Imaging Geräumte Intact Biological Systems auf zellulärer Ebene durch 3DISCO

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, fluoreszenzmarkierte intakte biologische Proben ohne histologische Schnitte abzubilden. Dies wird durch sequentielle Inkubation von fixierten Geweben in organischen Lösungsmitteln erreicht, bis eine vollständige Transparenz erreicht ist. Als zweiter Schritt.

Das transparente Gewebe wird mit einem Laser-Scanning-Mikroskop in 3D abgebildet. Anschließend werden die Bildgebungsergebnisse analysiert und die neuronalen Strukturen im undurchtrennten Rückenmark und Gehirn können aus den gesammelten drei Discobildern in 3D rekonstruiert werden. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie neuronale und GAL-Verbindungen im gesamten Gehirn und Rückenmark kartiert werden können.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie der Neurodegeneration, da wir jetzt die neuronale Integrität im gesamten Nervensystem sichtbar machen können. Diese Methode kann zwar Aufschluss über die Organisation des Nervensystems geben, aber auch auf andere Organe wie die Lunge oder das Tumorgewebe angewendet werden. Einmal gemeistert, dauert diese Technik für kleine Organe wie das Rückenmark oder die Lunge nur wenige Stunden und für das Gehirn etwa ein bis zwei Tage. Beginnen Sie den Eingriff, indem Sie zwei bis drei Milliliter frisch zubereitetes 50%iges THF in ein Glasfläschchen pro entnommenem Gewebe geben.

Übertragen Sie dann die fixierten Organe in die Clearing-Lösung und verschließen Sie die Fläschchen sicher. Stellen Sie die Fläschchen auf einen Rotator und decken Sie sie mit Aluminiumfolie ab, wobei Sie die Proben für die entsprechende Zeit bei einer konstanten Drehzahl von 30 U/min umrühren. Entfernen Sie dann die Reinigungslösung und verwenden Sie eine neue PE oder Pipette, um das Gewebe in der nächsten Lösung zu suspendieren.

Halten Sie, wie in der Tabelle angegeben, während des letzten Reinigungsschritts die Proben in Lösung, bis sie für die Multiphotonen- oder Konfokalmikroskopie vollständig transparent sind. Sobald eine vollständige Räumung erreicht ist, wird die Probe zu diesem Zweck auf einen Objektträger montiert. Verwenden Sie Zahnzement, um einen Rand um das Gewebe zu ziehen.

Füllen Sie das Becken mit der endgültigen Reinigungslösung, kurz bevor der Zahnzement vollständig starr wird, und legen Sie dann sofort die gereinigte Probe in die Mitte des Pools und decken Sie sie mit einem Deckglas ab. Drücken Sie das Deckglas, bis es vollständig durch den Zahnzement versiegelt ist und die Oberfläche des für die Lichtblattmikroskopie freigegebenen Organs berührt, sobald eine vollständige Reinigung erreicht ist, montieren Sie es und drehen Sie dann manuell die Schraube des Probenhalters, um die Probe zu fixieren. Tauchen Sie anschließend die Probe in die Bildgebungskammer des Lichtblattmikroskops, die mit der für das abgebildete Gewebe geeigneten endgültigen Reinigungslösung gefüllt ist.

Sammeln Sie dann Z-Scans, die das gesamte gereinigte Gewebe mit der besten Auflösung abdecken, die das Mikroskop liefern kann, und zoomen Sie auf die interessierenden Regionen, um Bilder mit höherer Auflösung zu erhalten. Nach dem Sammeln der Bilder laden Sie die Bildserien in die Amira-Software mit dem resolve RT-Modul. Wenn die Serie geladen wurde, geben Sie die richtigen Voxelgrößen in das Fenster mit den Parametern zum Lesen des Bildes ein und klicken Sie auf OK.

