Mit Hilfe eines α-Bungarotoxin Binding Site Tag an GABA A-Rezeptor-Membranlokalisierung und Handel Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Lokalisierung der Gaba-Rezeptoroberfläche und die Endozytose in Hippocampus-Neuronen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst Hippocampus-Neuronen mit der getaggten Gaba-Rezeptor-Untereinheit durchtrennt werden und die kultivierten Neuronen sich im Inkubator entwickeln können. Der zweite Schritt besteht darin, die Oberflächen-Gaba-Rezeptoren mit alpha bungalow toin gekoppelter fluoreszierender Alexa zu markieren.

Anschließend werden die Neuronen zu verschiedenen Zeitpunkten inkubiert, um die Endozytose der markierten Rezeptoren zu ermöglichen. Der letzte Schritt besteht darin, die Proben zu den richtigen Zeitpunkten zu fixieren und eine Immunfärbung mit Anti-GFP durchzuführen, um den gesamten markierten Rezeptorpool zu beobachten. Letztendlich wird die konfokale Mikroskopie verwendet, um Veränderungen in der Oberflächenlokalisation und Endozytose der getaggten Gabaa-Rezeptoren mit Hilfe von festen oder Live-Bildgebungsansätzen darzustellen.

Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des Rezeptortransports zu beantworten, z. B. welchen Einfluss die Ligandenbindung auf die Rezeptorendozytose und die Insertionsraten haben kann und ob verschiedene Liganden und Modulatoren das Rezeptorrecycling und den Rezeptorabbau beeinflussen können. Obwohl diese Methode zur Untersuchung ligierter Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelter Rezeptoren hauptsächlich im Kontext des Nervensystems verwendet wurde, kann sie auch zur Untersuchung der dynamischen Lokalisation und des Transports anderer Membranproteine in Zellkulturen und Primärzellen verschiedener Gewebe angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aus zwei Gründen Schwierigkeiten haben.

Erstens, um funktionale Konstrukte zu schaffen, und zweitens, um mehrere Zeitpunkte gleichzeitig zu verarbeiten und zweitens, um mehrere Zeitpunkte gleichzeitig zu verarbeiten. Bereiten Sie zunächst vier bis fünf runde Abdeckfolien aus Poly de Lysin-beschichtetem Glas in jeder 3,5 Zentimeter großen Gewebekulturschale vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Transfizieren Sie dann am Tag der Kultivierung frisch dissoziierte Neuronen mit ein bis vier Mikrogramm einer auf Maxi vorbereiteten DNA-Platte.

Die transfizierten Neuronen auf dem mit Poly de Lycine beschichteten Deckglas liegen bei einer Enddichte von etwa 200.000 Neuronen pro 3,5 Zentimeter großer Schale auf. Ersetzen Sie das Medium vier bis 24 Stunden nach der Vorbereitung der neuronalen Kulturen. Lassen Sie dann die Neuronen im Inkubator bis zu 14 bis 17 Tagen in vitro oder bis zum gewünschten Stadium entwickeln, um den Endozytose-Assay durchzuführen.

Stellen Sie zunächst ein Tischkühlgerät auf 16 Grad Celsius ein. Kühlen Sie extrazelluläre Haufen, gepufferte Kochsalzlösung oder HBS im Wasserbad auf 16 Grad Celsius ab. Übertragen Sie die Neuronenschalen bei 16 Grad Celsius auf die Aluminiumplatte und kühlen Sie sie fünf Minuten lang ab.

Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch einen Milliliter 16 Grad Celsius HBS plus 150 Mikromolaren zwei Bo Rine für zwei Minuten. Als nächstes geben Sie das Medium in einen beschrifteten Abfallbehälter und ersetzen es durch einen Milliliter 16 Grad Celsius HBS plus zwei Bo Kerine plus Alpha Bungalow Toxin. Alexa 5 9 4 inkubiert 15 Minuten lang bei 16 Grad Celsius.

Nach der Inkubation wird das Medium in einen beschrifteten Abfallbehälter umgefüllt und das Geschirr dreimal mit zwei Millilitern 16 Grad Celsius HBS für Live-Imaging-Zeitreihenexperimente nach der Rezeptorendozytose mit einer 3,5 Zentimeter großen Kulturschale mit Glasboden gewaschen. Schieben Sie die Schale auf einen erhitzten Tisch am Mikroskop und beginnen Sie mit der Bildgebung mit einem Konfokal- oder Rasenmikroskop. Eingerichtet für feste Deckgläser.

Transfer T entspricht dem Null-Zeitpunkt-Deckel und wird für 20 Minuten für andere Zeitpunkte in eine Schale mit Raumtemperatur mit 4 % Para-Formaldehyd und 4 % Saccharose gelegt. Ersetzen Sie HBS durch konditioniertes äquilibriertes Medium mit 37 Grad Celsius und kehren Sie zu den erforderlichen Zeitpunkten zur Endozytose bei 37 Grad Celsius in den Inkubator zurück. Nehmen Sie das Geschirr aus dem Inkubator und spülen Sie es zweimal schnell mit zwei Millilitern Raumtemperatur, Delcos-Phosphat, gepufferter Kochsalzlösung oder DPBS.

