Methoden zur Erleichterung des mikrobiellen Wachstums in Abfallströmen von Zellstofffabriken und Charakterisierung des biologischen Abbaupotenzials von kultivierten Mikroben

Das übergeordnete Ziel des folgenden Versuchs besteht darin, die Fähigkeit eines Mikroorganismus oder einer Konsortia von Mikroorganismen zu bestimmen, den Zellstoffabfall Schwarzlauge für das Wachstum, die Bestandteile der Schwarzlauge, die für das Wachstum verwendet werden, und die Produkte, die durch den mikrobiellen Stoffwechsel dieser Zellstoffabfälle hergestellt werden, zu nutzen. Dies wird erreicht, indem die Zellstoffabfälle der Schwarzlauge gesammelt und für die Verwendung als Bestandteil des Nährmediums aufbereitet werden. In einem zweiten Schritt werden Lignocellulose-Bestandteile extrahiert, die zur Bestimmung des Kohlenstoffquellenbedarfs der Mikroorganismen herangezogen werden.

Die nächsten Medien werden vorbereitet, beimpft und auf mikrobielles Wachstum analysiert, um die Fähigkeit der Mikroorganismen zu bestimmen, auf Schwarzlauge und ihren Bestandteilen zu wachsen. Die Ergebnisse zeigen die Nutzung von Schwarzlauge als einzige Kohlenstoffquelle für das Wachstum und die Synthese von Stoffwechselprodukten durch das mikrobielle Umweltisolat auf der Grundlage seines Wachstums, das auf minimalen Medienagarplatten visualisiert wird, und durch GCMS. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir über die Möglichkeit diskutierten, dass Mikroben auf Zellstoffabfällen wachsen können und dass wir diese Mikroben direkt aus einer Zellstofffabrik isolieren können.

Der Hauptvorteil der Zick-Cellose-Extraktionstechnik gegenüber der bestehenden Methode, wie der Natriumhydroxid-Bleiche, besteht darin, dass die Natriumchlorid-Bleiche eine hohe und erhöhte Reinheit bietet. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung. Da Theo Cellulose und GCMS die Schritte zur Probenvorbereitung schwer zu erlernen sind, liegt dies an der Anzahl der erforderlichen Schritte und an der visuellen Bestimmung, die zur Überprüfung des Prozessabschlusses erforderlich ist.

Diese Methode kann nicht nur Einblicke in den mikrobiellen Abbau von Schwarzlauge geben, sondern auch auf industrielle Abfallströme angewendet werden, die Magno-Zellulosematerialien enthalten, wie z. B. Ernterückstände, Waldabfälle und feste Siedlungsabfälle. Um diesen Vorgang zu starten, entnehmen Sie die Schwarzlaugeprobe aus dem Auslassventil, das am Craft-Fermenter und einer sterilen Glasflasche angebracht ist, und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Geben Sie dann 100 Milliliter der Schwarzlaugenprobe in ein 500-Milliliter-Becherglas, das mit einem Rührstab ausgestattet ist, und rühren Sie die Probe bei mittlerer Geschwindigkeit.

Neutralisieren Sie die Schwarzlauge, indem Sie Phosphorsäure tropfenweise hinzufügen, bis sie zähflüssig wird. Nach diesem Aliquot wird die gesamte Schwarzlaugenlösung in konische 50-Milliliter-Röhrchen abgefüllt und die Proben 30 Minuten lang bei 9.300 g zentrifugiert. Um die Kohlenhydrate zu trennen, geben Sie fünf Gramm gemahlenes Rutenhirse und einen Rührstab in einen 500-Milliliter-Kolben.

Fügen Sie dann 200 Milliliter destilliertes Wasser, 7,5 Gramm Natriumchlorit und 2,5 Milliliter Eisessig hinzu. Stellen Sie den Kolben eine Stunde lang in ein Ölbad bei 80 Grad Celsius auf einer Rührplatte. Geben Sie dann weitere 7,5 g Natriumchlorid und 2,5 Milliliter Eisessig in den Kolben.

