Eine Strategie für einfühlsam, Large Scale Quantitative Metabolomics

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das metabolische Profiling in kultivierten Zellen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst polare Metaboliten aus Zellen extrahiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellextrakte in Wasser zu rekonstituieren und die Proben in lc-Fläschchen zu überführen.

Anschließend werden die Proben in das kalibrierte lc QE MS-Instrument injiziert und im letzten Schritt die Rohdaten im Computer aufgezeichnet. Metaboliten-Peaks werden mit kommerzieller Software aus den Rohdaten extrahiert und unbekannte Peaks mit einer hochauflösenden Massendatenbank abgeglichen. Obwohl dieser Master einen Einblick in die relativen Metabolitenspiegel bei SARS geben kann, kann er auch auf andere Systeme wie Serum oder Gewebe angewendet werden.

Bereiten Sie zunächst 500 Milliliter mobile Phase A vor, d. h. 20 Millimolare Ammoniumacetate und 15 Millimolare Ammoniumhydroxid in 3 % Aceto, Nitril und Wasser. Nachdem Sie die Flasche locker verschlossen haben, beschallen Sie die Lösung in einem Wasserbad 10 Minuten lang ohne Erhitzen. Anschließend werden fünf Milligramm Natriumfluoracetat und Säure in fünf Millilitern Wasser gelöst, um eine Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter zu erreichen.

Lösen Sie dann Diazinon in Methanol auf, um eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Zur Herstellung eines Milliliters negativer Kalibrierlösung mit geringer Masse mischen Sie 960 Mikroliter thermonegative Kalibrierlösung mit 20 Mikrolitern Natriumfluoracetat und Homovanillinsäurelösung. Um einen Milliliter positive Kalibrierlösung mit geringer Masse herzustellen, mischen Sie 990 Mikroliter thermopositive Kalibrierlösung und 10 Mikroliter der Diazinonlösung.

Nachdem Sie eine Standard-Massenkalibrierung im positiven Modus durchgeführt haben, stellen Sie den Scanbereich auf dem Bedienfeld des Geräts auf ein Masse-Ladungs-Verhältnis von 60 bis 900 ein und wenden Sie eine durch Quellenkollision induzierte Dissoziation von 25 Elektronenvolt an. Geben Sie benutzerdefinierte Kalibrierungsionen ein, und sobald die Ionenquelle stabil ist, starten Sie die benutzerdefinierte Kalibrierung auf der Tuning-Seite. Schalten Sie die Polarität in den negativen Modus, nachdem Sie eine Standard-Massenkalibrierung im negativen Modus durchgeführt haben, stellen Sie den Scanbereich auf ein Masse-Ladungs-Verhältnis von 60 bis 900 im Bedienfeld des Geräts ein und wenden Sie eine durch Quellenkollision induzierte Dissoziation von 35 Elektronenvolt an.

Geben Sie benutzerdefinierte Kalibrierionen ein, und sobald die Ionenquelle stabil ist, starten Sie die benutzerdefinierte Kalibrierung. Rüsten Sie das QE-MS-Instrument auf der Tuning-Seite mit der beheizten Elektrospray-Ionisations- oder HESI-Sonde aus, indem Sie es auf Stufe C befestigen und dann an die Stickstoffgaseinlässe, das Verdampferkabel und die Spannungskabel anschließen. Legen Sie auf der Seite "Computeroptimierung" die relevanten Optimierungsparameter für den Prüfpunkt fest.

Stellen Sie die Kapillartemperatur auf 320 Grad Celsius und die S-Linse auf 55 Grad Celsius ein. Erstellen Sie als Nächstes im Methodenprogramm eine vollständige Scanmethode mit den folgenden Werten. Legen Sie die Chromatographiemethode fest, indem Sie die linearen Gradienteninformationen eingeben.

Verwenden Sie eine Amidsäule für die Trennung von Verbindungen bei Raumtemperatur. Bereiten Sie an dieser Stelle ein Extraktionslösungsmittel vor, indem Sie manuell 40 Milliliter Methanol und 10 Milliliter Wasser in einen 50-Milliliter mischen. Zwei. Bei zuvor kultiviertem Dickdarmkrebs-H-CT erreichen acht Zellen eine Konfluenz von 80 %.

Saugen Sie das Medium schnell an und legen Sie die Sechs-Well-Platte auf Trockeneis. Geben Sie dann sofort einen Milliliter Extraktionslösungsmittel in jede Vertiefung und stellen Sie die Platte in einen Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius. Nachdem Sie die Platte 15 Minuten später aus dem Gefrierschrank genommen haben, legen Sie sie auf Trockeneis und kratzen Sie die Zellen in das Lösungsmittel.