Fixieren Sie dann die Probe 20 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd und 4 % Saccharose. Nach einer 20-minütigen Fixierung 4 % Paraformaldehyd und 4 % Saccharose in den Abfallbehälter geben und das Geschirr zweimal mit zwei Millilitern DPBS bei Raumtemperatur spülen. Inkubieren Sie anschließend die Deckgläser 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Eine Immunfluoreszenzblocklösung, die 0,2 % Triton X 100 enthält, um die Neuronen zu permieren und die Anti-GFP-Immunfärbung des intrazellulären Rezeptorpools und/oder die Markierung anderer Proteine von Interesse zu ermöglichen. Entfernen Sie dann die durchlässige Blocklösung und inkubieren Sie die Deckgläser 20 bis 30 Minuten lang in Immunfluoreszenz-Blocklösung ohne Triton X 100. Primärantikörper-Inkubationen von Deckgläsern in Block für mehrere Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius nach der Inkubation durchführen.

Waschen Sie die Eindeckeinlagen, indem Sie sie fünf Minuten lang in DPBS einweichen, um insgesamt drei Wäschen zu erhalten. Anschließend werden die Deckgläser mit Sekundärantikörpern in Blocklösung nach einer Stunde eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Waschen Sie die Deckgläser wie bisher dreimal mit DPBS.

Montieren Sie anschließend jeden Deckglas, indem Sie überschüssige Flüssigkeit von der Rückseite des Deckglases mit Laborgewebe entfernen und dann den Deckglas auf vier Mikroliter Eindeckmedium auf einem Objektträger umdrehen. Führen Sie die Bildaufnahme mit konfokaler Mikroskopie unter experimentellen Bedingungen mit einer numerischen Ölapertur von 60 x durch. 1.49 Immersionsziel.

Mit denselben Bildaufnahmeeinstellungen können Sie einzelne Z-Schnittbilder mit dem neuronalen Zellkörper und mehreren dendritischen Prozessen im Fokus aufnehmen, um Alpha-Bungalow-Toxin, Alexa-Fluoreszenzsignal und GFP-Immunfärbung entlang von 20 Mikrometern von drei bis vier proximalen Dendriten pro Neuron zu quantifizieren, wobei der gleiche Schwellenwert für die Analyse aller Endozytosedaten verwendet wird. Analysieren Sie Daten von 10 bis 12 Neuronen für jeden Zeitpunkt. Wiederholung des Experiments mit mehreren unabhängigen neuronalen Kulturen.

GABAerge Axone stellen inhibitorische Kontakte zu pyramidalen Neuronendendriten her. Präsynaptische inhibitorische Terminals werden durch den vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter identifiziert, der GABA und Glycin in synaptische Vesikel lädt. GABA-a-Rezeptoren stehen in engem Gegensatz zu den Neurotransmitter-Freisetzungsstellen, die durch das postsynaptische inhibitorische Gerüst angebunden sind.

Hier wird die Endozytose von alpha zwei enthaltenden GABA A Rezeptor und Hippocampus-Neuronen nach 15 Tagen in vitro gezeigt alpha bungalow toxin. Fluoreszenz: Messungen einzelner dendritischer Prozesse, wie sie in den Panels gezeigt werden, werden über die GFP-Antikörper auf das Niveau der Konstruktexpression normiert. Der abschließende Vergleich der Zeitpunkte erfolgt durch Normalisierung auf die Messung von T gleich Null.

Die Quantifizierung der Internalisierung von Rezeptoren über einen Zeitraum von 60 Minuten aus Fluoreszenzsignaländerungen im Laufe der Zeit wurde am besten durch eine einzelne Exponentialfunktion beschrieben. Ein alternativer Ansatz besteht darin, die Rezeptorendozytose in einem einzelnen Neuron durch konfokale Live-Bildgebung im Zeitraffer zu verfolgen. Die punktuelle und überlappende Fluoreszenz von P-H-G-F-P-markierten GABA A-Rezeptoren und Oberflächen-Alpha-Bungalow-Toxin-markierten Rezeptoren ist zu Beginn des Experiments sichtbar: Im Laufe des Zeitraums nimmt das Alpha-Bungalow-Toxin-markierte GABA-A-Rezeptorsignal ab, wenn die Rezeptoren endozytosieren.

Während das P-H-G-F-P-Signal aufgrund der Insertion neuer Rezeptoren hoch bleibt, ist die minimale Abnahme des P-H-G-F-P-Signals auf Änderungen der Rezeptorverteilung auf der Zelloberfläche und Photobleaching nach diesem Verfahren zurückzuführen. Andere Methoden, wie z. B. Bungalow-Toxin-Insertionsassays, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Rezeptor-Insertionsraten mit verschiedenen Behandlungen zu beantworten. Mit dieser Technik kann man beurteilen, wie zelluläre Aktivität, spezifische Proteindomänen, Agonisten und andere Modulatoren den Rezeptorumsatz in lebenden Neuronen, anderen Zellen und Geweben beeinflussen können.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Alpha-Bungalow-Toxin-gekoppelte Alexa-Farbstoffe in Kombination mit Standard-Immunfluoreszenztechniken verwenden können, um die Lokalisierung von Oberflächenrezeptoren in Hippocampus-Neuronen zu quantifizieren.