Rühren Sie 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius weiter, nachdem Sie den vorherigen Schritt zweimal wiederholt haben. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. Anschließend wird es unter Vakuum durch einen Buchner-Trichter gefiltert, um das Festmaterial zu isolieren.

Waschen Sie das feste Material dreimal mit 100 Millilitern destilliertem Wasser. Sammeln Sie als Nächstes ein Gramm des festen Materials und legen Sie es auf ein sauberes Blatt Filterpapier. Lege den Feststoff bei 50 Grad Celsius zum Trocknen über Nacht.

Nachdem Sie die Probe am nächsten Tag aus dem Ofen genommen haben, geben Sie sie in ein Vorratsfläschchen mit der Aufschrift Hohlzelle. Den restlichen Feststoff wird in einen 500-Milliliter-Kolben gegeben, der 250 Milliliter 10 %ige Natriumhydroxid enthält, und der Kolben wird mit dem Stopfen verschlossen. Geben Sie die Lösung eine Stunde lang bei 70 Grad Celsius in einen Inkubator und schütteln Sie sie bei 250 U/min.

Lassen Sie die Lösung anschließend auf Raumtemperatur abkühlen Nach 30 Minuten isolieren Sie den Feststoff durch Vakuumfiltration mit einem Buchner-Trichter. Nachdem der feste Rückstand über Nacht in einem 50 Grad Celsius heißen Ofen getrocknet wurde, legen Sie ihn in ein mit Zellulose beschriftetes Vorratsfläschchen. Das Filtrat wird in einen 500-Milliliter-Kolben überführt, 30 Milliliter Essigsäure und 250 Milliliter Isopropylalkoholkappe hinzugefügt und die resultierende Lösung mindestens acht Stunden lang bei Raumtemperatur auf den Tisch gestellt.

Wenn Sie fertig sind, geben Sie die gesamte Lösung in konische 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 9.300 g. Nach dem Zentrifugieren die Lösung vorsichtig aus den konischen Röhrchen pipettieren und verwerfen. Anschließend die Pellets mit 30 Millilitern destilliertem Wasser durch Vortexen waschen und 30 Minuten lang bei 9.300 g zentrifugieren.

Wiederholen Sie diesen Schritt 15 Mal, um das Pellet gründlich zu waschen. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand, um das Pellet für die Gefriertrocknung zu isolieren. Sobald die Probe gefriergetrocknet ist, geben Sie sie in ein Fläschchen mit der Aufschrift Hemizellulose.

Für die Lignintrennung fügen Sie fünf Gramm gemahlenes Rutenhirse von einem Millimeter oder kleiner zu einer 500-Milliliter-Lösung aus molarem Natriumhydroxid und 30 % Ethanol hinzu. Legen Sie die Gülle in einen Inkubator bei 75 Grad Celsius und schütteln Sie sie zwei Stunden lang bei 250 U/min. Nach dem Filtrieren der kühlen Lösung wird ein Rührstab in den Kolben gegeben und auf eine auf mittlere Geschwindigkeit eingestellte Rührplatte gelegt.

Konzentrierte Salzsäure tröpfchenweise zum Filtrat geben, bis ein pH-Wert von zwei erreicht ist. Lassen Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur ziehen. Nachdem die Lösung in konische 50-Milliliter-Röhrchen überführt wurde, zentrifugieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei 9.300 GS.

Wenn Sie fertig sind, pipettieren Sie die Lösung vorsichtig aus dem konischen Röhrchen und verwerfen Sie sie. Waschen Sie das Pellet mit 30 Millilitern destilliertem Wasser durch Vortexen und zentrifugieren Sie es 30 Minuten lang bei 9.300 g. Wiederholen Sie diesen Schritt 15 Mal, um das Pellet gründlich zu waschen.

Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren die Rückenlage, um das Pellet für die Gefriertrocknung zu isolieren. Nach der Gefriertrocknung geben Sie die Probe in ein Fläschchen mit der Aufschrift Lignin. 50 Milliliter steriles Medium M nine minimal in einen sterilen 125-Milliliter-Kolben geben.

Geben Sie dann 10 Vol.-% der Schwarzlauge auf das Medium. Zur Inokulation werden 0,1 Vol.-% einer Bakterienkultur über Nacht in die Mischung gegeben, die Kulturen bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator unter Schütteln bei 200 U/min inkubiert. In der Mitte der logarithmischen Phase werden die Bakterien mit einer Spritze in eine versiegelte sterile anaerobe Serumflasche überführt, nachdem die von der UNO geimpften und geimpften Bakterienkulturen zentrifugiert wurden.

Nach 450 Stunden Wachstum gibst du 10 Milliliter jedes Überstands in separate Reagenzgläser aus Glas. Säuern Sie jeden Überstand mit konzentrierter Salzsäure an, die tropfenweise auf einen pH-Wert von eins bis zwei zugegeben wird. Für jede Probe werden 30 Milliliter Ethylacetat zu dem supra natanten zugegeben.

Nachdem Sie das Reagenzglas verschlossen haben, mischen Sie die Lösung, indem Sie das Röhrchen vier- bis sechsmal umdrehen. Geben Sie dann ein bis zwei Gramm wasserfreies Natriumsulfat in ein sauberes Reagenzglas aus Glas. Entnehmen Sie vorsichtig die oberste organische Schicht, indem Sie mit der Einweg-Weidepipette aus Glas pipettieren.

Legen Sie die organische Schicht in das Reagenzglas, das das wasserfreie Natriumsulfat enthält. Entwässern Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, indem Sie vorsichtig auf das Reagenzglas klopfen, um es allmählich zu mischen. Fügen Sie kleine Mengen wasserfreies Natriumsulfat hinzu und mischen Sie, bis keine großen Klumpen mehr vorhanden sind.

Anschließend wird die Lösung unter Vakuum durch einen Buchner-Trichter filtriert, dann die Lösung in einen Verdampferkolben überführt und das Filtrat mit einem Rotationsverdampfer verdampft. Wenn Sie fertig sind, geben Sie drei Milligramm der Extraktionsrückstände aus Ethylacetat in ein zwei Milliliter Braunchromatographie-Fläschchen. Lösen Sie den Rückstand mit 100 Mikrolitern einem, vier Dioxan und 10 Mikrolitern Pyridin.

Geben Sie dann 50 Mikroliter einer Lösung von B-S-T-F-A mit 1%igem Trimethylchlor in die Durchstechflasche. Geben Sie die Lösung in einen Inkubator bei 60 Grad Celsius und schütteln Sie sie 15 Minuten lang. Analysieren Sie die Stichprobe mit GCMS.

Das Sammeln und Modifizieren von Schwarzlauge, die im handwerklichen Zellstoffprozess erzeugt wird, dient dazu, diese Zellstoffabfälle zur Bestimmung der biologischen Abbaukapazität eines einzelnen Bakterienisolats oder einer Mischkultur zu verwenden. Hier ist das aerobe Wachstum dargestellt, gemessen an der optischen Dichte eines Umgebungsstammes, der in LB-Medien und LB-Medien kultiviert wurde, ergänzt mit 10 % neutralisierter Schwarzlauge. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Bakterium in Gegenwart von Schwarzlauge wächst.

Wachstum des Umweltisolats in LB-Medien ist schneller als bei der Züchtung in Gegenwart von Schwarzlauge, aber die optische Dichte beginnt nach 62 Stunden abzunehmen. Während das Wachstum des mikrobiellen Umweltisolats in Gegenwart von Schwarzlauge bis nach 230 Stunden Wachstum weiter zunimmt. Die Wachstumskurve des mikrobiellen Umweltisolats in Gegenwart von Schwarzlauge zeigt ebenfalls ein biphasisches Wachstum, was darauf hindeutet, dass die Schwarzlauge mehr als eine Kohlenstoffquelle enthält, die von dem mikrobiellen Umweltisolat verwendet werden kann, und dass das Bakterium eine Präferenz für die Nährstoffverwertung aufweist.

