Ausrüstung und eine geeignete Umgebung für die Aufnahme, abgegrenzt werden. Wir beschreiben auch, wie man für die Aufnahme durch entsprechende Referenz-und Aufzeichnungselektroden vorzubereiten und Geschmacksstoff-Lösungen. Wir beschreiben im Detail die für die Herstellung des Insekten durch Einsetzen einer Glasreferenzelektrode in die Fliege um den Rüssel zu immobilisieren verwendete Methode. Wir zeigen Spuren der elektrischen Impulse durch Geschmack Neuronen in Reaktion auf eine Zucker-und eine bittere Verbindung gefeuert. Aspekte des Protokolls sind Technically Herausforderung und wir auch eine umfangreiche Beschreibung von einigen gemeinsamen technischen Herausforderungen, die auftreten können, wie der Mangel an Signal-oder übermäßiges Rauschen in das System, und mögliche Lösungen. Die Technik stößt an ihre Grenzen, wie zum Beispiel die Unfähigkeit, zeitlich komplexe Reize liefern, beachten Hintergrund Brennen unmittelbar vor der Auslieferung Stimulus oder verwenden wasserunlösliche Verbindungen bequem Geschmack. Trotz dieser Einschränkungen ist diese Technik (einschließlich geringfügige Änderungen im Protokoll Bezug genommen) ein Standard, breit akzeptiertes Verfahren für die Aufzeichnung von Drosophila neuronalen Antworten auf Verbindungen zu probieren.

Fig. 5A zeigt die Antwort eines L Sensillum zu einem Zucker, Saccharose. Das gleiche Sensillum nicht zu einem bitteren Verbindung reagieren, Berberin. 5B zeigt, dass ein I-Typ Sensillum, die einen bitteren responsive Neuron enthält, zeigt größere Amplitude Spitzen in Reaktion auf Berberin und kleinere Amplitudenspitzen in Reaktion auf Saccharose. L Sensillen einen minimalen Hintergrund Reaktion auf die Lösungsmittelkontrolle, TCC anzuzeigen, während ich Sensillen praktisch keine Reaktio...

Dieses Protokoll beschreibt extrazellulären Aufnahme der Aktionspotentialantworten durch labellar Geschmack Neuronen in Drosophila gefeuert.

Elektrophysiologische Aufnehmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Geschmack Sensillen

