Name: Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Lernen Sie die Probenvorbereitung für Atomic Force Microskopie und Super-Resolution Fluoreszenzmikroskopie von Viren. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Virion-Adhäsion auf Glasoberflächen für hochauflösende Bildgebung.

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Wir danken Dr. Till Böcking für das ursprüngliche Einzelmolekül-Vorbereitungsprotokoll. 
Diese Arbeit wurde durch den NSF-Zuschuss 1121972(SS) unterstützt.

<ol><li>Pang, H. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virion+stiffness+regulates+immature+HIV-1+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry.</a> Retrovirology. 10, 4(2013).</li>
<li>Kol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Stiffness+Switch+in+Human+Immunodeficiency+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus.</a> Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).</li>
<li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+tip%E2%80%93sample+forces+in+jumping+mode+atomic+force+microscopy+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Minimizing tip–sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid.</a> Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).</li>
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<li>Hernando-Pérez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Virology%3A+Direct+Measurement+of+Phage%5BTitle%5D)+AND+%22phi29+Stiffness+Provides+Evidence+of+Internal+Pressure+%28Small+15%2F2012%29.+Small%22%5BJournal%5D)">Physical Virology: Direct Measurement of Phage.</a> phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).</li>
<li>Carrasco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-mediated+anisotropic+mechanical+reinforcement+of+a+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).</li>
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<li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).</li>
<li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Kinetics+of+%CE%BB+Exonuclease+Reveal+Base+Dependence+and+Dynamic+Disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Kinetics of λ Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li>
<li>Böcking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+a+molecular+disassemblase+reveals+the+mechanism+of+Hsc70-driven+clathrin+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).</li>
<li>Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+First+Five+Seconds+in+the+Life+of+a+Clathrin-Coated+Pit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit.</a> Cell. 150, 495-507 (2012).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%2C+Spectrin%2C+and+Associated+Proteins+Form+a+Periodic+Cytoskeletal+Structure+in+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons.</a> Science. 339, 452-456 (2013).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hodges, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+packaging+of+polymerases+within+vesicular+stomatitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).</li>
<li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li>
</ol>

Die Autoren haben in dieser Zeitung keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Als alternative Methode zur CryoEM-Tomographie kann eine Einzelvirion-Bildgebung mit AFM und hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung verwendet werden. Jede dieser Methoden hat ihre spezifischen Stärken. Zum Beispiel kann AFM auf WT Virionen ohne Anforderung auf Diepging der Probe oder der internen viralen Proteine durchgeführt werden. Die Lage viraler Strukturen ist von ihren Beiträgen zu den elastischen Eigenschaften der Virion entkoppelt.
Single Virion Super-Resolution Imaging in Kombination mit den neu entwickelten viralen Reverse genetischen Ansätzen wird eine leistungsfähige Technik zur Lokalisierung der niedrigen Kopierzahl viraler Proteine20. Rekombinante Viren mit Ersatz ihrer Proteine durch Proteine, die zu fluoreszierenden Proteinen verschmolzen sind, können mit diesen umgekehrten genetischen Ansätzen hergestellt und gereinigt werden. Obwohl die Superauflösungsabbildung zum Teil aufgrund der genetischen Kennzeichnung Spezifität hat, erfordert sie die Verwendung der mutierten Viren.
AFM und Super-Resolution Imaging sind kostenlose Methoden, die sehr ähnliche Probenpräparate verwenden. Die in diesem Papier beschriebenen Methoden, die von früheren Einzelmolekül-Bildgebungs-Assays übernommen werden, ermöglichen die Verankerung einzelner Virionen mit geringen Auswirkungen auf die Topologie der Virionen.