Weitere Experimente sind notwendig, um seine Fähigkeit zu bestimmen, Schwarzlauge für Wachstumsanforderungen zu nutzen. Man kann auch das Wachstum eines Bakteriums auf nicht neutralisierter Schwarzlauge bestimmen oder die Wirkung erhöhter Konzentrationen von Schwarzlauge auf das Wachstum bestimmen. Nach dem Nachweis des Wachstums von Schwarzlauge kann man die Nutzung der Kohlenstoffquelle mit minimalen Experimenten zum Medienwachstum bestimmen.

Kommerzielle Substrate, aus denen sich die Bestandteile der Lignozellulose zusammensetzen, können als Kohlenstoffquellen in den minimalen Medien verwendet werden. Das hier vorgestellte LIGNOCELLULOSE-Extraktionsprotokoll bietet ein Modell zur Bestimmung der Wachstumsanforderungen des abgebildeten Bakteriums Hier ist das Wachstum des mikrobiellen Isolats aus der Umwelt auf M neun. Minimaler Medienagar, der mit jeder Komponente der Lignocellulose-Extraktion ergänzt wird.

Das Vorhandensein von Kolonien auf den minimalen Medien-Agarplatten deutet auf die Fähigkeit des Umweltisolats hin, Holocellulose, Cellulose, Hemicellulose und Ligninkolonien, die auf M neun vorhanden sind, abzubauen. Minimale Medien können auf die Fähigkeit des Umweltisolats hindeuten, Agar anstelle von Platten abzubauen. Minimale Medienwachstumskurven für Flüssigkulturen könnten auch verwendet werden, um die spezifische Wachstumsrate jeder Lignocellulosefraktion zu bestimmen, so dass Agar, der eine potenzielle Kohlenstoffquelle sein könnte, nicht hinzugefügt werden müsste.

Die Analyse von extrahierten und abgeleiteten Augen- und Bakterienkulturen mittels GCMS zeigt die produzierten Stoffwechselprodukte. Hier ist das GCMS-Spektrum der TMS-Derivate dargestellt, die in der nicht inokulierten Probe vorhanden sind, das Spektrum der TMS-Derivate, die vom mikrobiellen Umweltisolat produziert werden, wenn es anaerob gezüchtet wird, und M nine, minimales Medium mit 10 % nicht neutralisierter Schwarzlauge, ist hier dargestellt. Der Vergleich der beiden Spektren zeigt Unterschiede in den in den Medien vorhandenen Komponenten, was auf das Vorhandensein von Fermentationsprodukten und den Abbau von Schwarzlaugekomponenten hindeutet.

In der inokulierten Probe trat ein Peak mit einer Retentionszeit von 39,34 Minuten auf. Ein Peak mit einer Retentionszeit von 21 Komma 84 Minuten stieg in der inokulierten Probe an. Ein Peak mit einer Retentionszeit von 25,79 nahm in der inokulierten Probe ab.

Das hier gezeigte Spektrum ist das des Guac-Standards, das zur Identifizierung des Peaks mit einer Retentionszeit von 25,79 Minuten verwendet wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie feststellen können, ob ein Mikroorganismus oder ein Konsortium von Mikroorganismen Schwarzlauge abbauen kann. Darüber hinaus können Sie nach diesem Protokoll andere Methoden wie Wachstumskurven verwenden, um zusätzliche Fragen zur Wachstumsrate eines oder mehrerer Mikroorganismen in verschiedenen Konzentrationen von Schwarzlauge oder Ligoncelluloseextraktkomponenten zu beantworten.