Name: Imaging Geräumte Intact Biological Systems auf zellulärer Ebene durch 3DISCO (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Lernen Sie die 3DISCO-Methode zur Bildgebung intakter biologischer Systeme auf zellulärer Ebene kennen. Diese Technik ermöglicht hochaufgelöste 3D-Visualisierung neuronaler Strukturen im Gehirn und Rückenmark ohne histologische Schnitte.

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Wir danken C. Hojer für das kritische Lesen des Manuskripts, B. Bingöl (Genentech) für die Teilnahme an Skript Erzählungen, N. Bien-Ly zum Austausch von Erfahrungen mit verbesserten Gefäßbildgebung mit Schwanzveneninjektion von Lektin-Farbstoff und M Solloway (Genentech ) für die in Pankreas-Bildgebung verwendeten Mäuse. GFP-M-Linie wurde von J. Sanes (Washington University in St. Louis) und CX3CR1-GFP Mäusen durch R. Littman (NYU) erstellt. Die Arbeit wird von Genentech, Inc. unterstützt

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit IACUC (Institutional Animal Care und Verwenden Committee) Vorschriften an Mäusen ~ 3-5 Monate alt durchgeführt. Der Autor erklärt keine konkurrierenden finanziellen Interessen. 1. Tier Perfusion und Gewebepräparation Timing: 30-60 min pro Maus + Postfixierung (wenige Stunden bis über Nacht). <ol><li> Wiegen Sie das Tier zu betäuben und mit Ketamin (80-200 mg / kg) und Xylazin (7-20 mg / kg) oder 2,5% Avertin (0,5 ml/25 g Körpergewicht IP). </li><li> Warten Sie ein paar Minuten für die Anästhesie, komplette wirksam werden. </li><li> Drücken Sie den Zehen und Schwanz des Tieres, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig betäubt wird. </li><li> Perfuse das Tier zuerst bei RT mit 0,1 M Phosphatpuffer (PB) oder 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 5-10 min, bis das Blut vollständig aus dem Gewebe entfernt. </li><li> Schalten Sie die Durchblutung an Fixierungslösung: 4% PFA in 0,1 M PB (oder 0,1 M PBS) und weiter Perfusionmit 4% PFA für 30-40 min bei einer Geschwindigkeit von 3 ml / min. </li><li> Präparieren Sie die Orgel / s von Interesse sorgfältig ohne Beschädigung, z. B. Punktion zu vermeiden und Zusammendrücken des Gewebes, das seziert wird. </li><li> Entfernen Sie die umliegenden Organe (Bindegewebe, Hirnhaut-oder Dura mater) in einer Petrischale mit PBS gefüllt zusätzliche Gewebe. </li><li> Post-fix die Organe in 4% PFA für ein paar Stunden oder über Nacht bei 4 º C. Vermeiden Sie lange nach der Fixierung, weil PFA könnte das Signal zu löschen oder zu erhöhen autofluorecense 10 Überstunden vor allem für GFP-Kanal (die ein geringeres Problem in rot und rot-Kanäle weit ist). </li><li> Kurz vor dem Start der Clearing-Verfahren Waschen der Organe 2-3x mit PBS bei RT. </li></ol> 2. Tissue Clearing Timing: 2-3 Stunden für kleine Organe und 1-4 Tage für große Organe. Hinweise: Die Fluoreszenzmarkierung von den Geweben von Transgen-Expression, virale Transfektion Farbstoff Verfolgung oder AntiKörper Kennzeichnung sollte vor dem Löschen abgeschlossen sein. Alle Gewebe Clearing Schritte werden bei RT durchgeführt. Die Clearinglösungen THF, DBE, BABB (1 Teil Benzylalkohol und Benzylbenzoat Teil 2) und Dichlormethan sind giftig und Inhalation (Verhaltensexperimente in gut belüfteten Abzug) und der direkte Kontakt mit der Haut sollte vermieden werden (Verwendung Nitril-Handschuhe). <ol><li> Vorbereitung 50% (Vol / Vol), 70% und 80% THF Verdünnungen in destilliertem Wasser in getrennten Glasflaschen wie folgt: Für 50% THF, z. B. mischen 25 ml THF und 25 ml destilliertes Wasser in eine Glasflasche mit einem Volumen von mehr als 50 ml beträgt. </li><li> Mix-Lösungen durch leichtes Schütteln der Flasche für einen 1-2 min. </li><li> Beschriften Sie die Glasflasche eindeutig. </li><li> Schließen Sie die Flaschen und halten die Arbeitslösungen in einem dunklen Schrank. Für die besten Ergebnisse, die nicht die gleichen Arbeitslösungen länger als 1-2 Wochen. Daher bestellen die Clearing-Lösungen wie die kleinste zur Verfügung stehende Volumen der Lage Verwendung frischen Reagenzien. </li><li>Füllen Sie die Glasfläschchen (z. B. 2-3 ml) mit dem ersten Clearing-Lösung, 50% THF, und übertragen Sie die Organe von PBS in Glasfläschchen zu Clearing starten. </li><li> Schließen Sie die Glas-Flaschen mit ihren Deckeln und mit einem Rotator (zB ein Rad-Rührer) gerührt. </li><li> Verwenden Sie Aluminiumfolie zu bedecken und halten die Glasflaschen in der Dunkelheit. Starten des Rotors, um die