Name: Methoden zur Erleichterung des mikrobiellen Wachstums in Abfallströmen von Zellstofffabriken und Charakterisierung des biologischen Abbaupotenzials von kultivierten Mikroben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Förderung mikrobiellen Wachstums in Zellstoffabwässern und zur Charakterisierung des biologischen Abbaupotenzials. Diese Technik ermöglicht nachhaltiges Abfallmanagement in der Papierindustrie.

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Wir möchten Jim McMurray für die Bereitstellung des Schwarzschnapses und Dr. David Tilotta und August Meng für ihre Hilfe bei GC-MS danken. Stephanie L. Mathews wurde durch ein USDA National Needs Fellowship (Fördernummer 2010-38420-20399) unterstützt.

1. Sammeln von Schwarzlauge und Aufbereitung von Schwarzlauge für Wachstumskulturen
<ol>
	<li>Entnehmen Sie eine Probe der Schwarzlauge aus dem Auslassventil, das am Kraftfermenter befestigt ist, in einer sterilen Glasflasche und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie mit den folgenden Schritten fortfahren. 
	Neutralisierung</li>
	<li>100 ml Schwarzlauge-Probe werden in ein 500-ml-Becherglas gegeben, das mit einem Rührstab versehen ist.</li>
	<li>Den Becher auf eine Rührplatte stellen und die Geschwindigkeit auf mittlere Stufe stellen.</li>
	<li>Tropfen Phosphorsäure langsam zugeben, bis die Schwarzlauge zähflüssig wird (Viskosität ähnlich wie Glycerin).</li>
	<li>Aliquotieren Sie die gesamte Schwarzlaugenlösung, indem Sie sie langsam in konische 50-ml-Röhrchen gießen und 30 Minuten lang bei 9.300 x g zentrifugieren.</li>
	<li>Legen Sie den Überstand in das Becherglas und messen Sie den pH-Wert mit pH-Testbändern. Das Pellet aus gefälltem Lignin kann entsorgt und als ungefährlicher fester Abfall behandelt werden.</li>
	<li>Weiter Phosphorsäure zugeben und die Lösung zentrifugieren, bis die pH-Streifen einen neutralen pH-Wert des Überstands anzeigen. 
	Sterilisation</li>
	<li>Geben Sie die Lösung durch einen 0,22-μm-Filter, um alle kontaminierenden Bakterien zu entfernen, und geben Sie die gefilterte Lösung zur Lagerung in einen sterilen Behälter. Bei Raumtemperatur lagern.</li>
</ol>
2. Extraktion von Lignocellulose
Kohlenhydrat-Trennung
<ol>
	<li>5 g Rutenhirse, Kiefer oder Bermudagras (gemahlen auf 1 mm oder kleinere Korngröße) in einen 500 ml Erlenmeyerkolben geben. Dann werden 200 ml destilliertes oder entionisiertes Wasser, 7,5 g NaClO2, 2,5 ml Eisessig und ein Rührstab in den Kolben gegeben.</li>
	<li>Den Kolben 1 Std. lang in ein Ölbad stellen, das auf einer Rührplatte bei 80 °C aufgesetzt ist. Die Geschwindigkeit der Rührplatte auf mittlere Stufe stellen.</li>
	<li>Weitere 7,5 gNaClO 2 und 2,5 ml Eisessig werden in den Kolben gegeben. Bei 80 °C im Ölbad 30 min weiterrühren.</li>
	<li>Wiederholen Sie den vorherigen Schritt 2x (Hinweis: Insgesamt werden 30 gNaClO 2 und 10 ml Eisessig in den Kolben mit der lignozellulosehaltigen Biomasse gegeben). Kühle die Lösung auf Raumtemperatur ab.</li>
	<li>Legen Sie ein Blatt Filterpapier in einen Büchner-Trichter. Setzen Sie den Trichter auf einen Seitenarmkolben und befestigen Sie ihn an einem Vakuum</li>.
	<li>Gießen Sie die Lösung langsam in den Trichter.</li>
	<li>Waschen Sie das feste Material 3x mit 100 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser. Entsorgen Sie das Filtrat nach dem Waschen des Feststoffs.</li>
	<li>Bewahren Sie 1 g des festen Materials auf und legen Sie es auf ein sauberes Blatt Filterpapier.</li>
	<li>Trocknen Sie diesen Feststoff über Nacht in einem 50 °C heißen Ofen. Nachdem Sie die Probe aus dem Ofen genommen haben, geben Sie sie in ein Vorratsfläschchen mit der Aufschrift "Holocellulose".</li>
	<li>Den restlichen Feststoff geben Sie zu 250 ml 10 % NaOH (v/v) in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben. Verschließen Sie den Kolben mit einem Stopfen.</li>
	<li>Die Lösung 1 Stunde lang bei 70 °C in einen Inkubator geben und bei 250 U/min schütteln.</li>
	<li>Kühlen Sie die Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ab.</li>
	<li>Entfernen Sie das Festmaterial mit Filterpapier und einem Büchner-Trichter, der an einem Seitenarmkolben befestigt ist.</li>