Wählen Sie als Nächstes die Unteranwendung "Multiplanare Ansicht" aus. Verwenden Sie dann die Schieberegler Primär und Dicke, um die optimale Projektionsdicke und den Schwellenwert für die Grauwerte auszuwählen. Verwenden Sie abschließend das Modul Ecken zuschneiden, um die Slices in verschiedenen 3D-Ausrichtungen zu durchsuchen.

Um die Proben zu visualisieren, ist die Kartierung der strukturellen Organisation von Neuronen äußerst wichtig, um zu verstehen, wie sie bei Gesundheit und Krankheit funktionieren. Während Three Disco an verschiedenen Organen eingesetzt werden kann, ist es dann besonders nützlich, um lange neuronale Verbindungen im Rückenmark und im Gehirn aufzuspüren. Mit Hilfe von ultramikroskopischen Scans von großen freigelegten Rückenmarkssegmenten können beispielsweise die axonalen Verbindungen im Rückenmark von Nagetieren über Zentimeter verfolgt werden, wie in diesen Bildern dargestellt

Auf ähnliche Weise können das gesamte gereinigte Mäusegehirn und der Hippocampus abgebildet werden, um neuronale Verbindungen im Gehirn zu verfolgen. Beim Einsatz der konfokalen oder Multiphotonenmikroskopie kann die Abbildungsauflösung vor allem in der Z-Dimension deutlich verbessert werden. Die Multiphotonen-Bildgebung von geklärtem Rückenmark von GFPM-Linienmäusen erzielt beispielsweise ein nahtloses Bild über die gesamte Tiefe von 1,5 bis zwei Millimetern des Rückenmarks.

Die konfokale Mikroskopie am gereinigten Rückenmark liefert auf ähnliche Weise eine verbesserte Auflösung. Die Multiphotonenmikroskopie liefert sehr hochauflösende Bilder zur Visualisierung feiner Details neuronaler Strukturen, einschließlich dendritischer Dornen. Die Samples für drei Discos können auf verschiedene Weise beschriftet werden.

So ist es beispielsweise möglich, das gesamte Gefäßsystem des Gehirns und des Rückenmarks mit Hilfe von Lektin-konjugierten fluoreszierenden Tracern zu markieren, mit denen die Blut-Hirn-Schranke bei Gesundheit und Krankheit untersucht werden kann. Mit Hilfe von drei Discos können auch kleinere Zellen in großen Geweben abgebildet werden. Zum Beispiel sind sowohl Mikroglia als auch Astrozyten stark an der Pathologie der Neurodegeneration beteiligt, einschließlich der Alzheimer-Krankheit und traumatischer Verletzungen.

Anhand von drei Diskotheken kann ihre Dichte und Verteilung im Rückenmark untersucht werden. Auch nicht-neuronales Gewebe kann abgebildet werden. Zum Beispiel können Clara-Zellen in der gesamten Lunge von Nagetieren mit Antikörpern immunmarkiert und ohne Schnitt auf Einzelzellebene abgebildet werden.

In ähnlicher Weise ist es möglich, Zellen im nicht sanktionierten Bauchspeicheldrüsengewebe zu reinigen und abzubilden. In diesen Pankreasbildern werden beispielsweise die fluoreszenzmarkierten Alphazellen nach dem Clearing abgebildet. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die Clearing- und Imaging-Schritte zwar unkompliziert sind, die Datenanalyse jedoch kompliziert sein kann.

Bei der Anwendung dieses Verfahrens ist es wichtig, durchsichtiges Gewebe abzubilden, sobald die vollständige Transparenz erreicht ist, da sich das Fluoreszenzsignal mit der Zeit in der Clearing-Lösung abbaut. Die Entwicklung dieser Technik ebnete den Forschern den Weg, Details und intakte Organe zu erforschen, wie z. B. die Kartierung neuronaler Netzwerke im Gehirn. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man zelluläre und subzelluläre Strukturen in den gesamten Organen klärt, abbildet und anschließend visualisiert und analysiert.