Proben in den Glasfläschchen für die angegebene Zeit (Tabelle 1) mit einer konstanten Geschwindigkeit (~ 30 min) gerührt. </li><li> Entfernen Sie die Clearing-Lösung und fügen Sie den nächsten in der Protokoll, wenn die in Tabelle 1 ist abgeschlossen. </li><li> Sammeln Sie die Clearing-Abfall in Glas Abfallbehälter, die in einer Haube gehalten werden. Wiederholen Sie diesen Schritt für jedes Clearing-Lösung in das Protokoll bis zum Ende. Verwenden Sie einen neuen Pasteur-Pipette, wenn eine neue Clearing-Lösung versetzt (zB Wechsel von THF zu DBE). </li><li> Bei der abschließenden Clearing Schritt mit BABB oder DBE, können die Inkubationszeit verlängert oder sh werdenortened, bis die Proben werden vollständig transparent im sichtbaren Licht (oder gelblich / transparent, wenn es eine sehr große Gewebe wie Gehirn). </li><li> Halten Sie die gelöscht Organe in der letzten Clearing-Lösung jederzeit einschließlich der bildgebenden Schritte. </li></ol> 3. Vorbereitung Geräumte Organe für Imaging Timing: 5-15 min. Hinweis: Bild gelöscht, die Organe, sobald eine vollständige Aufklärung erreicht. Zu diesem Zweck führen Sie die nächsten Schritte, um die Proben für die Lichtmikroskopie-Blatt (zB Ultramikroskopie) oder die konfokale / Multi-Photonen-Mikroskopie vorbereiten. Hinweis: Gelöschte Organe werden ihre Fluoreszenzstärke über die Zeit verlieren (insbesondere z. B. fluoreszierende Proteine, GFP, Antikörpermarkierung ist widerstandsfähiger und kann sogar bessere Ergebnisse mit längeren Inkubationszeiten). Für die Bildgebung, können verschiedene Techniken der Fluoreszenzmikroskopie, so lange verwendet werden, wie die richtige Handhabung der Organe in der CleaRing-Lösung erreicht wird. <ol><li> Für Licht-Blatt-Mikroskopie <ol><li> Setzen oder stellen Sie die Probe entsprechend. </li><li> Befestigen Sie das gelöscht Orgel durch manuelles Drehen Sie die Schraube der Probenhalter 4. </li><li> Tauchen Sie die Probe in die Imaging-Kammer (vorzugsweise aus Glas) von Der Lichtblatt-Mikroskop, das mit BABB oder DBE, je nachdem, was in der letzten Clearing Schritt verwendet wurde gefüllt ist. </li></ol></li><li> Für Mehrphotonen / konfokale Mikroskopie <ol><li> Montieren Sie die Probe auf einem Abbildungs ​​Schieber (oder einer Imaging-Kammer) mit der endgültigen Imaging-Lösung in der Lage, mit einem Multi Photonen-oder konfokalen Mikroskopie, die in der Regel Öl oder Wasser eingetaucht Ziele sein. </li><li> Verwenden Sie Zahnzement um einen Rahmen um das Gewebe zu machen. </li><li> Füllen Sie den Pool mit BABB oder DBE kurz vor Zahnzement wird komplett starr. Hinweis: Die Zahnzement verfestigt sich schnell; üben ein paar Mal, um sich mit ihm vertraut, bevor Sie die eigentlichen Proben. </li><li> Sofort legendie gelöscht Probe in der Mitte des Pools und decken Sie es mit einem Deckglas. </li><li> Drücken Sie die Abdeckung Glas, bis es vollständig von Zahnzement abgedichtet und landet an der Oberfläche des Organs gelöscht, die es erlauben Erreichen der maximalen Bildtiefe durch konfokale / Multi-Photonen-Mikroskopie. Hinweise: Diese sorgt dafür, dass kein Clearing-Lösung wird bei der Abbildung verschüttet werden. Vermeiden Sie das Eintauchen der Abbildungslinse direkt in Clearing-Lösung, die die Linse schädigen können, es sei denn es ist resistent gegen BABB / DBE ist oder eine Schutzhülle. </li></ol></li></ol> 4. Imaging Geräumte Organe Timing: 15-45 min. <ol><li> Sammeln Sie eine z-Scan über den gesamten gelöscht Gewebe (wenn das verwendete Objektiv ermöglicht) zum besten Auflösung, die das Mikroskop liefern kann. </li><li> Zoom auf die Regionen von Interesse für Bilder mit höherer Auflösung zu sammeln. </li></ol> 5. Prüfung der Daten mit der Software Amira <ol><li> Laden Sie das Bild series Software Amira mit ResolveRT-Modul. </li><li> Geben Sie die richtigen Größen in Voxel-Fenster und drücken Sie ok &quot;Bild lesen Parameter&quot;. </li><li> Wählen Sie den &quot;Multi-Hobel View&quot; Sub-Applikation. Dann nutzen Sie die &quot;Stärke&quot;-Regler, um die optimale Schwelle für die Grauwerte wählen, die Anpassung der 2D-und 3D-Werte. </li><li> Visualisieren Sie die Probe, indem Sie die Scheiben in verschiedenen 2D-Orientierungen und mit Ernte-Ecke Modul in 3D-Ansicht. Hinweis: Eine ausführliche Anleitung zur Fehlersuche des Protokolls kann in Ertürk et al 4 gefunden werden. </li></ol>

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</ol>

Es gibt nichts zu offenbaren.