	<li>Das feste Material auf einem sauberen Blatt Filterpapier in einen 50 °C heißen Ofen geben und über Nacht trocknen lassen.</li>
	<li>Nachdem der Rückstand getrocknet ist, geben Sie ihn in ein Vorratsfläschchen und beschriften Sie ihn mit "Zellulose".</li>
	<li>Das Filtrat aus Schritt 2.13 wird in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben überführt und mit 30 ml Essigsäure und 250 ml Isopropylalkohol versetzt. Verschließen Sie den Kolben und stellen Sie die Lösung für mindestens 8 Stunden bei Raumtemperatur auf die Tischplatte.</li>
	<li>Füllen Sie die gesamte Lösung in konische 50-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Lösung 30 Minuten lang bei 9.300 x g. Pipettieren Sie die Lösung vorsichtig aus dem konischen Röhrchen und entsorgen Sie sie.</li>
	<li>Das Pellet wird in 30 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser durch Vortexen resuspendiert.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.17-2.18 15x, um das Pellet gründlich zu waschen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet zum Gefriertrocknen auf. Nach der Gefriertrocknung wird die Probe entnommen und in ein Fläschchen mit der Aufschrift "Hemicellulose" gegeben. 
	Lignin-Trennung 
	Lignin-Trennungsprotokoll basierend auf Karaaslan et al. 12</li>
	<li>5 g Rutenhirse, Kiefer oder Bermudagras (gemahlen auf 1 mm oder kleinere Partikelgröße) zu 500 ml einer Lösung von 0,25 M NaOH und 30 % Ethanol geben. Die Gülle wird 2 Stunden lang bei 75 °C und 250 U/min in einen Inkubator gestellt.</li>
	<li>Kühle die Lösung auf Raumtemperatur ab.</li>
	<li>Legen Sie ein Blatt Filterpapier in einen Büchner-Trichter auf einen Seitenarmkolben. An einem Vakuum befestigen und die Lösung langsam in den Trichter gießen.</li>
	<li>Entsorgen Sie das feste Material.</li>
	<li>Geben Sie einen Rührstab in den Kolben mit dem Filtrat und stellen Sie den Kolben auf eine auf mittlere Geschwindigkeit eingestellte Rührplatte. Konzentrierte Salzsäure wird tropfweise in die Lösung gegeben, bis ein pH-Wert von 2,0 erreicht wird (ca. 20 ml).</li>
	<li>Lassen Sie die angesäuerte Lösung über Nacht bei Raumtemperatur ziehen.</li>
	<li>Die Lösung wird bei 9.300 x g für 30 min in konischen Röhrchen zentrifugiert. Pipettieren Sie die Lösung vorsichtig aus dem konischen Röhrchen und verwerfen Sie sie.</li>
	<li>Das Pellet wird in 30 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser durch Vortexen resuspendiert.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.27-2.28 15x, um das Pellet gründlich zu waschen.</li>
	<li>Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand und bewahren Sie das Pellet zum Gefriertrocknen auf. Nach der Gefriertrocknung wird die Probe in ein Fläschchen mit der Aufschrift "Lignin" gegeben.</li>
</ol>
3. Vorbereitung von mikrobiellen Wachstumskulturen
Agar-Platten
<ol>
	<li>0,2 % (w/v) sterile Lignocellulose-Extraktionsprodukte zu M9 minimal Medium13 Agar hinzufügen, bevor die Platten gegossen werden.</li>
	<li>Erstarrte Streifenplatten mit ca. 200 μl einer Bakterienkultur, gezüchtet in M9-Minimalmedien mit einem Außendurchmesser von ca. 2,0.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C und überwachen Sie das Wachstum. 
	Flüssige Kulturen</li>
	<li>50 ml steriles Luria-Bertani (LB) Medium13 oder M9 minimalMedium 13 werden in einen sterilen 125 ml Kolben gegeben. Geben Sie Schwarzlauge in einer Menge von 10 % (v/v) oder 0,2 % (w/v) Lignocellulose-Extraktionsprodukten zu.</li>
	<li>Beimpfen Sie das Medium mit 0,1 % (v/v) einer Bakterienkultur bei einem Außendurchmesser von ca. 2,0.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 200 U/min.</li>
	<li>Beurteilen Sie das Wachstum alle 6 Stunden während der Kultivierungsperiode, indem Sie die optische Dichte (λ = 600 nm) messen. Ein Aliquot von 1 ml der Kultur wird in eine Küvette gegeben. Bestimmen Sie die optische Dichte von Kulturen, die gegen ungeimpfte Medien ausgeblendet wurden.</li>
	<li>Übertragen Sie die Bakterien in der Mitte der logarithmischen Phase in eine anaerobe Serumflasche.
	<ol>
		<li>Zur Vorbereitung der anaeroben Serumflasche: Verschließen Sie die Serumflasche mit einem Butylkautschukstopfen und einem Aluminium-Bördelverschluss unter aeroben Bedingungen und autoklavieren Sie sie. Verändern Sie den Kopfraum in der Serumflasche nach der Sterilisation nicht.</li>