Ladungsbasierte unspezifische Wechselwirkungen werden routinemäßig zur Adhäsion von Virionen in der Atomkraftmikroskopie1,2verwendet. Diese Techniken funktionieren besonders gut, wenn sie auf nicht umhüllten Virionen mit sehr steifen Kapsids3-6verwendet werden. Obwohl diese Techniken sehr effektiv bei der Immobilisierung der Probe sind, verhindern sie nicht die unspezifische Bindung von Proteinen an die Oberfläche. Die unspezifische Bindung kann ein Problem verursachen, wenn versucht wird, Virionen mit AFM und super-Resolution-Fluoreszenztechniken abzubilden, die Inkubationen der Probe mit verschiedenen Antikörpern erfordern. Hier skizzieren wir eine Beispielvorbereitungsmethode für die spezifische Immobilisierung von Virions.
Poly(Ethylenglykol) (PEG) mit Poly(L-Lysin) (PLL) veredelt und auf eine Glasoberfläche adsorbiert stellt einen signifikanten Block für die elektrostatischen Wechselwirkungen von Proteinen mit Glas7. Einzelmolekül-Assays, die eine Immobilisierung einzelner Moleküle auf Glasoberflächen erfordern, haben diese Eigenschaft genutzt und sie verwendet, um eine spezifische PEG-basierte Einzelmolekül-Immobilisierungstechnik8-10zu erstellen. Dieses Präparat wurde auch verwendet, um Clathrinkäfige auf die Glasoberfläche11 zu immobilisieren sowie eine homogene Fibronectin-Beschichtung für die Kontrollzellhaftung 12zu schaffen.
Wir haben das Probenvorbereitungsverfahren auf DerGrundlage der PLL-g-PEG-Adsorption auf Glasoberflächen aus bildgebenden Methoden für einzelne Moleküle übernommen und auf bildgebende Einzelvirionen des vesikulären Stomatitisvirus (VSV) angewendet. Diese einzelnen Virionen wurden mit Hilfe der Atomkraftmikroskopie (AFM) abgebildet. Ähnliche Experimente wurden auch an funktionalisierten Perlen als Kontrolle durchgeführt. Die Virionen wurden auch durch superhochauflösende Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, wenn ein VSV-G-Antikörper mit Alexa 647 beschriftet wurde, um ein Bild der Umhüllung einzelner Virionen zu erstellen. Hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung nutzt die Lokalisierung einzelner Moleküle, um ein Bild13-15zu erstellen. fPALM bi-planare Bildgebung ermöglicht die Lokalisierung einzelner Moleküle mit 20 nm in der Ebene und 50 nm Auflösung entlang der optischen Achse15,16. Diese biplanare Technik wurde verwendet, um in dieser Studie enthaltene fluoreszierende Bilder mit superauflösung abzubilden. Eine alternative Technik, die ähnliche Ergebnisse hat, ist STORM13,17,18.
Sowohl AFM als auch superhochauflösende fluoreszierende Bilder von VSV, die durch die in diesem Papier beschriebenen Verfahren am Glas verankert sind, zeigten eine spezifische Bindung von Virionen an das Glas mit minimalen unspezifischen Wechselwirkungen19. Hier stellen wir die Probenvorbereitungsprotokolle für die AFM- und super-resolution fluoreszierenden Bildgebungsexperimente vor. Kurz gesagt: Saubere Glasabdeckungen werden funktionalisiert, indem eine Mischung aus PLL-g-PEG und PLL-g-PEG-Biotin adsorbiert wird. Es ist typisch für diesen dünnen Film, der entwickelt werden kann, um zwischen 15-25% funktionalisiertes Biotin auf einer beschichteten Oberfläche zu liefern. Die Coverlips werden weiter mit tetramerischem Avidin inkubiert. Ein biotinylierter viraler Antikörper wird dann verwendet, um eine einzigartige Bindungsstelle für die Virionen zu schaffen. Die Bindung des Antikörpers kann auf zwei Arten erfolgen.
Die erste Methode ist für AFM optimiert, bleibt jedoch für die Hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung geeignet. Bei diesem Verfahren wird die avidinbeschichtete Oberfläche vor der viralen Adhäsion mit biotinylierten Antikörpern behandelt. Die immobilisierten Virionen werden mit Alexa 647-beschrifteten Antikörpern behandelt, um die Hülle zu bedecken und eine superhochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung der Virionen zu ermöglichen.
Die zweite Methode besteht darin, das Virus in Lösung mit dem biotinylierten Antikörper und dem von Alexa 647 markierten Antikörper anzugreifen, bevor die Viren an der mit Avidin behandelten Oberfläche haften; Diese Methode ist für superauflösende Fluoreszenz-Bildgebungsexperimente optimiert, bei denen die Wiederherstellung der viralen Hülle wichtig ist. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass eine gleichmäßige Antikörperbeschichtung auf der viralen Oberfläche möglich ist. Der biotinylierte Antikörper kann mit Alexa 647 als virale Antikörper in Verhältnissen vermischt werden, die eine ausreichende Adsorption des Virus auf die mit Avidin behandelte Oberfläche ermöglichen und gleichzeitig eine hohe Konzentration an fluoreszierendem Etikett an der Außenseite der viralen Hülle beibehalten. Diese Alexa 647 markierten viralen Antikörper sind nicht biotinyliert und ihr Überschuss kann wegspült werden, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren.