Tissue Clearing-Methoden zielen darauf ab, Streuung von Abbildungslicht durch Anpassung der Brechungsindizes der verschiedenen Gewebeschichten in den Organen gelöscht reduzieren. Als Ergebnis kann die Abbildungs ​​Licht tief in das Gewebe eindringen und die markierten Zellen / Moleküle zu stimulieren. Das alte Konzept der Clearing 17 Gewebe wachsende Aufmerksamkeit nach der ersten anspruchsvolle Anwendung der Technik auf intakten Gehirn der Maus nach Dodt und Kollegen 2 gewonnen. Seitdem gibt es eine schnell wachsende Liste der neuen Clearing-Methoden, einschließlich 3DISCO, Sca / e, ClearT2, CLARITY und SeeDB 3,4,7,18-20. Im Grunde wollen sie alle, die Organe für tiefe Gewebedarstellung transparent durch die Erhaltung der Fluoreszenzmarkierung zu machen. Unter ihnen steht 3DISCO als einer der am einfachsten und reproduzierbaren Verfahren. Es ist relativ schnell im Vergleich zu anderen oben genannten Clearing-Verfahren (1-5 Tage vs 2-3 Wochen für erwachsene Gehirne jeweils) 21. Es wurde bereits erfolgreichvollständig in verschiedenen Organen wie dem Gehirn, Rückenmark, Lymphknoten, Milz, Lunge, soliden Tumoren, Pankreas und Brustdrüsen 3,4,9 aufgebracht. Darüber hinaus sind mehrere Publikationen von unabhängigen Forschungsgruppen bereits diese Methode verwendet, um Bildergebnisse zu erhalten 22,23. Dennoch verschiedenen Gewebeclearingverfahren für unterschiedliche Bedingungen vorteilhaft sein könnte. Während beispielsweise Sca / e und SeeDB anwendbar sind am besten auf 6,7 embryonalen Geweben, sind sie auf Wasserbasis Clearing-Methoden, die einfacher zu handhaben sein, während der Bildgebung konnte. Im Gegensatz dazu ist CLARITY eine komplizierte und kostspielige Clearing-Verfahren. Es ist aber vorteilhaft im Rahmen der Antikörpermarkierung sein kann, vor allem in großen Geweben wie Gehirn 8. Der wichtigste Schritt, um die besten Bildergebnisse zu erhalten, ist von 3DISCO Gewebe Kennzeichnung, die vor der Gewebe Lichtung erreicht wird. Es ist wichtig, mit der stärksten Fluoreszenzsignal möglich beginnen. Dies kann be auf verschiedene Weise einschließlich der transgenen Expression von fluoreszierenden Proteinen erreicht, das Aufspüren von synthetischen Farbstoffen, virale Transfektion oder Antikörpermarkierung. Es sollte bedacht werden, dass jede Clearingverfahren wird das Fluoreszenzsignal der Gewebe zu reduzieren. Daher, wenn das Fluoreszenzsignal nicht stark genug ist zu Beginn - dh es ist nicht leicht nachweisbar vor dem Clearing-Abbildung der gelöscht Gewebe liefern schlechte Ergebnisse. Es gibt einige Einschränkungen von Beseitigungsverfahren, die für Verbesserungen warten. Eine kritische Beschränkung ist, dass, da Clearing Reagenzien verändern die Struktur der Organe gelöscht, können sie nicht auf lebendes Gewebe verwendet werden. Daher sollten Experimente wie mit photoaktivierbares mEos2 24 vor der Befestigung und Clearing durchgeführt werden. Beim Clearing, wird Super-Resolution Imaging des Fluoreszenzsignals von hell und photo Proteine ​​möglich. Darüber hinaus, weil die Clearing Protokoll verringert dieIntensität der fluoreszierenden Proteine ​​können die gelöscht Organe für längere Zeit nicht gelagert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass einige Organe sind schwerer zu löschen. Insbesondere, wenn die Organe präpariert behalten hohe Mengen an Blutzellen (z. B. Milz, Leber), sie sind relativ schwer und Löschen. Es ist auch relativ schwieriger, eine vollständige Beseitigung großer Geweben, wie Gehirn erwachsenen Nagetieren zu erreichen. Solche Gewebe können längere Inkubationszeiten müssen, was andererseits zu verringern könnte das Fluoreszenzsignal. Darüber hinaus, das Bild große transparente Organe ist die Entwicklung von Methoden der Mikroskopie kann auf einmal bei einer hochauflösenden wartet eine Notwendigkeit, angegangen werden. Eine weitere wichtige Einschränkung der Technik ist die Kennzeichnung Gewebe. Während ein starkes Fluoreszenzsignal über genetische oder Virus-Expressions ideal ist, kann nicht jede Zelle oder Molekül genetisch oder viral gekennzeichnet werden. Auf der anderen Seite, ist Antikörpermarkierung von dicken Gewebe keine einfache Prozedur oder gar nicht possible in den meisten Fällen. Es können besondere Permeabilisierung Protokolle und lange Inkubationszeiten müssen (mehrere Tage bis zu einigen Wochen) 3. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Gewebe schrumpfen ~ 20% in jeder Dimension (für Rückenmarksgewebe gemessen) nach dem Löschen vor allem wegen Austrocknung und Entfettung. Diese Schrumpfung tritt ratiometrisch und sollte Quantifizierungsschritten korrigiert werden. Wie in den vorgestellten Ergebnisse beobachtet, fluoreszenzmarkierten Strukturen erhalten bleiben, die die Angabe des Proteinintegrität in den Geweben ist gelöscht. Aufgrund der hydrophoben Natur des endgültigen gelöscht Gewebe, kann es nicht weiter mit Antikörpern gefärbt oder in Wasser enthaltenden Lösungen eingebettet werden z. B.-Focusclear die Klarheit oder 80% Glycerin verwendet wird. Schließlich ist es eine Herausforderung, überwältigend Größen von Bilddaten zu analysieren. Zum Beispiel, wenn eine ganze Maus-Gehirn auf zellulärer Auflösung gescannt, wäre es sehr schwierig zu verfolgen und zu quantifizieren gewünschten structures (zB neuronale Netze oder Gliazellen) und vergleichen Sie über verschiedene Proben in einem automatisierten Weg. Zusammenfassend, während Forscher wollen neue Clearing-Methoden herauszufinden, die verschiedenen Herausforderungen oben (Schwierigkeit Clearing verschiedenen Geweben, Imaging mit hoher Auflösung von größeren Flächen und komplizierte Datenanalyse) sollten parallel verbessert werden. Abschließend neu entwickelte Gewebe Clearing-Techniken, einschließlich 3DISCO, elegant zeigen, dass hochauflösende 3D-Bildgebung von Organen intakt ist jetzt möglich. Mit Hilfe dieser Methoden können die Wissenschaftler anatomischen Informationen der Zellen und Moleküle im intakten Organ zu erhalten. Diese bahnbrechende 3D-Imaging-Studien auf transparenten Organen begeistern eine wachsende Zahl von Forschern, komplexe anatomische und molekulare Organisationen der Gewebe / Organe in Heide und Krankheit zu entschlüsseln.

