Name: Histochemische Färbung von Arabidopsis thaliana Sekundärzellwand-Elemente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Lernen Sie histochemische Färbemethoden zur Visualisierung von Sekundärzellwand-Elementen in Arabidopsis thaliana. Diese Technik ermöglicht die Analyse von Zellwandkomponenten wie Lignin und Zellulose in Pflanzenstängeln.

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Wir sind dankbar für die Bearbeitung von Sabin Russell Unterstützung. Diese Arbeit war Teil des DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org) durch das US Department of Energy, Office of Science, Office of Biological-und Umweltforschung, unterstützt durch Vertrag DE-AC02-05CH11231 zwischen Lawrence Berkeley National Laboratory und das US Department of Energy.

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Die Autoren haben keine finanziellen Konflikte offenzulegen.

A. thaliana Stammabschnitte werden häufig verwendet, um die Organisation der Zellen in der sekundären Zellwand zu untersuchen und qualitativ untersuchen die Unterschiede zwischen Wildtyp und transgenen Pflanzen. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Schneiden der Proben sind direkte schneidend; oder, wenn Proben in Agarose-oder Fixiermittel eingebettet ist, kann mit einem Schnitt Vibratom oder Mikrotom durchgeführt werden. Im Gegensatz zu schneidend, die letzten beiden ermöglichen die Verringerung des Ris...