<table><tbody><tr><td>Glasdeckgläser (fPALM)</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen</td><td>72225-01</td><td>25 mm Deckgläser</td></tr><tr><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)&nbsp;</td><td>SuSoS-Bestand</td><td></td><td>: 0,5 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>NeutrAvidin Biotin-bindendem Protein</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td>Bestand: 0,25 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>1:200 in 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10% Glykol, pH 7,2 Puffer</td></tr><tr><td>&alpha;-VSV-G&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>ab34774</td><td>1:200 in 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10% Glykol, pH 7,2 Puffer</td></tr><tr><td>Gluox</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>Glukoseoxidase Typ sieben von Aspergillius&nbsp;</td></tr><tr><td>Katalase</td><td>Sigma</td><td>C40-100mg</td><td>Katalase aus Rinderleber&nbsp;</td></tr><tr><td>MEA</td><td>Sigma</td><td>30070-10G</td><td>Cysteamin (MEA</td></tr><tr><td>Stammpuffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 10 mM NaCl + 10 % Glukose</td></tr><tr><td>NTE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer, Mini-Dialysegerät</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>10.000 MW</td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas: 35 CIRCLE #1</td><td>Fisherbrand</td><td>35 CIRCLE #1</td><td></td></tr></tbody></table>

probenvorbereitung für single virion atomic force microscopy und super-resolution fluorescence imaging

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Die Immobilisierung von Virionen auf Glasoberflächen ist ein entscheidender Schritt in der Einzelvirionen-Bildgebung. Hier stellen wir eine Technik vor, die aus einzelmolekül-Bildgebungs-Assays übernommen wird, die die Haftung einzelner Virionen auf Glasoberflächen mit Spezifität ermöglicht. Diese Zubereitung basiert auf der Veredelung der Glasoberfläche mit einer Mischung aus PLL-g-PEG und PLL-g-PEG-Biotin, der Zugabe einer Avidinschicht und schließlich der Bildung von Virionankern durch Anhaftung biotinylierter virusspezifischer Antikörper. Wir haben diese Technik in einer Reihe von Experimenten angewendet, einschließlich der Atomkraftmikroskopie (AFM) und der superauflösenden Fluoreszenz-Bildgebung. Diese Probenvorbereitungsmethode führt zu einer Kontrollhaftung der Virionen an der Oberfläche.