Die histologische Untersuchung von biologischen Geweben ist ein grundlegender Ansatz für das Verständnis der Natur der Moleküle / Zellen in ihrem natürlichen Kontext. Idealerweise ist hochauflösende Bildgebung des gesamten Organs informativsten und erwünscht. Denn Licht hat eine begrenzte Eindringtiefe, durch Streuung ein, haben feste Organe, um hochauflösende mikroskopische Bildgebung durchführen geschnitten werden. Daher sind die meisten der histologischen Untersuchungen werden auf einigen Gewebeschnitten, die nur einen kleinen Teil des Organs erfolgt. In einigen Studien, zB solche, die mit dem Ziel zu verfolgen, aus neuronalen Verbindungen im Gehirn oder Rückenmark, alle Gewebeschnitte von den Zielorganen werden gesammelt und für eine 3D-Rekonstruktion abgebildet. , Gewebe-Schnitte und die anschließende Abbildung der einzelnen Abschnitte hat jedoch verschiedene Einschränkungen. Dazu gehören als zeitaufwendig und führt zu einer unvollständigen 3D-Rekonstruktion des Gewebes aufgrund mechanischer Verformungen und schwierign in der Ausrichtung der resultierenden Bilder. Vor kurzem hat Clearing-und Imaging intakte Organe transparent als eine bedeutende Lösung für dieses Manko 2,3 entwickelt. Beim Clearing wird das gesamte Organ transparent gemacht so dass die Abbildungslicht zu reisen Ende-zu-Ende (Abbildung 1), um hochauflösende Bilder der ungeschnittenen Orgel mit einem Laser-Scanning-Mikroskop wie ein Multi Photonen oder Lichtblatt-Mikroskop erzeugen ( Abbildung 2). Verschiedene Forschungsgruppen haben neue Gewebe Clearing-Protokolle entwickelt, um der Lage sein, ihre Bild Gewebe von Interesse für verschiedene Zwecke. Dazu zählen organische Lösungsmittel 2-5, Wasser 6,7 und Elektrophorese 8 Clearing-Protokolle. Unter diesen 3-dimensionalen Bildgebung von Organen oder Lösungsmittel gelöscht 3DISCO eine leicht anwendbare Protokoll auf einer Vielzahl von biologischen Proben, einschließlich des zentralen Nervensystems (ZNS) Organe Immunorganen und soliden Tumoren. In zusätzlichIonen, kann es mit verschiedenen Mikroskopietechniken wie leichtes Blatt Fluoreszenzmikroskopie (LSFM), Multiphotonen und konfokaler Laserscanning-Mikroskopie kombiniert werden. 3DISCO wird zum Löschen mit leicht verfügbaren und preiswerten Reagenzien, wie Tetrahydrofuran (THF) und Dibenzylether (DBE), 4 basiert. Das gesamte Protokoll kann so kurz wie 3-4 Stunden dauern. So ist 3DISCO eine robuste und schnelle Technik im Vergleich zu herkömmlichen histologischen Methoden, die Wochen bis Monate in Anspruch nehmen kann 9.