		<li>Die gesamte 50-ml-Kultur aus dem 125-ml-Kolben wird mit einer Spritze in die versiegelte sterile Serumflasche überführt.</li>
		<li>Inkubieren bei 37 °C und Schütteln bei 200 U/min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Probenvorbereitung für GC-MS
Bereiten Sie Proben gemäß Raj, Reddy und Chandra14 vor. Die für den Vergleich verwendete Negativkontrolle besteht aus M9-Minimalmedien mit 10 % Schwarzlauge und wird auch als unbeimpfte Probe bezeichnet.
<ol>
	<li>Zentrifugieren Sie ungeimpfte und inokulierte Bakterienkulturen (50 ml) bei 9.300 x g für 30 Minuten nach 450 Stunden Inkubation.</li>
	<li>10 ml des Überstands werden in ein Reagenzglas aus Glas gegeben. (Hinweis: Kunststoff ist mit den Chemikalien in den folgenden Schritten nicht kompatibel.)</li>
	<li>Säuern Sie den Überstand mit konzentriertem HCl auf pH 1-2 an.</li>
	<li>Fügen Sie 3 Volumen Ethylacetat (30 ml) hinzu, verschließen Sie das Röhrchen und mischen Sie, indem Sie es 4-6x umdrehen.</li>
	<li>Geben Sie eine kleine Menge wasserfreies Na2SO4 (1-2 g) in ein sauberes Reagenzglas aus Glas.</li>
	<li>Entnehmen Sie vorsichtig die organische Schicht (oben) von der Ethylacetatlösung, indem Sie sie mit einer Einweg-Pasteurpipette aus Glas pipettieren.</li>
	<li>Legen Sie die organische Schicht mit wasserfreiem Na2SO4 in das Reagenzglas.</li>
	<li>Entwässern Sie die organische Schicht über dem wasserfreien Na2SO4, indem Sie vorsichtig auf das Reagenzglas klopfen, um es zu mischen. Nach und nach kleine Mengen wasserfreies Na2SO4hinzufügen und mischen, bis keine großen Klumpen mehr vorhanden sind.</li>
	<li>Legen Sie ein Blatt Filterpapier in einen Büchner-Trichter auf einem Seitenarmkolben, der an einem Vakuum befestigt ist.</li>
	<li>Gieße die Lösung in den Trichter. Entsorgen Sie das feste Material.</li>
	<li>Die Lösung in einen Verdampferkolben überführen und das Filtrat mit einem Rotationsverdampfer verdampfen.</li>
	<li>3 mg Extraktionsrückstand aus Ethylacetat in ein 2-ml-Durchstechflasche für die Bernsteinchromatographie geben.</li>
	<li>Der Rückstand wird unter Zugabe von 100 μl 1,4-Dioxan und 10 μl Pyridin aufgelöst</li>.
	<li>50 μl N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid mit Trimethylcholorsilan 99:1% (BSTFA) zugeben. Dann in einen Inkubator bei 60 °C stellen und 15 min schütteln.</li>
	<li>Lagern Sie die Proben bis zur Verwendung bei 4 °C.</li>
</ol>
5. GC-MS
Rüsten Sie den Gaschromatographen (GC) an Schnittstelle mit einem Massenspektrometer (MS) mit einer unpolaren Kapillarsäule und Helium als Trägergas mit einer Durchflussrate von 1 ml/min aus.
<ol>
	<li>Nachdem sich die Ofentemperatur bei 50 °C stabilisiert hat, wird 1 μl der Probe in einem Teilungsverhältnis von 1/50 injiziert.</li>
	<li>Halten Sie die Säule 5 min lang bei 50 °C und erhöhen Sie sie auf 280 °C bei 5 °C/min. Halten Sie die Endtemperatur von 280 °C für 20 min.</li>
	<li>Die Transferleitung zwischen Gaschromatograph und Massenspektrometer ist auf 300 °C zu halten.</li>
	<li>Wählen Sie eine Lösungsmittelverzögerung von 15 Minuten.</li>
	<li>Aufzeichnung von Elektronenionisationsmassenspektren im Bereich von 10-500 (m/z) bei einer Elektronenenergie von 70 eV.</li>
	<li>Derivatisieren und chromatographieren Sie den Standard wie oben. Identifizieren Sie Verbindungen, indem Sie die Aufbewahrungszeiten von gekauften Standards oder Daten in der Massenspektraldatenbank des National Institute of Standards and Technology (NIST) vergleichen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Dieses Protokoll beschreibt eine Kombination von Techniken, die darauf abzielt, Mikroorganismen zu identifizieren, die Zellstoffabfälle abbauen können, die Kohlenstoffquellen, die während des Wachstums auf Zellstoffabfällen verwendet werden, und die mikrobiellen Stoffwechselprodukte, die beim Anbau auf Zellstoffabfällen entstehen. Wir haben den Erfolg dieses Protokolls mit dem mikrobiellen Umweltisolat gezeigt: eine fakultative Anaerobe, die auf 10 % Schwarzlauge wachsen kann und die Komponenten der Lignozellulose-Extrak...