Einzelvirionen-Bildgebung mit AFM:
Das oben beschriebene Probenvorbereitungsprotokoll wurde bei der Verankerung von Wildartenvirionen an der Glasoberfläche verwendet. VSV-Virionen sind kugelförmig mit einer Länge von 180 nm und einem Durchmesser von 80 nm. Da es eine Vielzahl von Virions gibt, für die diese Technik angewendet werden kann, wird das Konzept auch hier auf biotinylierten 36 nm Perlen demonstriert. Die resultierenden AFM-Experimente sind in Abbildung 1dargestellt. Es ist wichtig zu beachten, dass die VSV-Virionen einen niedrigeren Young-Modul (100 MPa) im Vergleich zu den nicht umhüllten Viren (GPa) haben. Die besonderen Bilder von Single Virion VSV wurden im Abstichmodus unter Umgebungsbedingungen mit einem steifen Ausleger erhalten. Das Ziel war es, das Virus so weit zu verformen, dass die zusätzliche Proteindichte innerhalb des Virus als Beule innerhalb des AFM-Bildes sichtbar wird. Diese Methode wird verwendet, um die zusätzliche Proteindichte innerhalb der Virushöhle19zu erkennen.
Einzelvirion Super Auflösung Bildgebung:
Alexa 647 mit VSV-G-Antikörpern beschriftet wurden verwendet, um die Hülle einzelner VSV-Virionen für Super-Auflösungsexperimente mit Methode 5A zu beschichten. Um die Tetheringdichte und die geringe unspezifische Bindung zu veranschaulichen, ist in Abbildung 2Aein großer Scan der Probe dargestellt. Die Wiederherstellung des viralen Umschlags auf einer repräsentativen Virion ist in Abbildung 2B (blaue Isooberfläche) dargestellt.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
Abbildung 1. AFM-Bildgebung von Perlen und VSV auf der funktionalisierten PEGG-Oberfläche. AFM-Scan von 36 nm biotinylierten Perlen (A, B) und einem VSV Virion (C), der mit einem biotinylierten VSVG-Antikörper an der Oberfläche verankert ist. AFM wurde im AC-Luft-Topographie-Scan-Modus durchgeführt. Der Spitzenradius beträgt <25 nm und Messungen wurden unter Kraftmodulation und Lichtabstich durchgeführt. Die Spitze hatte eine Kraftkonstante von 3 N/m und Resonanzfrequenz 75 kHz mit einer Unsicherheit von 15 kHz. Während die Perlen während des AFM-Scans ihre Höhe beibehalten haben, hat das VSV Virion einen deutlich kleineren Jungmodul und ist in der Höhe deutlich verformt. In diesem Bild wurde das Virion speziell mit einem steifen Ausleger im Abstichmodus abgebildet, der eine kleine xy-Konvolution erzeugte (zur Bestimmung der Spitze vs. stumpfes Ende des Virus) und der Höhenunterschied zwischen der Spitze und dem stumpfen Ende des Virus wird verwendet, um zusätzliche Proteindichte am stumpfen Ende des Virus19zu erkennen.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> Abbildung 2. Fluoreszenzbasierte Abbildung von VSV-Virionen auf der funktionalisierten Oberfläche von PEGG. A) rekombinante VSV-Virionen, die auf der PEGG-Oberfläche mit einem biotinylierten Anti-VSVG-Antikörper in Weitfeldfluoreszenz immobilisiert wurden. B) Hochauflösende Fluoreszenzrekonstruktion der Anhüllung von VSV, die durch einen biotinylierten Anti-VSVG-Antikörper an der PEGG-Oberfläche befestigt ist und mit Alexa 647-beschrifteten Anti-VSVG-Antikörpern verziert ist (Methode 5A wurde zur Erstellung dieser Bilder verwendet). Die blaue Oberfläche ist eine 2D-Isooberflächenprojektion. Links zeigt ein Modell des kugelförmigen Virus. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">Coverslip Größe</td>
			<td style="width:93px;">Flüssigkeit</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 mm</td>
			<td>65 l</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 mm</td>
			<td>50 l</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 mm</td>
			<td>36 l</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 mm</td>
			<td>25 l</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 mm</td>
			<td>16 l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Fluid aliquots nach Deckslipgröße.