Übertragen Sie die Lösung aus jeder Vertiefung in drei 1,7-Milliliter-Einor-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Proben mit einer Geschwindigkeit von 20.000 Mal G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Nach der Zentrifugation wird der Überstand in zwei neue Einor-Röhrchen überführt. Anschließend trocknen Sie die Proben im Schnellvakuum.

Sobald die Proben getrocknet sind, lagern Sie sie im Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Nachdem Sie die Proben zur Analyse aus dem Gefrierschrank genommen haben, lassen Sie sie Eistemperatur erreichen. Fügen Sie dann 20 Mikroliter eiskaltes Wasser hinzu und wirbeln Sie die Proben, um die Metaboliten aufzulösen.

Als nächstes zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 mal G bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den SUPERNAT zwei Minuten lang in lc-Fläschchen und injizieren Sie fünf Mikroliter der Proben zur Analyse in das lc-QES-Instrument. Sobald die Kalibrierung am QE-MS-Gerät ordnungsgemäß durchgeführt wurde, äquilibrieren Sie die lc-Säule fünf Minuten lang mit 85 % der mobilen Phase B bei einer Flussrate von 0,15 Millilitern pro Minute.

Richten Sie als Nächstes die Probensequenz in einer zufälligen Reihenfolge ein, um die durch das LCMS verursachten Schwankungen auf jede Probe zu verteilen und einen genaueren Vergleich zwischen verschiedenen Proben zu gewährleisten. Fügen Sie nach jeweils sechs Proben einen Waschlauf hinzu, gefolgt von einer Leerprobe, um den Systemhintergrund und die Verschleppungswerte zu bewerten. Speichern Sie die Sequenz und starten Sie den Sequenzlauf.

Sobald die lc-Säule einen stabilen Druck von fast 400 PSI anzeigt, nachdem die ersten beiden Proben der Sequenz durchlaufen wurden, überprüfen Sie die Peaks in diesen Chromatogrammen auf unbekannte Metaboliten, um sicherzustellen, dass die Probensequenz reibungslos abläuft. Nachdem alle Proben in der Sequenz abgeschlossen sind, führen Sie die Datenanalyse auf einem separaten Computer durch. Wählen Sie die Methode der Peak-Ausrichtung und Frame-Extraktion für kleine Moleküle mit kommerziell erhältlicher Software.

Laden Sie dann die lc ms Rohdaten und gruppieren Sie sie nach Sample-Typen. Nehmen Sie Proben in der Mitte der Laufsequenz als Chromatographie-Referenzprobe für die Peakausrichtung und wählen Sie eine Gruppe als Verhältnisgruppe oder als Berechnung der vollständigen Änderung. Laden Sie dann einen Frame-Seed hoch, der bekannte Metaboliten für die gezielte Metabolitenanalyse mit den gesammelten Daten und dem entsprechenden Frame-Seed enthält.

Wählen Sie als Nächstes den vollständigen Spektrenscan entweder im Positiv- oder im Negativmodus und speichern Sie diese Datenverarbeitungsdatei im selben Ordner wie die Rohdaten. Deaktivieren Sie die Datenbanksuchfunktion, und führen Sie den Workflow aus. Exportieren Sie dann die Prozessdaten als Excel-Tabelle, die den Peakbereich jedes Frames enthält.

Für eine ungezielte Metabolitenanalyse wählen Sie die Methode der Komponentenextraktion. Laden Sie die Beispiel-Rohdaten und drei leere Beispiele für die Hintergrundsubtraktion. Im Anschluss an diese Gruppe folgen die Rohdaten und legen Sie die Referenzmuster fest, wie zuvor beschrieben.

Legen Sie den Komponentenschwellenwert auf 10 bis zum fünften fest. Verwenden Sie eine humane Metabolomdatenbank zur Identifizierung unbekannter Verbindungen. Deaktivieren Sie nach dem Speichern dieser Verarbeitungsdatei die Datenbanksuchfunktion und starten Sie den Workflow.

Sobald die Datenverarbeitung abgeschlossen ist, verwenden Sie Variationskoeffizienten oder CV-Filter, um Komponenten mit großer CV innerhalb von Replikationsproben und Intensitätsfiltern zu entfernen. Um Komponenten zu entfernen, die bei Rauschpegel erkannt wurden, gehen Sie manuell durch jede Komponente und wählen Sie diejenigen mit einem genau definierten Peak oder einem relativ großen Unterschied in verschiedenen Probentypen für die Datenbanksuche aus. Exportieren Sie abschließend die Daten mit Treffern in die Datenbank.

