Imaging Geräumte Intact Biological Systems auf zellulärer Ebene durch 3DISCO

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, fluoreszenzmarkierte intakte biologische Proben ohne histologische Schnitttechnik abzubilden. Dies wird durch eine schrittweise Inkubation fixierter Gewebe in organischen Lösungsmitteln erreicht, bis eine vollständige Durchsichtigkeit erzielt ist. Als zweiter Schritt.

Die transparenten Gewebe werden dreidimensional mit einem Laser-Scanning-Mikroskop abgebildet. Anschließend werden die Bildgebungsergebnisse analysiert und die neuronalen Strukturen im ungeschnittenen Rückenmark und Gehirn können aus den gesammelten Three-DiSCO-Bildern dreidimensional rekonstruiert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise, wie neuronale und GAL-Verbindungen im gesamten Gehirn und Rückenmark kartiert werden können.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis in die Therapie der Neurodegeneration hinein, da wir nun die neuronale Integrität im gesamten Nervensystem sichtbar machen können. Obwohl diese Methode Einblicke in die Organisation des Nervensystems ermöglicht, kann sie auch auf andere Organe wie die Lunge oder Tumorgewebe angewendet werden. Nach Beherrschung der Technik dauert die Durchführung nur einige Stunden für kleine Organe wie das Rückenmark oder die Lunge und etwa ein bis zwei Tage für das Gehirn. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie zwei bis drei Milliliter frisch zubereitete 50 %ige THF-Lösung in jedes Glasröhrchen pro gewonnenem Gewebe geben.

Überführen Sie die fixierten Organe anschließend in die Klärungslösung und verschließen Sie die Röhrchen sicher. Stellen Sie die Röhrchen auf einen Rotator und umwickeln Sie sie mit Aluminiumfolie, um die Proben für die jeweils geeignete Zeit bei konstanter Geschwindigkeit von 30 U/min zu rühren. Danach entfernen Sie die Klärungslösung und verwenden eine neue PE-Spitze oder Pipette, um das Gewebe in der nächsten Lösung zu suspendieren.

Wie in der Tabelle im letzten Klärungsschritt angegeben, die Proben so lange in der Lösung belassen, bis sie für die Multiphoton- oder konfokale Mikroskopie vollständig transparent sind. Sobald eine vollständige Klärung erreicht ist, die Probe zu diesem Zweck auf einem Objektträger montieren. Verwenden Sie Zement, um einen Rand um das Gewebe zu bilden.

Füllen Sie die Kammer mit der endgültigen Klärungslösung, kurz bevor der Zahnzement vollständig aushärtet, und legen Sie die geklärte Probe unmittelbar in die Mitte der Kammer, bedecken Sie sie mit einem Deckglas. Drücken Sie das Deckglas so lange herunter, bis es vom Zahnzement vollständig versiegelt ist und die Oberfläche des geklärten Organs berührt, um es für die Lichtblattmikroskopie bereitzustellen; sobald die Klärung abgeschlossen ist, montieren Sie die Probe und drehen dann manuell die Schraube des Probenträgers, um die Probe zu fixieren. Tauchen Sie danach die Probe in die Bildgebungskammer des Lichtblattmikroskops ein, die mit der für das zu untersuchende Gewebe geeigneten endgültigen Klärungslösung gefüllt ist.

Sammeln Sie anschließend Z-Scans, die das gesamte transparente Gewebe mit der höchsten vom Mikroskop erreichbaren Auflösung abdecken, und zoomen Sie in die Regionen von Interesse, um Aufnahmen mit höherer Auflösung zu erhalten. Nach der Bildaufnahme laden Sie die Bildserie in die Amira-Software mit dem Resolve-RT-Modul. Sobald die Serie geladen ist, geben Sie die korrekten Voxelgrößen im Fenster für die Bildleseparameter ein und klicken Sie auf „OK“.