Das Auflösen von Holz ist ein chemisch intensiver Prozess, der über viele Jahre hinweg optimiert wurde, um ein System mit minimalem Abfall zu schaffen. Einige Ergebnisse dieses Prozesses könnten jedoch verwendet werden, um höherwertige Produkte herzustellen. Schwarzschnaps ist ein solches Beispiel. Es wird aus dem Kraftverfahren gewonnen, dem dominierenden chemischen Aufschlussverfahren, das 85 % der weltweiten Ligninproduktion ausmacht1. Das Kraftverfahren (Abbildung 1) nutzt die Temperatur (160-200 °C), den Druck (120 psig) und die in der Testlauge enthaltenen Chemikalien (Natriumhydroxid und Natriumsulfid), um das Lignin aus den Holzfasern aufzulösen2,3. Schwarzlauge enthält Lignin, organische Säuren und Nebenprodukte des Polysaccharidabbaus4. Es wird verbrannt, um Dampf zu erzeugen und Chemikalien im Rückgewinnungskessel zurückzugewinnen, der thermische Energie für nachgelagerte Papierherstellungs- und Zellstoffprozesse liefert. Das Volumen der beim Aufschluss erzeugten Schwarzlauge kann die Menge übersteigen, die der Rückgewinnungskessel effektiv verarbeiten kann. Die Entsorgung der Schwarzlauge als Abwasser wirkt sich negativ auf die Wasserflora und -fauna aus und ist daher keine Option. Der Einsatz von mikrobiellen Organismen, die Schwarzlauge für das Wachstum nutzen könnten, wäre im Hinblick auf die Steigerung der chemischen Rückgewinnung und die Erzeugung von Mehrwertprodukten von Vorteil, die die gesamte Lebenszyklusanalyse des Zellstoffsystems verbessern würden. Die chemische und biologische Umwandlung von Lignin-abgeleiteten Monomeren hat erfolgreich Vanillin und Zimtsäure für die Verwendung als Lebensmittelsüßstoffe und Duftzusätze, Phenol für Kunststoffe und Harze sowie Cyclohexan, das für Kraftstoff verwendet werden könnte5, hergestellt.
Frühere Arbeiten zum biologischen Abbau dieser Zellstoffabfälle konzentrierten sich auf die Lignin-Depolymerisation. Das International Lignin Institute (ILI) berichtet, dass jedes Jahr zwischen 40 und 50 Millionen Tonnen Lignin produziert werden (http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php). Nur 1,5 % dieses Lignins werden für kommerzielle industrielle Prozesse verwendet6. Die Lignin-Depolymerisation durch Laccase- und Peroxidase-Enzyme, die von Weißfäulepilzen der Gattungen Phanerochaete und Trametes produziert werden, wurde ausführlich untersucht7. Bodenbakterien, von denen bekannt ist, dass sie aromatische Verbindungen abbauen, wie Nocardia und Rhodococcus8, Pseudomonas putida mt-29 und Streptomyces viridosporus T7A10, haben sich ebenfalls als in der Lage erwiesen, Lignin abzubauen. Der bakterielle Abbau von Zellstoffabfällen ist vielversprechend, da einige Bakterien unter salzhaltigen und alkalischen Bedingungen (pH 10-14) gedeihen können, die für die Abwässer von Zellstoffabfällen charakteristisch sind11. Während Lignin der Hauptbestandteil der Schwarzlauge ist, können Mikroorganismen auch die anderen Bestandteile der Schwarzlauge abbauen. Diese Techniken dienen nicht ausschließlich der Identifizierung von ligninabbauenden Mikroorganismen, sondern dienen der Identifizierung von Mikroorganismen, die anstelle ihrer weiterverarbeiteten Bestandteile direkt auf die Zellstoffabfälle Schwarzlauge ausgebracht werden können.
Schwarzlauge wurde gesammelt und durch Neutralisation und Filtersterilisation für mikrobielles Wachstum modifiziert. Die Anforderungen an das mikrobielle Wachstum eines mikrobiellen Umweltisolats wurden durch Experimente mit minimalem Medienwachstum an lignozellulosehaltigen Komponenten identifiziert, die durch ein neuartiges Lignocellulose-Extraktionsprotokoll hergestellt wurden. Die Wachstumsmedien wurden mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) analysiert, um die Stoffwechselprodukte des mikrobiellen Isolats aus der Umwelt zu bestimmen, wenn es auf Schwarzlauge als alleiniger Kohlenstoffquelle gezüchtet wird. Die Kombination dieser Techniken bietet ein Bewertungsinstrument zur Bestimmung der Stoffwechselkapazität eines Mikroorganismus, wenn er auf Zellstoffabfällen wie Schwarzlauge angebaut wird. Der Einsatz solcher Techniken bietet auch einen Einblick in den Wert der Anwendung spezifischer Mikroorganismen auf Zellstoffabfälle zur Erzeugung von Nebenprodukten.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dioxan (ACS-zertifiziert)</td><td>Fisher</td><td>D111</td><td>Entflammbare, voroxidierbare Chemikalie</td></tr><tr><td>Schwarzlauge</td><td>Department of Forest Biomaterials an der North Carolina State University</td><td>N/A</td><td>pH 12,72, 13,67 % Feststoffe</td></tr><tr><td>Ethanol (mikrobiologische Qualität)</td><td>Fisher</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetat (ACS-Reagenzqualität)</td><td>EMD</td><td>EX0240-9</td><td>Entzündlich</td></tr><tr><td>Eisessig (ACS-zertifiziert)</td><td>EMD</td><td>AX0073</td><td>Ätzendes</td></tr><tr><td>Guajakol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1136</td><td>Gesundheitsschädlich durch Verschlucken, ätzende</td></tr><tr><td>HP-5 Kapillarsäule</td><td>Agilent</td><td>19091J-577</td><td>60 m x 0,18 mm Innendurchmesser, 0,18 &mu; m Dicke</td></tr><tr><td>Salzsäure (ACS-zertifiziert)</td><td>EMD</td><td>HX0603P</td><td></td></tr><tr><td>N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid mit Trimethylcholorsilan 99:1% (BSTFA)</td><td>Fluka</td><td>15238</td><td>Entzündlich, verursacht Hautverbrennungen und Augenschäden bei Kontakt</td></tr><tr><td>Na2SO4 (FCC-Qualität)</td><td>VWR</td><td>BDH8026</td><td></td></tr><tr><td>NaClO2 (80%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244155</td><td>Entzündlich, giftig &nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH (zertifiziert ACS)</td><td>EMD</td><td>1.06498.1000</td><td>Korrosive</td></tr><tr><td>Alkacid pH-Testbänder Fisher</td><td></td><td>A979</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorsäure (zertifiziert ACS)</td><td>Fisher</td><td>A242</td><td></td></tr><tr><td>Polaris Q Massenspektrometer&nbsp;</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyridin (99%)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12005</td><td>Entflammbar, giftig bei Berührung mit der Haut</td></tr><tr><td>Switchgrass</td><td>Cherry Research Farm Goldsboro, NC</td><td>N/A</td><td>Erntet August 2011</td></tr><tr><td>Thermo Finnigan Spurengaschromatograph</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nr. 1 Filterpapier</td><td>Whatman</td><td>1001-150</td><td></td></tr></tbody></table>