<table><tbody><tr>Die Maus <td></td><td></td><td>Thy-1 GFP (GFP-M)</td><td>ist bei Jackson erhältlich.</td></tr><tr><td>CX3CR1 GFP-Maus</td><td></td><td></td><td>Kann im Littman-Labor an der NYU bezogen werden.</td></tr><tr><td>TgN(hGFAP-ECFP) Maus</td><td></td><td></td><td>Kann von Jackson bezogen werden.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7917-16</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7892-04</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2 Tribromethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>152463</td><td>verwendet zur Herstellung der Avetin-Lösung.</td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma</td><td>186562-12X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Sigma</td><td>270997-12X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dibenzylether</td><td>Sigma</td><td>Sigma, 108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Benzylalkohol</td><td>Sigma</td><td>305197-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Benzylbenzoat</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Lectin FITC</td><td>Sigma</td><td>L0401-1MG</td><td></td></tr><tr><td>anti-CC10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9772</td><td>0,388888889</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>APP Pharmazeutika</td><td>504001</td><td>Wird in der Perfusion verwendet.</td></tr><tr><td>Glasfläschchen</td><td>VWR</td><td>548-0554</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Rotator</td><td>VWR</td><td>100498-878</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Fisherbrand</td><td>01-213-104</td><td></td></tr><tr><td>100 ml Medienvorratsflaschen</td><td>Kimax Medienflaschen</td><td>EW-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls evolution Perfusionspumpe mit MF4* Pumpenkopf</td> <td>mit mittlerem DurchflussGilson, Inc</td><td>F110701 und F117606</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopie-Objektträger</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>FastWell</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>FW20</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Corning</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale aus Glas</td><td>Corning Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>Zahnzement</td><td>Lang Dental</td><td>1223PNK</td><td></td></tr><tr><td>Quantofix Peroxid-Test Strips</td><td>Sigma</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>Amira mit RT Resolve Mikroskopie-Modul</td><td>Visage Imaging</td><td>Bildanalysesoftware</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane Imaging</td><td>Bildanalysesoftware</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Freeware</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging geräumte intact biological systems auf zellulärer ebene durch 3disco

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Die Gewebereinigung und anschließende Bildgebung von transparenten Organen ist eine leistungsfähige Methode, um fluoreszenzmarkierte Zellen und Moleküle in 3D, in intakten Organen, zu analysieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen histologischen Methoden, bei denen das interessierende Gewebe für die Fluoreszenzbildgebung geschnitten wird, ermöglicht die 3D-Bildgebung von geklärtem Gewebe die Untersuchung von markierten Zellen und Molekülen in der gesamten Probe. Zu diesem Zweck sollten optisch undurchsichtige Gewebe transparent gemacht werden, indem die refraktären Indizes im gesamten Gewebe aufeinander abgestimmt werden. Anschließend kann das Gewebe sofort mit Laser-Scanning-Mikroskopen abgebildet werden, um ein vollständiges hochauflösendes 3D-Bild der Probe zu erhalten. Eine wachsende Liste von Gewebe-Clearing-Protokollen, darunter 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2 und SeeDB, bietet Forschern neue Möglichkeiten, ihr interessierendes Gewebe als Ganzes abzubilden. Unter ihnen ist 3DISCO eine hochgradig reproduzierbare und unkomplizierte Methode, die verschiedene Arten von Geweben reinigen und mit verschiedenen Mikroskopietechniken verwendet werden kann. Dieses Protokoll beschreibt dieses einfache Verfahren und stellt seine verschiedenen Anwendungen vor. Es werden auch die Grenzen und möglichen Schwierigkeiten diskutiert und wie diese überwunden werden können.

Neuronen sind stark mit extrem langen Morphologie polarisiert Zellen. Ihre Funktion hängt von den Verbindungen, die sie untereinander und mit anderen Geweben zu bilden. Daher ist die Abbildung der Aufbauorganisation der Neuronen, um extrem wichtig zu verstehen, wie sie in Gesundheit und Krankheit zu funktionieren. Allerdings Tracing solche enormen neuronalen Verbindungen während der gesamten Nervensystem vor kurzem connectomics 11 - immer noch eine der größten Herausforderungen in der Neurowissenschaft. Dazu haben sowohl die EU-12 und US 13 große Projekte initiiert, um das menschliche Gehirn abzubilden. Während 3DISCO kann auf verschiedene Organe eingesetzt werden, hat sich als besonders nützlich, um lange neuronale Verbindungen im Rückenmark und im Gehirn zu verfolgen gewesen. Zum Beispiel mit Ultramikroskopie Scans von großen gelöscht Rückenmarksegmente, die axonalen Verbindungen können über Zentimetern in der Nagetier-Rückenmark (folgenAbbildung 2). In ähnlicher Weise kann die gesamte gelöscht Mausgehirn (Abbildung 3a) und Hippocampus (Fig. 3b) dargestellt werden, um neuronale Verbindungen im Gehirn zu folgen. Wenn konfokalen oder Mehrphotonenmikroskopie auf gelöscht Organen verwendet wird, kann die Bildauflösung wesentlich verbessert werden, insbesondere in der z-Dimension. Zum Beispiel, Multi Photonen-Imaging geräumte Rückenmark von GFP-M-Linie Mäuse (Abbildung 4a) erreicht eine nahtloses Bild über die gesamte Tiefe (~ 1,5 bis 2 mm) des Rückenmarks. Konfokale Mikroskopie auf die freiRückenMark liefert eine verbesserte Auflösung in einer ähnlichen Art und Weise (Fig. 4b und c). Multiphotonenmikroskopie Bildgebung gelöscht Gehirn liefert sehr hochauflösende Bilder, feine Details der neuronalen Strukturen, einschließlich dendritischen Dornen (Abbildung 5) zu visualisieren. Die Proben für 3DISCO kann auf verschiedene Arten einschließlich Transgenexpression markiert werden, viral-Transfektion, Farbstoff Verfolgung und Antikörpermarkierung. Zum Beispiel ist es möglich, den gesamten Gefäßsystem des Gehirns (Fig. 6a und b) und Rückenmark (Fig. 6c und d) mit Lectin konjugiert fluoreszierende Tracer 4, die verwendet werden können, um die Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen (BBB kenn ) in Gesundheit und Krankheit. Beide Mikroglia und Astrozyten sind hoch in der Pathologie von Neurodegeneration wie Alzheimer-Erkrankungen und Traumata 14,15 gebracht. Verwendung 3DISCO, ihre Dichte und Verteilung im Rückenmark (Fig. 7) oder des Gehirns untersucht werden. Nicht-neuronalen Geweben können auch dargestellt werden. Zum Beispiel kann Clara-Zellen im gesamten Lunge mit Nagetier-Antikörpern immun und abgebildet ohne Schneiden zu Einzelzellebene (Fig. 8) werden. Ebenso ist es möglich, zu löschen und Bildzellen beispielsAlpha-Zellen in der ungeschnittenen Pankreasgewebe (Abbildung 9). <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. 3DISCO Gewebe Clearing macht ungeschnittenen Gewebe transparent für tiefe Gewebe-Bildgebung. Ungeklärten (a) und gelöscht (b) des Rückenmarkgewebes durch sichtbares Licht zu sehen. Beim Clearing, wird tiefe Gewebe-Laser-Scanning-Mikroskopie möglich. (C) Ungeklärten gelöscht und Rückenmark Gewebe wurden durch 2-Photonen-Mikroskopie abgebildet. Maßstabsbalken in einem, b = 0,5 mm und c = 100 &amp;mgr; m. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. 3DISCO Bildgebung des Rückenmarks zu axonalen Erweiterungen folgen. Seziert Das Rückenmark von Thy-1-GFP-transgene Mauslinie (GFP-M) wird in kleinere Stücke geteilt (~4 mm). Nach folgenden Clearing-Protokoll für kleine Gewebe (Tabelle 1) die transparenten Rückenmark wurden mit Ultramikroskopie visualisiert. 3D-Rekonstruktionen von ~ 4 mm Rückenmark Segment in horizontaler (a), koronare (b) und sagittale Ansicht (c). (D) Vertreter zurückzuführen Axonen (rot) sind in der Graustufen transparent dargestellt. (E) Hochvergrößerungsansicht des angegebenen Bereichs in (d). Maßstabsbalken in a, b, c, d = 0,5 mm und e = 20 &amp;mgr; m. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. 3DISCO Bildgebung des Gehirns und gelöscht Hippocampus. Beispiele gelöscht Gehirne und Hippocampus von GFP-M-Mäuse wurden mit einem Ultramikroskop abgebildet. 3D-Visualisierungen des gesamten Gehirns (a) und Hippocampus (b) Nachweis der neuronalen Netzwrks in der abgebildeten transparente Gewebe. Maßstabsbalken in A = 2 mm und b = 20 &amp;mgr; m. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Tissue Clearing verbessert die durch Mehrphotonenmikroskopie und konfokaler Auflösung. Transparent Rückenmarksegmente von GFP-M Mäusen durch Multiphotonen (a) oder die konfokale Mikroskopie abgebildet (b, c). Beachten Sie, dass Clearing verbessert wesentlich die Auflösung und die Bildtiefe enthüllt die Feinstruktur von Axonen und Dendriten. Maßstabsbalken in einer = 100 pm und b, c = 20 um. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. 3DISCO Bildgebung von dendritischen Dornen. Transparent Hirngewebe von GFP-M Mäusen durch Multiphotonen abgebildet. 3D-Visualisierungen von gescannten Kortex Region in Version vorgestelltsche (a) und horizontale Perspektiven (b). (C) ~ 50 &amp;mgr; m aus den Projektions angegebenen Ebenen (a, b). (D) Hohe Vergrößerung der angegebenen Region in (c) zeigt die feinen Details der neuronalen Strukturen, einschließlich dendritischen Dornen (Pfeilspitzen). Maßstabsbalken in einem = 50 pm, b, c = 25 um, d = 5 um. <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6. 3DISCO des Gefäßsystems. Um die Blutgefäße in den ganzen Organen beschriften, wurde Lektin-FITC-Farbstoff während der Perfusion (vor dem Löschen) verwendet, wie beschrieben 16. Es ist bemerkenswert zu erwähnen, dass wir fanden, dass Schwanzvenen-Injektion des Tracers gibt bessere Signal über Herzdurchblutung des Tracers. Nach dem Sammeln der Fest Gehirn und Rückenmark, werden sie gelöscht und ich wurdenvon Ultramikroskopie maged. 3D-Visualisierung des gesamten Gefäßsystems im Gehirn der Maus Heatmap (a) und Graustufen (a). (B) 3D-Visualisierung des Gefäßsystems eines Rückenmark der Maus in heatmap Segment (c) und Graustufen (d). Die Heat wurden basierend auf der Intensität der Färbung Lektin erzeugt wird; blau: niedrige Intensität (Hintergrund) und rot: hohe Intensität (Gefäßsystem). Maßstabsbalken in der a = 2 mm, b = 1 mm, und c, d = 250 &amp;mgr; m. <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig7highres.jpg" width="500" /> Abbildung 7. 