Die Befestigung von Virionen an einer Oberfläche ist eine Voraussetzung für eine einzelne Virionen-Bildgebung durch Super-Resolution Fluoreszenz-Bildgebung oder Atomkraftmikroskopie (AFM). Hier zeigen wir ein Probenvorbereitungsverfahren zur kontrollierten Haftung von Virionen auf Glasoberflächen, die für den Einsatz in AFM und Super-Auflösungfluoreszenz-Bildgebung geeignet sind.

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Dieses Verfahren dient der Herstellung von Glasdeckträgern mit Viren für die Atomkraftmikroskopie und die hochauflösende Mikroskopie, beispielsweise die fluoreszenzbasierte, photoaktivierbare Lokalisierungsmikroskopie. Zunächst wird das Glas-Substrat gereinigt und mit einem dünnen Film teilweise biotinylierten Polyethylenglykols, der an Poly-L-Lysin angepfropft ist, beschichtet. Anschließend wird die Oberfläche mit Avadon behandelt, um die Bindungsaffinität des biotinylierten Films zu erhöhen.Behandeln Sie die Oberfläche nun mit biotinylierten Antikörpern, die spezifisch für das Virus der Untersuchung sind. Anschließend wird die mit Antikörpern präparierte Oberfläche mit dem Virus der Untersuchung behandelt. Im Gegensatz zur Spin-Beschichtung bietet diese Methode den Vorteil, dass Varianten gleichmäßig über die Oberfläche verteilt werden.Um die Mikroskopie zu optimieren, stellen Sie die Deckgläser senkrecht in eine Teflon-Deckglas-Halterung passender Größe und tauchen Sie sie in ein Becherglas mit filtriertem Ethylalkohol ein, das 30 Minuten lang ultraschallbehandelt wird. Anschließend spülen Sie die Deckgläser gründlich mit ultrareinem Wasser ab. Danach stellen Sie die Deckgläser in eine separate, saubere Teflon-Halterung und ein Becherglas, das mit einer einmolaren Natronlauge gefüllt ist, und behandeln sie 30 Minuten lang ultraschallmäßig. Abschließend spülen Sie sie erneut gründlich mit ultrareinem Wasser ab.Trocknen Sie die gespülten Deckgläser nun unter einem Stickstoffstrom und überführen Sie sie in ein sauberes, trockenes Teflon-Gestell. Stellen Sie sicher, dass jedes Deckglas frei von sichtbarem Film oder Partikeln ist. Unmittelbar nach dem horizontalen Trocknen im Stickstoffstrom legen Sie ein Deckglas in eine sterile Petrischale und pipettieren die geeignete Menge biotinyliertes Polylysin-gebundenes Polyethylenglykol in PBS auf die Mitte des Deckglases.Platzieren Sie einen weiteren sauberen Deckel auf die Flüssigkeit nach der Sandwichmethode. Stellen Sie sicher, dass das Volumen zwischen den aktiven Flächen der beiden Deckel vollständig mit Flüssigkeit gefüllt ist. Bedecken Sie die Petrischale und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 45 bis 60 Minuten.Nehmen Sie danach das Sandwich mit einer Pinzette auf, ohne die überschüssige Flüssigkeit herauszudrücken. Drücken Sie nun mit Daumen und Zeigefinger leicht und horizontal auf das Sandwich. Verschieben Sie die Deckgläser in entgegengesetzte Richtungen und trennen Sie sie, ohne