methoden zur erleichterung des mikrobiellen wachstums in abfallströmen von zellstofffabriken und charakterisierung des biologischen abbaupotenzials von kultivierten mikroben

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

Das Kraftverfahren wird auf Holzhackschnitzel angewendet, um Lignin von den Polysacchariden in der Lignozellulose für Zellstoff zu trennen, der ein hochwertiges Papier herstellt. Schwarzlauge ist ein Zellstoffabfall, der durch den Kraftprozess erzeugt wird und das Potenzial für eine nachgelagerte Biokonversion hat. Die widerspenstige Natur der Lignocellulose-Ressourcen, ihre chemischen Derivate, die den Großteil des verfügbaren organischen Kohlenstoffs in der Schwarzlauge ausmachen, und ihr basischer pH-Wert stellen jedoch eine Herausforderung für den mikrobiellen biologischen Abbau dieses Abfallmaterials dar. Verfahren zur Sammlung und Modifikation von Schwarzlauge für das mikrobielle Wachstum zielen auf die Verwertung dieser Zellstoffabfälle ab, um das Lignin, die organischen Säuren und die Nebenprodukte des Polysaccharidabbaus in wertvolle Chemikalien umzuwandeln. Die vorgestellten Lignocellulose-Extraktionstechniken stellen eine reproduzierbare Methode zur Herstellung von Lignocellulose-Wachstumssubstraten dar, um die metabolischen Fähigkeiten von kultivierten Mikroorganismen zu verstehen. Der Einsatz der Gaschromatographie-Massenspektrometrie ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung der Fermentationsprodukte, die aus dem Wachstum von Mikroorganismen auf Zellstoffabfällen entstehen. Wenn diese Methoden zusammen verwendet werden, können sie die Bestimmung der Stoffwechselaktivität von Mikroorganismen erleichtern, die das Potenzial haben, Fermentationsprodukte herzustellen, die dem Zellstoffsystem einen größeren Wert verleihen und Abwasserabfälle reduzieren würden, wodurch die potenziellen Gewinne der Papiermühle gesteigert und zusätzliche Verwendungsmöglichkeiten für Schwarzlauge geboten würden.

Die Sammlung und Modifizierung von Schwarzlauge, die im Sulfat-Zellstoffprozess entsteht (Abbildung 1), ermöglicht die Nutzung dieses Zellstoffabfalls, um die biologische Abbaufähigkeit eines einzelnen bakteriellen Isolats oder einer gemischten Kultur zu bestimmen. Abbildung 2 zeigt das aerobe Wachstum, gemessen als optische Dichte des mikrobiellen Umweltisolats, das allein in LB-Medium sowie in LB-Medium ergänzt um 10 % neutralisierte Schwarzlauge kultiviert wurde. Diese Ergebnisse zeig...

Industrieabfälle können gesammelt und modifiziert werden, um das mikrobielle Wachstum zu analysieren. Lignocellulose-Extraktionstechniken liefern Komponenten zur Analyse der spezifischen biologischen Abbaufähigkeit. Die Gaschromatographie-Massenspektrometrie identifiziert Fermentationsprodukte von Mikroorganismen, die auf Zellstoffabfällen gezüchtet wurden. Mit diesen Methoden wird die metabolische Fähigkeit von Mikroorganismen zum Abbau von Zellstoffabfällen bestimmt.

Methoden zur Erleichterung des mikrobiellen Wachstums in Abfallströmen von Zellstofffabriken und Charakterisierung des biologischen Abbaupotenzials von kultivierten Mikroben