3DISCO von Gliazellen im ZNS-Gewebe gelöscht. Die Rückenmark von transgenen Mäusen, die GFP in Mikroglia TgH (CX3CR1-EGFP) oder Astrozyten TgN (hGFAP-ECFP) wurden gelöscht und durch Mehrphotonenmikroskopie abgebildet. 3D-Rendering von Mikroglia als Oberflächenvolumenvisualisierung (a) und transparent (gezeigt <sTrong&gt; b). (C) einem optischen Projektions (~ 50 &amp;mgr; m) dargestellt, um die Details der Mikroglia im Rückenmark zu zeigen. 3D-Rendering von Astrozyten als Oberflächenvolumenvisualisierung (a) und transparent (b) gezeigt. (F) einem optischen Projektions (~ 50 &amp;mgr; m) dargestellt, um die Details der Astrozyten im Rückenmark zu zeigen. Maßstabsbalken in a, b, d, e = 100 &amp;mgr; m und c, f = 50 &amp;mgr; m. <img alt="Fig. 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig8highres.jpg" width="500" /> Figur 8. 3DISCO einer whole-mount Lungenlappen mit Antikörperfärbung von Clara-Zellen. Für die Whole-mount-Antikörper-Färbung von Lungenlappen, 10 Wochen alte weibliche BALB / c-Mäuse wurden durch die rechte Herzkammer mit PBS perfundiert, um Blut aus der Lunge zu entfernen. Lungen wurden anschließend mit 4% PFA mindestens das dreifache Volumen der th aufgeblasen und fest O / N bei RT in Fixative Gewebe. Am nächsten Tag wurden die Lungen kurz in PBS gespült und der rechte Lappen wurde in 5 ml 1% Triton X-100 in PBS für Permeabilisierung für 48 Stunden oder bis das Gewebe sank setzen. Alle Färbungen wurden in 0,2% Triton X-100 in PBS durchgeführt, das 5% FBS und 2% BSA und Spülungen wurden in 0,2% Triton X-100 in PBS. Die Färbung mit anti-CC10 wurde 72 h bei 4 ° C, gefolgt von umfangreichen Wasch etwa 6 Stunden. Fluoreszenz-Markierung des primären Antikörpers wurde mit Anti-Ziege-Alexa Fluor 594-Sekundär-Antikörper über Nacht bei 4 ° C durch extensive Waschungen für 6 h bis über Nacht, gefolgt erreicht. Am folgenden Tag wurden gefärbt durch Lappen 50%, 70% und 80% THF für 30 min geklärt jeweils gefolgt von drei 30-minütigen Waschungen in 100% THF, gefolgt von 20 min in DCM, gefolgt von 30 min in DBE. Maßstabsbalken in einer und b = 1 mm und c = 100 &amp;mgr; m. <img alt="Fig. 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig9highres.jpg" width="500" /> Abbildung<html> 9. 3DISCO der Bauchspeicheldrüse. Nach Perfusion von Mäusen, wie oben beschrieben, in das Protokoll, das Pankreas wurde präpariert und mit dem Kurzprotokoll gelöscht. Die Fluoreszenz wird von LSL ROSA26 tdTomato Rekombination durch Tamoxifen-Behandlung von Mäusen, die eine 200 kb BAC Transgens überspannt den endogenen Maus-Glucagon Ortes mit CreERT2 in die ATG von Glukagon eingesetzt induzierte abgeleitet. Die Pfeilspitzen markieren einige der fluoreszenz-markiertem alpha-Zellen in der Insel. Maßstabsbalken in a, b und c = 1 mm und d = 500 &amp;mgr; m. <img alt="Tabelle 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg" width="600" /> Tabelle 1. Tissue Clearing-Protokolle für die verschiedenen Geweben. Beispiele für Gewebe Clearing-Protokolle für verschiedene Gewebe. Beachten Sie, dass die Clearingzeit für jeden Schritt kann verkürzt oder verlängert, wie nötig, um die Clearing-Leistung zu verbessern. Das ungefähre Gewicht der kleinen Geweben ~ 20-100 mg und Gehirn ist ~ 300-500 mg.TTPs :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

Um hochauflösende Bilder von fluoreszenzmarkierten Zellen in großen Geweben zu erhalten, sollten idealerweise die biologischen Proben ohne Schnitte abgebildet werden. 3DISCO ist ein unkompliziertes Gewebereinigungsverfahren, das auf sequentieller Inkubation mit organischen Lösungsmitteln basiert. Nach der Freigabe werden die Organe transparent, was einen End-to-End-Laserscan der Probe ermöglicht.

Imaging Geräumte Intact Biological Systems auf zellulärer Ebene durch 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, fluoreszenzmarkierte intakte biologische Proben ohne histologische Schnitttechnik abzubilden. Dies wird durch eine schrittweise Inkubation fixierter Gewebe in organischen Lösungsmitteln erreicht, bis eine vollständige Durchsichtigkeit erzielt ist. Als zweiter Schritt.Die transparenten Gewebe werden dreidimensional mit einem Laser-Scanning-Mikroskop abgebildet. Anschließend werden die Bildgebungsergebnisse analysiert und die neuronalen Strukturen im ungeschnittenen Rückenmark und Gehirn können aus den gesammelten Three-DiSCO-Bildern dreidimensional rekonstruiert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise, wie neuronale und GAL-Verbindungen im gesamten Gehirn und Rückenmark kartiert werden können.Die Implikationen dieser Technik reichen bis in die Therapie der Neurodegeneration hinein, da wir nun die neuronale Integrität im gesamten Nervensystem sichtbar machen können. Obwohl diese Methode Einblicke in die Organisation des Nervensystems ermöglicht, kann sie auch auf andere Organe wie die Lunge oder Tumorgewebe angewendet werden. Nach Beherrschung der Technik dauert die Durchführung nur einige Stunden für kleine Organe wie das Rückenmark oder die Lunge und etwa ein bis zwei Tage für das Gehirn. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie zwei bis drei Milliliter frisch zubereitete 50 %ige THF-Lösung in jedes Glasröhrchen pro gewonnenem Gewebe geben.