Die Pflanzenzellwand hält eine Fülle von Informationen innerhalb seiner verschiedenen Komponenten: Lignin, Cellulose, Hemicellulose (Xylan, Glucuronoxylan, Xyloglukan, Arabinoxylans, gemischte Verknüpfung Glucan oder Glucomannan) und Pektin. Die histologische Techniken liefern wichtige visuelle Hinweise in Studium Unterschiede innerhalb der sekundären Zellwände auf organisatorischer und zellulärer Ebene. Verschiedene histologische Techniken wurden entwickelt und kann in der Literatur gefunden werden, aber diese Techniken kann schwierig und zeitaufwendig für Anfänger sein, weil sehr ausführliche Protokolle mit einfachen visuellen Anweisungen sind selten, wenn überhaupt vorhanden. Das Ziel dieser Studie ist es, einfache Richtlinien zur histologischen Färbung Techniken bieten, um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten. Unterteilen des Schaftgewebe ist der erste Schritt bei der Visualisierung von Zellwänden und Zellformen. Obwohl von Hand geschnitten Abschnitte sind kostengünstig und weniger Zeit für die Vorbereitung, die Verwendung eines Vibratom bietet Kontinuität undliefert qualitativ hochwertige Bilder. Mit einem Vibratom ermöglicht die Herstellung besserer Datenqualität durch die Erzeugung auch Abschnitte mit der gleichen Stärke, die hilft, scharfe Bilder und reduziert das Risiko der Herstellung ungenau Unterschiede zwischen den Proben, die einfach von einer schlechten Probenvorbereitung verursacht werden würde. Mit Harze an die frische Proben zu beheben, kann eine Herausforderung für Anfänger und kann immer noch zeitaufwändig sein, selbst für Experten, wenn eine Analyse muss schnell durchgeführt werden. Darüber hinaus wird es unmöglich, irgendeine biologische Aktivität der Probe zu messen, wenn es in ein Harz eingebettet sind. Eine einfache Technik, die Agarose und eine hausgemachte Form beschäftigt ist hilfreich für die Einbettung von Stammzellen Gewebe, und es kann auch in anderen Anwendungen Dissektion der Weichteile erfordern, genutzt werden. Im Vergleich zu Proben in Harz eingebettet, hat dieses Verfahren den Vorteil, dass das Gewebe gesund und reduzierendem Probenmanipulation. Schneiden Gewebe über einen Vibratoms ist sehr präzise und homogen erzeugtschiedenen Abschnitten, die je nach dem Ziel der Studie kann dann mit verschiedenen Färbetechniken verwendet werden. Die einfachsten Methoden, um Lignin und andere Aromaten visualisieren beschäftigen ultraviolettem (UV) Licht. Anregung der aromatischen Moleküle auf durch UV-Licht ist eine alte Technik, aber es ist immer noch eine der schnellsten Ansätze zur Visualisierung von Lignin. Doch tatsächlich ist die UV-Visualisierung nicht ideal für die Erkennung Lignin, weil UV-Licht werden andere Aromaten zu erregen. 1-3: Lignin besteht hauptsächlich aus drei Bausteinen, die Monolignole (Coniferylalkohol, Sinapylalkohol und p-Cumarylalkohol hydroxycinnamyl Alkohole) gemacht. Phloroglucin Flecken können Hinweise auf den Umfang der in das Xylem, Fasern und Luftröhrengewebe 4 vorhanden Zimtaldehyde bereitzustellen. Phloroglucinol ist ein guter Indikator für die allgemeine Zimtaldehyde und kann zwischen Zimtaldehyde und anderen Aromaten unterscheiden. Die Sinapylalkohol Monomere nachgewiesen werden kannund differenziert durch die Verwendung Maule Fleck. Toluidinblau O eine polychromatische Farbstoff und hat die Fähigkeit, verschiedene Elemente der Zellwand in verschiedenen Farben färben daher 5,6. Der primäre Einsatz von Toluidinblau O ist es, Pektin und Lignin 5,6 zu erkennen. Der Vorteil der Verwendung von Toluidinblau O ist, dass viele Elemente der Zellwand kann in einem einzigen Schritt dargestellt werden. Sowohl Calcofluor weiß und Kongorot sind leicht zu verarbeiten und kann verwendet werden, um Zellulose zu visualisieren. Calcofluor weißen Flecken Cellulose, Callose und andere nicht-substituierten oder schwach substituierten β-Glucane 6-9, während Kongorot Flecken direkt an β-(1 → 4)-Glucane und insbesondere zu Cellulose 10,11. Das Ziel dieser Studie ist es, einfache Richtlinien für die Verwendung der oben genannten Färbetechniken, um qualitativ hochwertige Bilder von A zu erhalten bieten thaliana stammt.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>EMD</td><td>MERC2125</td><td>CAS-Nummer: 9012-36-6</td></tr><tr><td>Phloroglucinol</td><td>Sigma</td><td>P 3502</td><td>1,3,5-trihydroxybenzol [CAS-Nummer: 108-73-6]</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>EMD</td><td>HX0603-75</td><td>CAS-Nummer: 7647-01-0</td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid</td><td>EMD</td><td>AX1303-6</td><td>CAS-Nummer: 1336-21-6</td></tr><tr><td>Toulidinblau O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td>Blutenchlorid, Toloniumchlorid [CAS-Nummer 92-31-9]&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaliumpermanganat</td><td>Sigma</td><td>223468</td><td>CAS-Nummer 7722-64-7&nbsp;</td></tr><tr><td>Ethanol 190 proof</td><td>KOPTEC</td><td>V1401</td><td>CAS-Nummer: 64-17-5</td></tr><tr><td>Congo Red</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6277</td><td>Dinatrium-3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalin-1-sulfonat) [CAS-Nummer 573-58-0]</td></tr><tr><td>Fluoreszierender Aufheller 28/ Calcofluor White</td><td>Stain Sigma</td><td>F3543&nbsp;</td><td>4,4'-Bis[[4-[Bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilben-2,2'-disulfonsäure [CAS-Nummer 4404-43-7]&nbsp;</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica Mikrotom mit vibrierender Klinge VT1000S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td></tr> <tr><td>Razor</td><td>American Safety Razor Company</td><td>Artikel # 60-0139-0000&nbsp;</td><td>Doppelschneidige Klinge aus Edelstahl (Personna Super)</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (2 ml)</td><td>VWR</td><td>16466-044</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen (0,6 ml)</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>Handschuh</td><td>Bel-Art</td><td>380000000</td><td>SCIENCEWARE&nbsp; Hot Hand Protector Mitt</td></tr><tr><td>Tissue Adhesive</td><td>Ted Pella Inc</td><td>10033</td><td>Bei 4 & deg; C oder 20 &Grad; C für 3 Monate oder länger Lagerung</td></tr><tr><td>Mikrowelle</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD762S</td><td>PELCO Pro CA 44 Sofort-Tissue-Klebstoff</td></tr><tr><td>Kamera mit CCD-Chip ohne mechanischen Verschluss</td><td>Hamamatsu</td><td>C4742-95</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Farbkamera&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>QImaging</td><td>MicroPublisher 5.0 RTV-Kamera-Software</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>&nbsp; Molecular Devices</td><td>MetaMorph Version 7.7.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Imagining anaylsis&nbsp;</td><td>Adobe&nbsp;</td><td>Photoshop CS4</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Brille, quadratisch, Nr. 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>22 x 22 mm (7/8 x 7/8") - Deckgläser sind korrosionsbeständig und gleichmäßig dick und flach. Die Dicke Nr. 1 beträgt 0,13 bis 0,17 mm.</td></tr><tr><td>Frosted Micro Slides, 1 mm</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75 x 25 mm - 1 mm</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Alcan Verpackung</td><td>BRNDPM998</td><td></td></tr><tr><td>TX2 Filter Würfel</td><td>Leica</td><td>11513851/11513885</td><td>Filter für die Kongorot-Analyse mit einem Bandpass von 560/40.</td></tr></tbody></table>

histochemische färbung von<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; sekundärzellwand-elemente