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Fähigkeit eines Mikroorganismus oder eines Mikroorganismen-Konsortiums zu bestimmen, die Sulfatcellulose-Abfallflüssigkeit Schwarzlauge als Wachstumsgrundlage zu nutzen, die für das Wachstum verwendeten Bestandteile der Schwarzlauge sowie die durch den mikrobiellen Stoffwechsel dieser Cellulose-Abfallstoffe gebildeten Produkte. Dies wird erreicht, indem die Schwarzlauge aus der Zellstoffproduktion gesammelt und als Bestandteil eines Kulturmediums aufbereitet wird. Als zweiter Schritt werden Lignocellulose-Bestandteile extrahiert, die zur Bestimmung der Kohlenstoffquellen-Anforderungen der Mikroorganismen verwendet werden.Als Nächstes werden Medien hergestellt, beimpft und auf mikrobielles Wachstum analysiert, um die Fähigkeit der Mikroorganismen zu bestimmen, auf Schwarzlauge und deren Bestandteilen zu wachsen. Die Ergebnisse zeigen die Nutzung von Schwarzlauge als alleinige Kohlenstoffquelle für das Wachstum und die Synthese metabolischer Produkte durch das mikrobielle Umweltisolat, basierend auf dem beobachteten Wachstum auf Agarplatten mit Minimalmedium sowie durch GC-MS. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir die Möglichkeit diskutierten, dass Mikroben auf Zellstoffabfallprodukten wachsen könnten, und dass wir diese Mikroben möglicherweise direkt aus einer Zellstofffabrik isolieren könnten.Der Hauptvorteil der Zignal-Cellulose-Extraktionsmethode gegenüber heutigen etablierten Verfahren wie der Natriumhydroxid-Bleichung besteht darin, dass die Natriumchlorid-Bleichung eine hohe und erhöhte Reinheit ermöglicht. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Aufreinigung der Cellulose sowie zur Probenvorbereitung für die GC-MS schwer zu erlernen sind. Dies liegt an der hohen Anzahl erforderlicher Arbeitsschritte sowie an der notwendigen visuellen Beurteilung, um den Abschluss des Prozesses zu überprüfen.Diese Methode kann nicht nur Einblicke in den mikrobiellen Abbau von Schwarzlauge gewähren, sondern lässt sich auch auf industrielle Abwasserströme anwenden, die Magnocellulose-Materialien wie Ernterückstände, Waldabfälle und Siedlungsabfälle enthalten. Um dieses Verfahren zu beginnen, sammeln Sie die Schwarzlaugeprobe am Ablaufhahn des Faserstoffkochers in einer sterilen Glasflasche und lassen Sie sie vor dem Fortfahren auf Raumtemperatur abkühlen. Geben Sie anschließend 100 Milliliter der Schwarzlaugeprobe in ein 500-Milliliter-Becherglas, das mit einem Rührstab ausgestattet ist, und rühren Sie die Probe mit mittlerer Geschwindigkeit um.Neutralisieren Sie die Schwarzlauge, indem Sie tropfenweise Phosphorsäure hinzufügen, bis sie zähflüssig wird. Danach portionieren Sie die gesamte Schwarlauge-Lösung in 50-Milliliter-Konizflaschen und zentrifugieren die Proben 30 Minuten bei 9.300 ×g. Um die Kohlenhydrate zu trennen, geben Sie fünf Gramm eines Millimeters oder weniger gemahlenen Schilfrohrs und einen Rührstab in einen 500-Milliliter-Kolben.Anschließend 200 Milliliter destilliertes Wasser, 7,5 Gramm Natriumchlorit und 2,5 Milliliter Essigsäure (Eisessig) hinzufügen. Das Gefäß für eine Stunde in ein Ölbad auf einem Rührgerät bei 80 Grad Celsius stellen. Danach weitere 7,5 Gramm Natriumchlorid und 2,5 Milliliter Essigsäure (Eisessig) zum Gefäß hinzufügen.Rühren Sie weitere 30 Minuten bei 80 Grad Celsius fort, nachdem Sie den vorherigen Schritt zwei Mal wiederholt haben. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. Danach filtrieren Sie sie unter Vakuum durch einen Büchner-Trichter, um das feste Material zu isolieren.Waschen Sie das feste Material dreimal mit je 100 Milliliter destilliertem Wasser. Sammeln Sie anschließend ein Gramm des festen Materials und geben Sie es auf ein sauberes Filterpapier. Trocknen Sie das feste Material bei 50 Grad Celsius über Nacht.Nachdem die Probe am folgenden Tag aus dem Ofen entnommen wurde, überführen Sie sie in ein Lagerungsfläschchen, das mit „Hohlzelle“ beschriftet ist. Geben Sie das verbleibende feste Material zu einem 500-Milliliter-Kolben, der 250 Milliliter 10%ige Natriumhydroxidlösung enthält, und verschließen Sie den Kolben mit dem Stopfen. Stellen Sie die Lösung eine Stunde lang bei 70 Grad Celsius in einen Inkubator und schütteln Sie sie dabei mit 250 U/min.Danach die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Nach 30 Minuten das feste Material mittels Vakuumfiltration mit einem Büchner-Trichter isolieren. Sobald der feste Rückstand über Nacht in einem Ofen bei 50 Grad Celsius getrocknet wurde, in ein Aufbewahrungsröhrchen mit der Beschriftung Cellulose geben. Das Filtrat in einen 500-Milliliter-Kolben überführen und 30 Milliliter Essigsäure sowie 250 Milliliter Isopropanol hinzufügen, verschließen und die resultierende Lösung mindestens acht Stunden bei Raumtemperatur auf der Laborbank stehen lassen.Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, überführen Sie die gesamte Lösung in 50-Milliliter-Konischkolben und zentrifugieren Sie die Probe bei 9.300 ×g für 30 Minuten. Nach der Zentrifugation pipettieren Sie die Lösung vorsichtig aus den Konischkolben ab und entsorgen Sie sie. Anschließend waschen Sie die Pellets mit 30 Milliliter destilliertem Wasser durch Vortexen und zentrifugieren bei 9.300 ×g für 30 Minuten.Wiederholen Sie diesen Schritt 15-mal, um das Pellet gründlich zu waschen. Nach der Zentrifugation entfernen Sie den Überstand, um das Pellet zur Gefriertrocknung zu isolieren. Sobald die Probe gefriertrocknet wurde, geben Sie sie in ein Röhrchen, das mit Hemicellulose beschriftet ist.Für die Lignintrennung geben Sie fünf Gramm eines auf einen Millimeter oder weniger gemahlenen Schilfrohrs zu einer 500-Milliliter-Lösung aus 0,25 molarer Natriumhydroxidlösung und 30 % Ethanol. Stellen Sie die Suspension in einen Inkubator bei 75 Grad Celsius mit Schütteln bei 250 U/min für zwei Stunden. Nach dem Filtrieren der abgekühlten Lösung geben Sie einen Rührstab in das Gefäß und stellen es auf einen Rührer, der auf mittlere Geschwindigkeit eingestellt ist.Fügen Sie konzentrierte Salzsäure tropfenweise zum Filtrat hinzu, bis ein pH-Wert von zwei erreicht ist. Lassen Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Nachdem die Lösung in 50-Milliliter-Konischschraubröhrchen überführt wurde, zentrifugieren Sie die Proben 30 Minuten bei 9.300 ×g.Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, pipettieren Sie die Lösung vorsichtig aus dem kegelförmigen Reagenzglas und entsorgen Sie sie. Waschen Sie das Pellet mit 30 Milliliter destilliertem Wasser durch Vortexen und zentrifugieren Sie es bei 9.300 ×g für 30 Minuten. Wiederholen Sie diesen Schritt 15-mal, um das Pellet gründlich zu waschen.Nach der Zentrifugation das überstehende Flüssigkeitsüberstand entfernen, um das Pellet zur Gefriertrocknung zu isolieren. Nach der Gefriertrocknung die Probe in ein mit „Lignin“ beschriftetes Gefäß geben. 50 Milliliter sterile M-neun-Minimalmedien zu einem sterilen 125-Milliliter-Kolben hinzufügen.Danach 10 % (v/v) Schwarzlauge zum Medium hinzufügen. Zum Inokulieren 0,1 % (v/v) einer Übernachtkultur von Bakterien zur Mischung geben und die Kulturen bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit Schüttelbetrieb bei 200 U/min inkubieren. Im mittleren log-Phasen-Zustand die Bakterien nach Zentrifugation der nicht inokulierten und inokulierten Bakterienkulturen mit einer Spritze in eine verschlossene sterile anaerobe Serumflasche überführen.Nach 450 Stunden Wachstum 10 Milliliter jedes Überstandes in separate Glasreagenzgläser geben. Jeden Überstand mit konzentrierter Salzsäure tropfenweise auf einen pH-Wert von eins bis zwei ansäuern. Zu jeder Probe 30 Milliliter Ethylacetat zum Überstand hinzufügen.Nachdem das Reagenzglas verschlossen wurde, die Lösung durch vier- bis sechsmaliges Umstülpen des Rohrs mischen. Anschließend ein bis zwei Gramm wasserfreies Natriumsulfat in ein sauberes Glasreagenzglas geben. Vorsichtig die obere organische Phase mit der Einweg-Glas-Pasteur-Pipette abpipettieren.Geben Sie die organische Phase in das Reagenzglas mit dem wasserfreien Natriumsulfat. Entfernen Sie die Feuchtigkeit aus der organischen Phase über wasserfreies Natriumsulfat, indem Sie vorsichtig das Reagenzglas antippen, um die Mischung allmählich zu homogenisieren. Fügen Sie kleine Mengen wasserfreies Natriumsulfat hinzu und mischen Sie, bis keine größeren Klumpen mehr vorhanden sind.Danach die Lösung unter Vakuum durch einen Büchner-Trichter filtrieren, anschließend die Lösung in einen Verdampfungs-Kolben überführen und den Filtrat mit einem Rotationsverdampfer eindampfen. Danach drei Milligramm der Rückstände aus der Ethylacetat-Extraktion in ein zwei Milliliter fassendes braunes Chromatographie-Fläschchen geben. Den Rückstand mit 100 Mikrolitern 1,4-Dioxan und 10 Mikrolitern Pyridin auflösen.Fügen Sie dann 50 Mikroliter einer Lösung von B-S-T-F-A mit 1 % Trimethylchlorid zum Vial hinzu. Inkubieren Sie die Lösung 15 Minuten bei 60 Grad Celsius unter Schütteln. Analysieren Sie die Probe mittels GC-MS.Die Sammlung und Modifikation von Schwarzlauge, die im handwerklichen Zellstoffherstellungsprozess anfällt, dient dazu, diesen Zellstoffabfall zu nutzen, um die biologische Abbaubarkeit eines einzelnen bakteriellen Isolats oder einer gemischten Kultur zu bestimmen. Dargestellt ist das aerobe Wachstum, gemessen als optische Dichte eines Umweltstamms, der in LB-Medium sowie in LB-Medium ergänzt um 10 % neutralisierte Schwarzlauge kultiviert wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass dieses Bakterium in Gegenwart von Schwarzlauge wächst.Das