die aktiven Flächen zu berühren.Spülen Sie beide aktiven Flächen mit 25 Milliliter ultrareinem Wasser ab. Trocknen Sie die Deckgläser nun mit einem Stickstoffstrom und legen Sie fest, welche Deckglasflächen aktiv sind, in eine sterile Petrischale. Legen Sie ein behandeltes Deckglas mit der aktiven Fläche nach oben und pipettieren Sie eine geeignete Menge der aufgetauten Probenlösung in die Mitte der aktiven Fläche. Legen Sie eine weitere Deckglas mit der aktiven Fläche nach unten auf, um die Flüssigkeit einzuschließen, und inkubieren Sie sie dann bei Raumtemperatur für 25 bis 30 Minuten. Trennen Sie danach die beiden Deckgläser, wie zuvor gezeigt. Achten Sie darauf, die aktiven Flächen nicht zu berühren.Spülen Sie nun beide aktiven Flächen mit 25 Milliliter ultrareinem Wasser ab und trocknen Sie die Deckgläser mit einem Stickstoffstrom. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, welche Deckglasflächen aktiv sind. Zur späteren Referenz stellen Sie ein avidinbehandeltes Deckglas mit der aktiven Fläche nach oben unverzüglich in eine sterile Petrischale und pipettieren Sie eine geeignete Menge aufgetauten biotinylierten Antikörpers in die Mitte der aktiven Fläche.Platzieren Sie einen weiteren Deckel mit der aktiven Fläche nach unten auf die Flüssigkeit nach der Sandwich-Methode. Anschließend inkubieren Sie für 45 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Trennen der beiden Deckgläser spülen Sie beide aktiven Flächen mit 25 Milliliter PBS ab. Danach platzieren Sie ein mit Antikörper behandeltes Deckglas mit der aktiven Fläche nach oben in eine sterile Petrischale und pipettieren eine geeignete Menge Virus in die Mitte der aktiven Fläche.Jetzt mit einem zweiten aktiven Deckel, Deckfolie, Abdeckung versehen und inkubieren. Danach die beiden Deckfolien voneinander trennen. Beide aktiven Flächen mit 25 Milliliter PBS spülen und in ein Teflon-Gestell sowie einen mit PBS gefüllten Becher überführen.Verwenden Sie die vorbereiteten Proben sofort oder lagern Sie sie bis zu drei Tage bei vier Grad Celsius. Hier wurden Wildtyp-Varianten des vesikulären Stomatitis-Virus an der Glasoberfläche verankert und mittels Rasterkraftmikroskopie analysiert. Die Breite und Länge des Virions betragen 80 Nanometer mal 180 Nanometer und zeigen minimale Verzerrungen gegenüber der ursprünglichen Größe des Virions.In diesem Experiment wurde das einzelne Virion mittels fluoreszenter Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie abgebildet. Unter Verwendung von Alexis 647-markierten VSVG-Antikörpern. Die blaue Isosurface zeigt die rekonstruierte Oberfläche des Virions, ermittelt mittels FOM-Mikroskopie.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Glasdeckgläser mit Viren für die Verwendung in der Rasterkraftmikroskopie oder der Super-Resolution-Mikroskopie vorbereitet. Es ist wichtig, stets im Hinterkopf zu behalten, welche Seite des Deckglases die aktive Chemie aufweist.