Als Nächstes wählen Sie die Unteranwendung für die multiplanare Ansicht aus. Verwenden Sie anschließend die Schieberegler für Primär- und Dicke, um die optimale Projektionsdicke und Schwelle für die Grauwerte festzulegen. Schließlich nutzen Sie das Zuschneide-Eck-Modul, um die Schnitte in verschiedenen 3D-Orientierungen zu durchsuchen.

Um die Proben sichtbar zu machen, ist die Abbildung der strukturellen Organisation von Neuronen äußerst wichtig, um zu verstehen, wie sie im gesunden Zustand und bei Erkrankungen funktionieren. Während drei disco bei verschiedenen Organen angewendet werden kann, ist sie besonders nützlich zur Verfolgung langgestreckter neuronaler Verbindungen im Rückenmark und Gehirn. Beispielsweise können mithilfe von Ultramikroskopie-Aufnahmen großer, transparent gemachter Rückenmarkabschnitte die axonalen Verbindungen über Zentimeter hinweg im Nagetier-Rückenmark verfolgt werden, wie in diesen Abbildungen dargestellt.

Auf ähnliche Weise kann das gesamte transparentierte Mausgehirn und der Hippocampus abgebildet werden, um neuronale Verbindungen im Gehirn zu verfolgen. Bei Verwendung von konfokaler oder Multiphotonen-Mikroskopie kann die Abbildungsauflösung signifikant verbessert werden, insbesondere in der Z-Dimension. Beispielsweise ermöglicht die Multiphotonen-Aufnahme transparentierter Rückenmarke von GFPM-Linien-Mäusen ein nahtloses Bild über die gesamte Tiefe von 1,5 bis zwei Millimetern des Rückenmarks.

Mittels konfokaler Mikroskopie am transparent gemachten Rückenmark wird auf ähnliche Weise eine verbesserte Auflösung erzielt. Die Multiphotonen-Mikroskopie-Bildgebung transparent gemachter Gehirne liefert hochauflösende Bilder, um feine Details neuronaler Strukturen einschließlich dendritischer Dornen sichtbar zu machen. Die Proben für drei disco können auf verschiedene Weisen markiert werden.

Beispielsweise ist es möglich, das gesamte Blutgefäßsystem von Gehirn und Rückenmark mithilfe fluoreszenzmarkierter Lektin-Tracer zu markieren, die zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schranke in Gesundheit und Krankheit eingesetzt werden können. Mithilfe von drei DISCO-Methoden können auch kleine Zellen in großen Geweben abgebildet werden. So sind beispielsweise Mikroglia und Astrozyten in hohem Maße an der Pathologie neurodegenerativer Erkrankungen beteiligt, einschließlich der Alzheimer-Krankheit und traumatischer Verletzungen.

Mithilfe von drei disco können ihre Dichte und Verteilung im Rückenmark untersucht werden. Auch nicht-neuronale Gewebe können abgebildet werden. Zum Beispiel können Clara-Zellen in den gesamten Nagetierlungen mit Antikörpern immunmarkiert und auf Einzelzellniveau ohne Einbettung und Schnitt abgebildet werden.

Ebenso ist es möglich, Zellen in nicht-sanftem Pankreasgewebe zu klären und abzubilden. Zum Beispiel werden die fluoreszenzmarkierten Alpha-Zellen nach der Klärung in diesen Pankreasbildern abgebildet. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die Schritte zur Klärung und Abbildung zwar unkompliziert sind, die Datenanalyse jedoch kompliziert sein kann.

Während der Anwendung dieses Verfahrens ist es wichtig, durchsichtige Gewebe unmittelbar nach Erreichen der vollständigen Transparenz abzubilden, da das fluoreszierende Signal im Klärmedium im Laufe der Zeit abnimmt. Die Entwicklung dieser Technik eröffnete Forschern die Möglichkeit, Details und intakte Organe zu untersuchen, beispielsweise durch die Kartierung neuronaler Netzwerke im Gehirn. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man zelluläre und subzelluläre Strukturen in gesamten Organen transparent macht und abbildet sowie anschließend visualisiert und analysiert.