Wachstum des Umweltisolats in LB-Medium ist schneller als beim Wachstum in Gegenwart von Schwarzlauge, doch die optische Dichte beginnt nach 62 Stunden abzunehmen. Im Gegensatz dazu nimmt die optische Dichte des mikrobiellen Umweltisolats in Gegenwart von Schwarzlauge bis nach 230 Stunden Wachstum weiter zu. Die Wachstumskurve des mikrobiellen Umweltisolats in Gegenwart von Schwarzlauge zeigt außerdem ein biphasisches Wachstum, was darauf hindeutet, dass die Schwarzlauge mehr als eine Kohlenstoffquelle enthält, die vom mikrobiellen Umweltisolaat genutzt werden kann, und dass das Bakterium eine Präferenz in der Nährstoffnutzung aufweist.Weitere Experimente sind erforderlich, um die Fähigkeit zur Nutzung von Schwarzlauge für Wachstumsbedürfnisse zu bestimmen. Man kann auch das Wachstum eines Bakteriums auf nicht neutralisierter Schwarzlauge untersuchen oder den Einfluss erhöhter Schwarzlaugenkonzentrationen auf das Wachstum ermitteln. Nachdem das Wachstum auf Schwarzlauge nachgewiesen wurde, kann die Nutzung von Kohlenstoffquellen mithilfe von Wachstumsexperimenten in minimalen Medien bestimmt werden.Kommerzielle Substrate, die die Bestandteile von Lignocellulose bilden, können als Kohlenstoffquellen in minimalen Medien verwendet werden. Das hier vorgestellte Protokoll zur LIGNOCELLULOSE-Extraktion bietet ein Modell zur Bestimmung der Wachstumsanforderungen des abgebildeten Bakteriums. Hier ist das Wachstum des mikrobiellen Umweltisolats auf M-neun-Minimalmedium-Agar dargestellt, der mit jedem Bestandteil der Lignocellulose-Extraktion ergänzt wurde.Das Vorhandensein von Kolonien auf den Agarplatten mit Minimalmedium weist auf die Fähigkeit des Umweltisolats hin, Holo-Cellulose, Cellulose, Hemi-Cellulose und Lignin abzubauen. Kolonien auf M-neun-Minimalmedium könnten darauf hindeuten, dass das Umweltisolate in der Lage ist, Agar abzubauen, anstatt die Platten zu nutzen. Wachstumskurven im Minimalmedium für Flüssigkulturen könnten ebenfalls verwendet werden, um die spezifische Wachstumsrate auf jeder Lignocellulose-Fraktion zu bestimmen, sodass Agar, das eine potenzielle Kohlenstoffquelle darstellen könnte, nicht hinzugefügt werden müsste.Die Analyse extrahierter und derivatisierter Augen, bakterieller Kulturen mittels GC-MS zeigt die gebildeten Stoffwechselprodukte. Gezeigt ist hier das GC-MS-Spektrum der TMS-Derivate in der nicht-inokulierten Probe sowie das Spektrum der TMS-Derivate, die vom Umwelt-Mikrobiellen Isolat bei anaerober Kultivierung in M9-Minimalmedium mit 10 % nicht neutralisierter Schwarzlauge gebildet wurden. Der Vergleich der beiden Spektren zeigt Unterschiede in den im Medium enthaltenen Komponenten, was auf das Vorhandensein von Fermentationsprodukten sowie auf den Abbau von Schwarzlauge-Bestandteilen hindeutet.Ein Peak mit einer Retentionszeit von 39,34 Minuten erschien in der inoculierten Probe. Ein Peak mit einer Retentionszeit von 21,84 Minuten nahm in der inoculierten Probe zu. Ein Peak mit einer Retentionszeit von 25,79 Minuten nahm in der inoculierten Probe ab.Das hier gezeigte Spektrum stammt vom Guac-Standard, der zur Identifizierung des Peaks mit einer Retentionszeit von 25,79 Minuten verwendet wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man bestimmen kann, ob ein Mikroorganismus oder ein Mikroorganismen-Konsortium in der Lage ist, Schwarzlauge abzubauen. Darüber hinaus können Sie anhand dieses Protokolls andere Methoden wie Wachstumskurven verwenden, um zusätzliche Fragen zur Wachstumsrate eines oder mehrerer Mikroorganismen bei verschiedenen Konzentrationen von Schwarzlauge oder Lignocellulose-Extraktbestandteilen zu beantworten.

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Forschung

JoVE Journal

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Umwelt

Verfahren zur Erleichterung des mikrobiellen Wachstums auf Abwasserströmen von Zellstoffmühlen und Charakterisierung des biologischen Abbaupotenzials kultivierter Mikroben

Quelle: Villela, H. D. M. et al. Prospektion mikrobieller Stämme für Bioremediation und Probiotikaentwicklung für die Forschung und Erhaltung von Metaorganismen. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video demonstriert die Isolierung schadstoffabbauender Meeresbakterien durch serielle Verdünnung, Kolonieauswahl und Wachstum in einem EE2-haltigen Medium. Indem EE2 als einzige Kohlenstoffquelle verwendet wird, identifiziert das Protokoll Bakterienstämme, die in der Lage sind, diesen Umweltschadstoff zu...

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Methoden zur Erleichterung des mikrobiellen Wachstums in Abfallströmen von Zellstofffabriken und Charakterisierung des biologischen Abbaupotenzials von kultivierten Mikroben (Video) | JoVE Journal

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