sample-preparation-for-single-virion-atomic-force-microscopy-super

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Einzel-Virus Genomics (SVG) ist eine Methode zur Isolierung und verstärken die Genome einzelner virons. Virussuspensionen einer gemischten Anordnung sortiert werden mittels Durchflusszytometrie auf einen Objektträger mit diskreten Vertiefungen, Agarose, wodurch die Erfassung des Virions und Verringerung Genom Scherung während der Weiterverarbeitung. Amplifikation des gesamten Genoms erfolgt über mehrere Displacement Amplification (MDA), was genomische Material, das für die Sequenzierung...

Isolation und Genomanalyse Einzel Virionen mit &#39;Single Virus Genomics&#39;

Quelle: Zeigler Allen, L., et al. Isolierung und Genomanalyse einzelner Virionen mittels „Single Virus Genomics“ J. Vis. Exp. (2013).Dieses Video zeigt, wie die Durchflusszytometrie die Isolierung einzelner, genomhaltiger Viren aus gemischten Populationen durch fluoreszenzbasierte Detektion und präzise Partikelsortierung ermöglicht, gefolgt von der Einbettung in Agarose für die anschließende genomanalytische Charakterisierung.

Fluoreszenzbasierte Sortierung einzelner Viruspartikel für die genomische Analyse

Diese Handschrift verwendet das Fiji-basierte Open-Source-Software-Paket VirusMapper Einzelpartikelanalyse Superauflösungsmikroskopische Bilder anzuwenden, um genaue Modelle der nanoskaligen Struktur zu erzeugen.

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur subzellulären Protein Lokalisierung auf Zebrafisch Netzhaut Ergebnisse korrelieren Höchstauflösung Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie Bilder scannen.

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Kombination von zwei Probe-Verarbeitungstechniken, Hochdruck, Einfrieren und Mikrowellen-gestützte Probenverarbeitung, gefolgt von minimal Harz für die Datenerfassung mit fokussierten Ion Beam Rasterelektronenmikroskop (FIB-SEM) einbetten. Dies wird gezeigt, mit einer Maus tibiale Nerven Probe und Caenorhabditis Elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

Hier beschreiben wir eine einzellige Mikro-Aspirationsmethode zur Trennung infizierter Amöben. Um virale Subpopulationen in Vermamoeba vermiformis zu trennen, die mit Faustoviren und unbekannten Riesenviren infiziert sind, haben wir das unten beschriebene Protokoll entwickelt und seine Fähigkeit demonstriert, zwei neuartige Riesenviren mit geringem Überfluss zu trennen.

Single Cell Micro-Aspiration als Alternative zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung für die Trennung von Riesenviren

Hier stellen wir eine Pipeline für das 3D-korrelative fokussierte Ionenstrahlfräsen vor, um die Präparation zellulärer Proben für die Kryo-Elektronentomographie zu steuern. Die 3D-Position von fluoreszenzmarkierten Proteinen von Interesse wird zunächst durch Kryo-Fluoreszenzmikroskopie bestimmt und dann gezielt gemahlen. Das Protokoll eignet sich für Säugetier-, Hefe- und Bakterienzellen.

Probenvorbereitung durch 3D-korrelatives fokussiertes Ionenstrahlfräsen für die hochauflösende Kryo-Elektronentomographie

Hier werden Protokolle beschrieben, um Virusanordnungen herzustellen, die für die Flüssig-EM- und Kryo-EM-Analyse auf der Nanoskala mittels Transmissionselektronenmikroskopie geeignet sind.

Weiterentwicklung der hochauflösenden Bildgebung von Virusanordnungen in Flüssigkeit und Eis

Dieses Videoprotokoll veranschaulicht die Durchführung einer Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie von virologischen Proben. Für optimale Ergebnisse werden die Proben durch Hochdruckgefrieren und anschließende Gefriersubstitution vorbereitet.

Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie in der Virologie: 3D-Bildgebung von unter hohem Druck eingefrorenen, gefriersubstituierten Proben

Dieses Protokoll beschreibt die fortschrittlichen Bildgebungsanwendungen und das gemeinsame Ressourcenmanagement eines laserabtastenden konfokalen Mikroskopsystems, das mit einem multiplexierten Array-Detektor für hochauflösende zelluläre und subzelluläre Bildgebung integriert ist. Der Workflow ermöglicht multimodale Bildgebung von Konfokal bis Superauflösung (~120 nm) innerhalb einer einzigen Plattform und macht die Visualisierung im Nanomaßstab zugänglicher.

Superauflösende Bildgebung und gemeinsames Management: Ein Protokoll für konfokale Mikroskopie mit Multiplex-Detektion

Lernen Sie die Probenvorbereitung für Atomic Force Microskopie und Super-Resolution Fluoreszenzmikroskopie von Viren. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Virion-Adhäsion auf Glasoberflächen für hochauflösende Bildgebung.

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

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