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Reaktionen einzelner Geschmackssensillen am Labrum von Drosophila zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Elektrophysiologie-Aufnahmeapparatur aufgebaut und sämtliche erforderlichen Geräte eingerichtet werden. Der zweite Schritt ist die Vorbereitung der Fliege für die Ableitung. Anschließend wird ein einzelnes Lumen mit einer Geschmackssubstanz stimuliert, während gleichzeitig die neuronale Antwort aufgezeichnet wird. Schließlich dient die elektrophysiologische Spitzenableitung von einzelnen beschrifteten Sillen dazu, die Reaktionen der Geschmackssillen auf verschiedene Geschmackssubstanzen zu zeigen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Vorbereitungsschritte an der Fliege technisch anspruchsvoll und schwierig zu erlernen sein können.Sammlen Sie bei diesem Verfahren die neu geschlüpften ELO-Fliegen aus den gut gepflegten Fliegenkulturen. Anschließend lassen Sie sie fünf bis zehn Tage in frischen Kulturgefäßen altern, bevor Sie die Aufnahme beginnen. Vor der Vorbereitung der Fliege kühlen Sie die Mikroskopplatte 15 bis 30 Minuten lang auf Eis. Danach füllen Sie die Glasreferenzelektrode mit B- und e-Lösung auf.Und entfernen Sie vorsichtig unter dem Präparationsmikroskop etwaige Blasen. Brechen Sie mit der Pinzette ein kleines Stück der Spitze ab. Ziehen Sie anschließend durch Kapillarwirkung mit dem Gewebe eventuelle verbleibende Blasen heraus.Danach schieben Sie die mit B und E gefüllte Referenzelektrode über den Draht des Elektrodenhalters und achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen. Saugen Sie anschließend eine Fliege mit einer P-200-Pipettenspitze auf, geben Sie sie in einen Eisbehälter und kühlen Sie sie 30 Sekunden bis eine Minute lang. Entfernen Sie danach die Mikroskopplatte vom Eis und platzieren Sie sie, nachdem Sie die Feuchtigkeit abgewischt haben, unter dem Mikroskop.Tippen Sie die Fliege anschließend vorsichtig aus der Pipettenspitze auf die Mikroskopierplatte unter niedriger Vergr&ouml;&szlig;erung. Entfernen Sie die vier Beine mit einem Paar Pinzette, w&auml;hrend Sie die Fliege mit dem anderen Paar Pinzette stabil halten. Positionieren Sie die Fliege auf der ventralen Seite, sodass die dorsale Seite nach oben zeigt.Vermeiden Sie stets, das Label beum mit der Pinzette während des Präparationsvorgangs zu berühren, um mechanische Schäden zu minimieren. Halten Sie die Fliege mit einem Paar Pinzetten fest und führen Sie die Referenzelektrode mittig am hinteren dorsalen Thorax in einem Winkel von etwa 45 Grad in Richtung des Kopfes ein. Befestigen Sie anschließend den Halter der Referenzelektrode mit Modellierknete, sodass die Fliege unter dem Mikroskop bei hoher Vergrößerung sichtbar bleibt. Positionieren und richten Sie die Glaselektrode an ihrem Hals- und Kopfbereich aus und schieben Sie die Fliege mithilfe von zwei Paar Pinzetten in Richtung des Referenzelektrodenhalters.Strecken Sie nun vorsichtig den Rüssel mit einem Paar Pinzette und schieben Sie die Fliege weiter über die Glasreferenzelektrode, bis die Spitze der Elektrode innerhalb des Labellum-Beckens liegt und der Rüssel vollständig ausgestreckt ist. Befestigen Sie in diesem Schritt den Referenzelektrodenhalter am Mikromanipulator, der auf dem Lufttisch montiert ist. Positionieren Sie ein Lappen des Labellum im Mikroskop-Blickfeld unter hoher Vergrößerung und in einer Linie mit dem befeuchteten Luftstrom.Danach schalten Sie das computergestützte digitale Erfassungssystem oder DAS und den Verstärker für die befeuchtete Luftstromaufzeichnung ein. Ziehen Sie anschließend mit einer Spritze und Kunststoffschläuchen mindestens zehnmal eine kleine Menge ultrareines Wasser durch den Schlauch. Zum Spülen der Glaselektrode spülen Sie die Aufzeichnungselektrode danach mindestens fünfmal mit TAST.Füllen Sie die Ableitelektrode anschließend etwa ein Drittel bis zur Hälfte mit der Geschmacksprobe und nehmen Sie sie von der Schlauchleitung ab. Falls Luftblasen vorhanden sind, klopfen Sie leicht dagegen, um sie zu entfernen, oder füllen Sie die Elektrode einfach erneut. Schliden Sie die Elektrode nun schnell und gleichmäßig auf den Silberdraht der Kopfstufe.Um die Einführung von Luftblasen zu vermeiden, die die einzelne Sinneszelle stimulieren könnten, bringen Sie zunächst mit dem Mikromanipulator die Ableitelektrode in Ausrichtung mit der gewünschten Sinneszelle. Drücken Sie danach das Fußpedal, um den Erfassungsmodus des Verstärkers auszulösen. Bewegen Sie anschließend die mit Geschmackslösung gefüllte Ableitelektrode vorsichtig mithilfe des Feinjustierknopfs des Mikromanipulators vorwärts, bis sie mit der Spitze der Sinneszelle in Kontakt tritt, und beginnen Sie mit der Aufzeichnung.Entfernen Sie die Elektrode nach einer bis zwei Sekunden. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem anderen illa und warten Sie zwischen den Darbietungen an dasselbe lum mindestens eine Minute. Wenn die Aufnahme mit einem einzelnen Geschmack über einen längeren Zeitraum erfolgt, kann der Geschmack und die Lösung austrocknen und die Lösung in der Spitze konzentrierter werden.Dies kann behoben werden, indem die Spitze der Glaselektrode vorsichtig mit glattem Papier in Kontakt gebracht wird, um durch Kapillarwirkung eine geringe Menge Flüssigkeit zu entfernen, um die Antworten auf einen weiteren Geschmack aufzuzeichnen, die Elektrode zu spülen, mit einem neuen Geschmacksreiz zu beladen und das Verfahren zu wiederholen. Speichern Sie die Datendateien regelmäßig mit identifizierenden Informationen wie Datum, Genotyp und Geschmack. Diese Abbildung zeigt die Antwort eines Centum auf den Zucker Saccharose.Derselbe Centrum reagiert nicht auf die bittere Verbindung Berberin, und diese Abbildung zeigt, dass ein Augentyp-Sens, der einen auf Bitterstoffe ansprechenden Neuronen enthält, Ausschläge mit größerer Amplitude als Reaktion auf Berberin und Ausschläge mit geringerer Amplitude als Reaktion auf Saccharose aufweist. Dargestellt sind hier repräsentative suboptimale elektrophysiologische Ergebnisse. Diese Spur steht für einen vollständigen Signalverlust.Dies ist das 50- oder 60-Hertz-Rauschen von externen elektrischen Quellen, und dies ist das stochastische Rauschen. Diese Spur zeigt, dass das Meno-Sinnesneuron allein feuerte, während sowohl das bittere gustatorische Rezeptorneuron als auch das Meno-Sinnesneuron feuerten. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man neuronale Antworten von Oph Atory Silla am Labum aufzeichnet.