Die Genauigkeit der Metabolomik-Daten hängt stark von der Leistung des lc QEMS-Instruments ab, um zu beurteilen, ob das Gerät in gutem Zustand funktioniert und ob die angewandte Methode richtig ist. Mehrere bekannte Metaboliten-lc-Peaks wurden aus der Gesamtionenchromatographie extrahiert, wie hier gezeigt. Polare Metaboliten wie Aminosäuren, Glykolyse, Zwischenprodukte, TCA, Zwischenprodukte, Nukleotide, Vitamine A, TP und NADP haben eine gute Retention auf der Säule und gute Peakformen unter den aktuellen lc-Bedingungen.

In der Zwischenzeit wird innerhalb von 24 Stunden nach der Kalibrierung mit geringer Masse, wie dargestellt, ein Massenfehlertest durchgeführt. Hier wird der Massenfehler bewertet, indem das detektierte Masse-Ladungs-Verhältnis mit dem theoretischen Masse-zu-Ladungs-Verhältnis der Zielmetaboliten verglichen wird. Dabei haben die Zielmetaboliten ein Masse-Ladungs-Verhältnis von 74 bis 744.

Die Y-Achse stellt hier den akkumulativen Prozentsatz der Metaboliten innerhalb eines bestimmten Massenfehlerbereichs dar. Die blaue Kurve zeigt das Ergebnis von null bis 12 Stunden, während die rote farbige Kurve die Daten zeigt, die von 12 bis 24 Stunden nach der Kalibrierung gesammelt wurden. Mehr als 90 % der Metaboliten liegen innerhalb eines Massenfehlers von fünf Teilen pro Million, was bedeutet, dass die hier entwickelte Kalibrierungsmethode für den niedrigen Massenbereich ausreicht, um einen Massenfehler von fünf Teilen pro Million für die Erkennung eines niedrigen Massenbereichs aufrechtzuerhalten.

Ein weiteres Problem, das angegangen werden muss, ist die Empfindlichkeit des Instruments mit der aktuellen Methode und dem aktuellen Instrumenten-Setup. Eine serielle Verdünnung von dreifachen Proben aus einer 10 Zentimeter großen Petrischale wurde fünfmal mit einem Verdünnungsfaktor von sechs durchgeführt, was zu sechs verschiedenen Probenkonzentrationen führte. Eine gezielte Liste wird verwendet, um die Anzahl der Metaboliten zu bewerten, die in unterschiedlichen Konzentrationen der Probe nachgewiesen wurden.

Die hier gezeigten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die optimale Anzahl der nachgewiesenen Zielmetaboliten zwischen 2,78 mal 10 bis zur fünften und 1,67 mal 10 für die sechs Zellen liegt, während einer mal 10 für die sieben Zellen eine geringere Anzahl an nachgewiesenen Metaboliten ergibt, was auf Ionensuppressionseffekte zurückzuführen ist. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die optimale Menge an Zellen, die für diese Analyse extrahiert werden sollen, ungefähr der eines Brunnens in einer Platte mit sechs Vertiefungen entspricht. Für die ungezielte Metabolitenanalyse wird ein CV-Cutoff von 20 % und ein durchschnittlicher Intensitätswert von 10 bis zum siebten Wert verwendet, um die Komponententabelle zu filtern.

Die CV-Cutoff-Werte können erhöht werden, während die durchschnittlichen Intensitätswerte gesenkt werden müssen, um mehr Peaks einzubeziehen. Nach manueller Überprüfung der Peaks werden Komponenten mit guten Formen ausgewählt und in der Humanmetabolom-Datenbank gesucht. Die Ergebnisse von Daten, die im positiven Modus gesammelt wurden, werden hier aufgelistet, während die Ergebnisse aus dem negativen Modus hier aufgeführt sind. Einige der hier identifizierten Metaboliten überlappen sich mit den Metaboliten in der Zielliste, wie z. B. Glutathion und Prolin.

Weitere Metaboliten, die in der Zielliste nicht enthalten sind, werden ebenfalls untersucht, wie z. B. Methylglyoxal, das aus der Glykolyse gewonnen werden kann, und ein PTO, zwei ELE SN Glycerin und drei Phosphocholin, das im positiven Modus mit einer Retentionszeit von 3,2 Minuten nachgewiesen wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Polymetaboliten aus kultiviertem SARS extrahiert und dann RC QES verwendet, um die relativen metabolisierten Spiegel in verschiedenen Proben zu messen. Danke für das Aufpassen.