Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Bei diesem Verfahren werden Deckgläser aus Glas mit Viren für die Verwendung in der Rasterkraftmikroskopie und der hochauflösenden Mikroskopie, wie z. B. der fluoreszierenden photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie, vorbereitet. Reinigen Sie zunächst das Glassubstrat und beschichten Sie das Glas mit einem dünnen Film aus teilweise biotinyliertem Polyethylenglykol, das auf Poly-L-Lysin aufgepfropft ist. Behandeln Sie anschließend die Oberfläche mit Avadon, um die Bindungsaffinität des biotinylierten Films zu erhöhen.

Behandeln Sie nun die Oberfläche mit biotinylierten Antikörpern, die spezifisch für das betreffende Virus sind. Behandeln Sie dann die mit Antikörpern präparierte Oberfläche mit dem gewünschten Virus. Im Gegensatz zum Schleudercoating hat diese Technik den Vorteil, dass Varianten homogen auf der Oberfläche verteilt werden.

Um die Mikroskopie zu optimieren, legen Sie die Deckgläser senkrecht in ein Teflon-Deckglasgestell geeigneter Größe und tauchen Sie sie 30 Minuten lang in ein Becherglas, das mit gefiltertem Ethylalkohol gefüllt ist. Spülen Sie dann die Deckgläser ausgiebig mit Reinstwasser ab. Legen Sie dann die Deckgläser 30 Minuten lang in ein separates, sauberes Teflongestell und einen Becher, die mit einem molaren Natriumhydroxid gefüllt sind, und spülen Sie sie ausgiebig mit Reinstwasser aus.

Trocknen Sie nun die gespülten Deckfolien unter einem Stickstoffstrahl und geben Sie sie in ein sauberes, trockenes Teflongestell. Vergewissern Sie sich, dass jeder Deckglas frei von sichtbarem Film oder Partikeln ist. Unmittelbar nach dem horizontalen Trocknen im Stickstoffstrom legen Sie einen Deckslip in eine sterile Petrischale in der Mitte der Deckglaspipette die entsprechende Menge an biotinyliertem Polylysin, gepfropftem Polyethylenglykol in PBS.

Legen Sie einen weiteren sauberen Deckslip in einer Sandwich-Methode auf die Flüssigkeit. Achten Sie darauf, dass das Volumen zwischen den aktiven Flächen der beiden Deckgläser vollständig mit Flüssigkeit gefüllt ist. Die Petrischale abdecken und 45 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Nehmen Sie als Nächstes das Sandwich mit einer Pinzette auf, ohne die überschüssige Flüssigkeit herauszudrücken. Kneifen Sie nun mit Daumen und Zeigefinger das Sandwich leicht und waagerecht zusammen. Schieben Sie die Deckgläser in entgegengesetzte Richtungen und trennen Sie sie, ohne die aktiven Flächen zu berühren.

Spülen Sie beide aktiven Gesichter mit 25 Millilitern Reinstwasser ab. Trocknen Sie nun die Deckgläser mit einem Stickstoffstrahl und notieren Sie, welche Deckglasflächen aktiv sind, in eine sterile Petrischale. Legen Sie ein behandeltes Deckglas mit der aktiven Fläche nach oben und pipettieren Sie eine angemessene Menge aufgetauter Evidenzlösung in die Mitte des aktiven Gesichts.

Legen Sie einen weiteren Deckslip mit der aktiven Seite nach unten, um die Flüssigkeit einzuklemmen, und inkubieren Sie sie dann 25 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Trennen Sie als Nächstes die beiden Deckgläser, wie zuvor gezeigt. Achten Sie darauf, die aktiven Gesichter nicht zu berühren.

Spülen Sie nun beide aktiven Flächen mit 25 Millilitern Reinstwasser ab und trocknen Sie anschließend die Deckgläser mit einem Stickstoffstrahl. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, welche Deckglasflächen aktiv sind. Legen Sie zum späteren Nachschlagen sofort ein avid und behandeltes Deckglas mit der aktiven Vorderseite nach oben in eine sterile Petrischale und pipettieren Sie eine angemessene Menge des aufgetauten biotinylierten Antikörpers auf die Mitte des aktiven Gesichts.

Legen Sie einen weiteren Deckslip mit der aktiven Fläche nach unten in einem Sandwichverfahren auf die Flüssigkeit. Dann 45 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nachdem Sie die beiden Deckgläser getrennt haben, spülen Sie beide aktiven Gesichter mit 25 Millilitern PBS ab. Legen Sie dann ein mit Antikörpern behandeltes Deckglas mit der aktiven Vorderseite nach oben in eine sterile Petrischale und pipettieren Sie eine angemessene Menge Virus auf die Mitte der aktiven Fläche.

Nun mit einer zweiten aktiven Abdeckung belegen, schlüpfen, abdecken und inkubieren. Trennen Sie nun die beiden Deckgläser. Spülen Sie beide aktiven Gesichter mit 25 Millilitern PBS ab und geben Sie sie in ein mit PBS gefülltes Teflongestell und einen Becher.

Verwenden Sie die vorbereiteten Proben sofort oder lagern Sie sie bis zu drei Tage bei vier Grad Celsius. Hier. Wildtyp-Varions des vesikulären Stomatitis-Virus wurden an der Glasoberfläche verankert und mittels Rasterkraftmikroskopie analysiert. Die Breite und Länge des Virions beträgt 80 Nanometer x 180 Nanometer und weist minimale Verzerrungen gegenüber der ursprünglichen Größe des Virions auf.

In diesem Experiment wurde das einzelne Virion mittels Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisationsmikroskopie abgebildet. Unter Verwendung von Alexis 6 47 markierten VSVG-Antikörpern. Die blaue Isooberfläche zeigt die mit Hilfe der FOM-Mikroskopie gewonnene Oberfläche des Virions.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Glasdeckgläser mit Viren für die Verwendung mit Rasterkraftmikroskopie oder Superauflösungsmikroskopie vorbereiten. Es ist wichtig, sich immer daran zu erinnern, auf welcher Vorderseite des Deckglases die aktive Chemie vorhanden ist.