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Forschung

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Hier beschreiben wir elektrophysiologische Methoden zur Messung der synaptischen Transmission an der neuromuskulären Synapse von Drosophila Larve. Evozierte Freisetzung wird künstlich durch die Stimulierung der Motoneuronen Axone initiiert, und die Übertragung durch die NMJ kann durch die postsynaptische Reaktion im Muskel ausgelöst gemessen werden.

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Elektrophysiologische Reaktionen der Riechzellen auf Duftstoffe können bei Insekten mit einzelnen Sensillum Aufnahmen gemessen werden. In diesem Video-Artikel werden wir zeigen, wie man einzelne Sensillum Aufnahmen in den Antennen der Fruchtfliege führen...

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Dieses Video beschreibt das Protokoll zur elektrophysiologischen Aufzeichnung der Photorezeptoraktivität im Auge einer immobilisierten Drosophila, das eine präzise Messung von Spannungsänderungen als Reaktion auf Lichtreize ermöglicht.

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In diesem Video wird eine lebende Drosophila-Fliege für elektrophysiologische Untersuchungen in eine Röhre montiert. Elektroden werden an der Basis des Sensillums positioniert, um spezifische neuronale Reaktionen auf Pheromone mit den Geruchsrezeptorneuronen der Fliege aufzuzeichnen.

Elektrophysiologische Aufzeichnungen von Drosophila sensilla als Reaktion auf flüchtige Geruchsstoffe

Die Vorderbeine und der Rüssel von Drosophila enthalten ein reiches Repertoire an geschmacklichen sensorischen Neuronen. Hier stellen wir eine Methode vor, die Calcium-Imaging verwendet, um physiologische Reaktionen von sensorischen Neuronen im Vorderbein und Rüssel lebender Fliegen nach exogener Applikation eines gustatorischen Pheromons zu messen.

Mess physiologischen Reaktionen von<em&gt; Drosophila</emNeurone&gt; Sensory zu Lipid Pheromone Verwendung von Live-Calcium Imaging

Das Gesamtziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie man Geruchsstoffe mit geringer Flüchtigkeit für die Single-Sensillum-Aufzeichnung von Drosophila- olfaktorischen Rezeptor-Neuronen, die auf langkettige cutikuläre Pheromone reagieren, präsentieren kann.

Elektrophysiologische Aufzeichnung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Trichoid Sensilla in Reaktion auf Odoranten der niedrigen Volatilität

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Aufzeichnen der absteigenden elektrische Aktivität von Drosophila Melanogaster Zentralnervensystems ermöglichen kostengünstige und praktische Erprobung von pharmakologischen Wirkstoffen, Genmutationen neuronaler Proteine, und/oder die Rolle der unerforschten physiologischen Wege.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

Eine selten verwendete Methode der elektrophysiologischen Aufzeichnung, die Basisaufzeichnung, ermöglicht die Analyse von Merkmalen der Geschmackscodierung, die mit herkömmlichen Aufzeichnungsmethoden nicht untersucht werden können. Die Basenaufzeichnung ermöglicht auch die Analyse von Geschmacksreaktionen auf hydrophobe Reize, die mit herkömmlichen elektrophysiologischen Methoden nicht untersucht werden können.

Base Recording: Eine Technik zur Analyse der Reaktionen von Geschmacksneuronen in Drosophila

Ein Calcium-Imaging-Ansatz ermöglicht die Aufzeichnung von geschmacksinduzierten Reaktionen im Gehirn wacher Fliegen, während eine Lösung auf das Labellum aufgetragen wird. Primäre gustatorische Reaktionen in Drosophila melanogaster werden als Beispiel verwendet, aber dieses Protokoll kann angepasst werden, um nachgeschaltete Neuronen oder andere Spezies zu untersuchen.

Im lebenden Organismus Kalzium-Bildgebung von geschmacksinduzierten neuronalen Reaktionen bei adulten Drosophila

Lernen Sie die elektrophysiologische Aufzeichnung von Geschmacksneuronen an Drosophila-Labella. Diese Methode ermöglicht die direkte Messung neuronaler Antworten auf verschiedene Geschmacksstoffe.

Elektrophysiologische Aufnehmen von

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