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana ist ein Modellorganismus, der häufig verwendet wird, um verschiedene zelluläre Prozesse in Pflanzen zu verstehen und zu manipulieren, und er wurde ausgiebig bei der Untersuchung der sekundären Zellwandbildung eingesetzt. Die Ablagerung der sekundären Zellwand erfolgt, nachdem die primäre Zellwand abgelegt wurde, ein Prozess, der ausschließlich von spezialisierten Zellen durchgeführt wird, wie z. B. solchen, die Gefäß- und Fasergewebe bilden. Die meisten sekundären Zellwände bestehen aus Cellulose (40–50 %), Hemicellulose (25–30 %) und Lignin (20–30 %). Mehrere Mutationen, die die Biosynthese der sekundären Zellwand beeinflussen, wurden isoliert, und die entsprechenden Mutanten können offensichtliche Veränderungen der biochemischen Zusammensetzung oder visuelle Phänotypen aufweisen oder auch nicht, da diese Mutationen durch kompensatorische Reaktionen maskiert werden könnten. Färbeverfahren wurden in der Vergangenheit verwendet, um Unterschiede auf zellulärer Basis aufzuzeigen. Bei diesen Methoden handelt es sich ausschließlich um visuelle Analysemittel; Nichtsdestotrotz ist ihre Rolle bei der schnellen und kritischen Analyse von großer Bedeutung. Kongorot und Calcofluorweiß sind Färbungen, die zum Nachweis von Polysacchariden verwendet werden, während Mäule und Phloroglucinol häufig zur Bestimmung von Unterschieden im Lignin verwendet werden, und Toluidinblau O zur unterschiedlichen Färbung von Polysacchariden und Lignin. Die scheinbar einfachen Techniken des Schneidens, Färbens und Darstellens können für Anfänger eine Herausforderung sein. Beginnend mit der Probenvorbereitung unter Verwendung des A. thaliana-Modells beschreibt diese Studie die Protokolle einer Vielzahl von Färbemethoden, die leicht für die Beobachtung der Zell- und Gewebeorganisation in sekundären Zellwänden von Pflanzen implementiert werden können.

Stem Einbetten und Schneiden: Die Verwendung des hausgemachten Kunststoffform, um die Stiele einbetten in 7% Agarose erwies sich schnell und einfach (Abbildung 1). Die beiden Teile (A und B; Abbildung 1) des eingebetteten Ampullensystem machen es einfach, die einfache Wiedergabe der Stammzellen in Agarose eingebettet, wie die Agarose nicht den Fläschchen Teile, die inert sind, bleiben, damit das System sauber. Die Fläschchen können mehrmals über Jahre wiederverwendet werden. Die ...

Die Zusammensetzung der pflanzlichen Zellwand variiert je nach Gewebetyp und kann Lignin, Zellulose, Hemicellulosen und Pektin umfassen. Es wurden verschiedene Färbetechniken entwickelt, um Unterschiede auf Zelltypebene sichtbar zu machen. Dieser Artikel ist eine Zusammenstellung häufig verwendeter Techniken zur Zellwandfärbung.

Histochemische Färbung von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sekundärzellwand-Elemente

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die histochemische Färbung sekundärer Zellwandstrukturen in Arabidopsis ANA darzustellen. Dazu wird zunächst der Pflanzenstängel in Aros eingebettet. Anschließend wird der in Aros eingebettete Stängel ausgeformt und auf Probenträger übertragen, die dann mit einem Vibratom in Querschnitte für den Stammabschnitt geschnitten werden.Anschließend werden die Schnitte verschiedenen histochemischen Färbeprozeduren unterzogen. Abschließend kommt die Mikroskopie zum Einsatz, um die unterschiedlichen Veränderungen der Elemente der sekundären Zellwand, die mittels der histochemischen Färbung sichtbar gemacht wurden, darzustellen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen in der Zellwandforschung zu beantworten, beispielsweise Veränderungen von makulären Geweben in Pflanzenstielen.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da einfache, aber kritische Schritte, die hier in den Protokollen erwähnt werden, zuvor nicht ausführlich dokumentiert oder auf einfache Weise dargestellt wurden. Zunächst bereiten Sie eine selbstgebaute Form zur Einbettung der Stängel unter Verwendung von Plastikgefäßen

histochemical-staining-arabidopsis-thaliana-secondary-cell-wall

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video beschreiben wir die Wiesner-Färbetechnik zur Färbung des in spezialisierten Pflanzenzellen vorhandenen Lignins. Diese Färbetechnik hilft dabei, die verholzten Zellwände in den Stängeln von Arabidopsis thaliana sichtbar zu machen und die Verholzung in den Zellwänden verschiedener Zelltypen zu quantifizieren.

Wiesner-Färbung zur Visualisierung von Lignin: Eine Technik zur Färbung von Ligninablagerungen in Stängeln von Arabidopsis thaliana

In diesem Video beschreiben wir die Maule-Färbetechnik zur Färbung von Syringyllignin, das in den spezialisierten Pflanzenzellen vorhanden ist. Diese Färbetechnik hilft bei der Charakterisierung der Ligninverteilung im Xylem und in den interfaszikulären Fasern.

Maule-Färbung für Lignin: Eine Technik zur Charakterisierung der Ligninverteilung in Stammschnitten von Arabidopsis thaliana

In diesem Video demonstrieren wir die Kongorot-Färbemethode zur Visualisierung von Zelluloseablagerungen in Arabidopsis thaliana-Stammabschnitten.

Kongorot-Färbung: Eine Technik zur Visualisierung von Zelluloseablagerungen in Pflanzenstängelschnitten

In diesem Video beschreiben wir ein Färbeverfahren zur Visualisierung der Zelluloseablagerung in den Zellwänden von Arabidopsis thaliana, einer Dikotyledonenpflanze, unter Verwendung von Calcofluorweiß, das spezifisch an β-verknüpfte Glucane bindet und unter UV-Licht Fluoreszenz zeigt.

Calcofluor-Weißfärbung: Eine einfache Methode zur UV-induzierten Fluoreszenzvisualisierung von Zelluloseablagerungen in Zellwänden von Dikotyledonen-Pflanzenstängelschnitten

Dieses Video zeigt eine Immunfärbetechnik zur Lokalisierung von Arabinogalactan-Proteinen (AGPs) und Pektinen in Pflanzengeweben. Fixierte und in Harz eingebettete Pflanzengewebeschnitte werden mit AGP- und Pektin-spezifischen primären und fluoreszierenden Sekundärantikörpern und einem Cellulose-bindenden Fluoreszenzfarbstoff gefärbt, um ihre gewebespezifische Kolokalisation in der Zellwand aufzudecken.

Immunlokalisation von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen in pflanzlichem Gewebe

Wir bieten hier eine effiziente und zuverlässige Protokoll für die Immunfärbung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, DNA-Färbung, gefolgt von quantitativen und hochauflösende Bildgebung in der whole-mount Arabidopsis thaliana Samenanlagen. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um Chromatin-Modifikationen und Zellkernarchitektur zu analysieren.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

In diesem Protokoll wir beschreiben Techniken für die richtige Zerlegung von Arabidopsis Blumen und Siliques, einige grundlegende Clearing-Techniken und Färbung Verfahren für ganz-Mount Beobachtungen der reproduktiven Strukturen ausgewählt.

Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques

Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie man den CFDA in verschiedene Standorte der unteren Teile von Arabidopsis zuladen. Wir stellen dann das resultierende Verteilungsmuster von CF in den Triebe vor.

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie das Pflanzenmaterial für die Immunlokalisierung von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen fixiert, in ein hydrophiles Acrylharz eingebettet, geschnitten und auf Glasrutschen montiert ist. Wir zeigen, dass zellwandbezogene Epitope mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden.

Fluoreszierende Immunlokalisierung von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen in der Zellwand von Pflanzengeweben

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur histologischen Beobachtung von Gallen, die durch Plasmodiophora brassicae induziert werden. Vibratomschnitte von Hypokotylen werden vor der Fluoreszenzbildgebung entfernt, um die Beteiligung von Transkriptionsfaktoren und Phytohormonen während des Krankheitsverlaufs zu untersuchen. Dieses Protokoll überwindet Einschränkungen bei der Einbettung von Harz und ermöglicht die Visualisierung fluoreszierender Proteine in planta .

Kombination von Clearing- und Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung von Veränderungen der Genexpression und physiologischen Reaktionen auf Plasmodiophora brassicae

Dieses Protokoll beschreibt die Aufbereitung von intakten Proben der Endosperm-Zellschicht in Arabidopsis thaliana-Samen . Die Methode erfordert nur gängige Laborgeräte wie eine Injektionsnadel und eine Präzisionszange und ermöglicht eine hochauflösende fluoreszierende Bildgebung von Endospermzellen sowohl in sich entwickelnden als auch in reifen Samen.

Aufbereitung von intaktem Gewebe für die mikroskopische Analyse der Endosperm-Zellschicht in sich entwickelnden und reifen Arabidopsis-Samen

Lernen Sie histochemische Färbemethoden zur Visualisierung von Sekundärzellwand-Elementen in Arabidopsis thaliana. Diese Technik ermöglicht die Analyse von Zellwandkomponenten wie Lignin und Zellulose in Pflanzenstängeln.

Histochemische Färbung von

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