Überführen Sie die fixierten Organe anschließend in die Klärungslösung und verschließen Sie die Röhrchen sicher. Stellen Sie die Röhrchen auf einen Rotator und umwickeln Sie sie mit Aluminiumfolie, um die Proben für die jeweils geeignete Zeit bei konstanter Geschwindigkeit von 30 U/min zu rühren. Danach entfernen Sie die Klärungslösung und verwenden eine neue PE-Spitze oder Pipette, um das Gewebe in der nächsten Lösung zu suspendieren.Wie in der Tabelle im letzten Klärungsschritt angegeben, die Proben so lange in der Lösung belassen, bis sie für die Multiphoton- oder konfokale Mikroskopie vollständig transparent sind. Sobald eine vollständige Klärung erreicht ist, die Probe zu diesem Zweck auf einem Objektträger montieren. Verwenden Sie Zement, um einen Rand um das Gewebe zu bilden.Füllen Sie die Kammer mit der endgültigen Klärungslösung, kurz bevor der Zahnzement vollständig aushärtet, und legen Sie die geklärte Probe unmittelbar in die Mitte der Kammer, bedecken Sie sie mit einem Deckglas. Drücken Sie das Deckglas so lange herunter, bis es vom Zahnzement vollständig versiegelt ist und die Oberfläche des geklärten Organs berührt, um es für die Lichtblattmikroskopie bereitzustellen; sobald die Klärung abgeschlossen ist, montieren Sie die Probe und drehen dann manuell die Schraube des Probenträgers, um die Probe zu fixieren. Tauchen Sie danach die Probe in die Bildgebungskammer des Lichtblattmikroskops ein, die mit der für das zu untersuchende Gewebe geeigneten endgültigen Klärungslösung gefüllt ist.Sammeln Sie anschließend Z-Scans, die das gesamte transparente Gewebe mit der höchsten vom Mikroskop erreichbaren Auflösung abdecken, und zoomen Sie in die Regionen von Interesse, um Aufnahmen mit höherer Auflösung zu erhalten. Nach der Bildaufnahme laden Sie die Bildserie in die Amira-Software mit dem Resolve-RT-Modul. Sobald die Serie geladen ist, geben Sie die korrekten Voxelgrößen im Fenster für die Bildleseparameter ein und klicken Sie auf „OK“.Als Nächstes wählen Sie die Unteranwendung für die multiplanare Ansicht aus. Verwenden Sie anschließend die Schieberegler für Primär- und Dicke, um die optimale Projektionsdicke und Schwelle für die Grauwerte festzulegen. Schließlich nutzen Sie das Zuschneide-Eck-Modul, um die Schnitte in verschiedenen 3D-Orientierungen zu durchsuchen.Um die Proben sichtbar zu machen, ist die Abbildung der strukturellen Organisation von Neuronen äußerst wichtig, um zu verstehen, wie sie im gesunden Zustand und bei Erkrankungen funktionieren. Während drei disco bei verschiedenen Organen angewendet werden kann, ist sie besonders nützlich zur Verfolgung langgestreckter neuronaler Verbindungen im Rückenmark und Gehirn. Beispielsweise können mithilfe von Ultramikroskopie-Aufnahmen großer, transparent gemachter Rückenmarkabschnitte die axonalen Verbindungen über Zentimeter hinweg im Nagetier-Rückenmark verfolgt werden, wie in diesen Abbildungen dargestellt.Auf ähnliche Weise kann das gesamte transparentierte Mausgehirn und der Hippocampus abgebildet werden, um neuronale Verbindungen im Gehirn zu verfolgen. Bei Verwendung von konfokaler oder Multiphotonen-Mikroskopie kann die Abbildungsauflösung signifikant verbessert werden, insbesondere in der Z-Dimension. Beispielsweise ermöglicht die Multiphotonen-Aufnahme transparentierter Rückenmarke von GFPM-Linien-Mäusen ein nahtloses Bild über die gesamte Tiefe von 1,5 bis zwei Millimetern des Rückenmarks.Mittels konfokaler Mikroskopie am transparent gemachten Rückenmark wird auf ähnliche Weise eine verbesserte Auflösung erzielt. Die Multiphotonen-Mikroskopie-Bildgebung transparent gemachter Gehirne liefert hochauflösende Bilder, um feine Details neuronaler Strukturen einschließlich dendritischer Dornen sichtbar zu machen. Die Proben für drei disco können auf verschiedene Weisen markiert werden.Beispielsweise ist es möglich, das gesamte Blutgefäßsystem von Gehirn und Rückenmark mithilfe fluoreszenzmarkierter Lektin-Tracer zu markieren, die zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schranke in Gesundheit und Krankheit eingesetzt werden können. Mithilfe von drei DISCO-Methoden können auch kleine Zellen in großen Geweben abgebildet werden. So sind beispielsweise Mikroglia und Astrozyten in hohem Maße an der Pathologie neurodegenerativer Erkrankungen beteiligt, einschließlich der Alzheimer-Krankheit und traumatischer Verletzungen.Mithilfe von drei disco können ihre Dichte und Verteilung im Rückenmark untersucht werden. Auch nicht-neuronale Gewebe können abgebildet werden. Zum Beispiel können Clara-Zellen in den gesamten Nagetierlungen mit Antikörpern immunmarkiert und auf Einzelzellniveau ohne Einbettung und Schnitt abgebildet werden.Ebenso ist es möglich, Zellen in nicht-sanftem Pankreasgewebe zu klären und abzubilden. Zum Beispiel werden die fluoreszenzmarkierten Alpha-Zellen nach der Klärung in diesen Pankreasbildern abgebildet. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die Schritte zur Klärung und Abbildung zwar unkompliziert sind, die Datenanalyse jedoch kompliziert sein kann.Während der Anwendung dieses Verfahrens ist es wichtig, durchsichtige Gewebe unmittelbar nach Erreichen der vollständigen Transparenz abzubilden, da das fluoreszierende Signal im Klärmedium im Laufe der Zeit abnimmt. Die Entwicklung dieser Technik eröffnete Forschern die Möglichkeit, Details und intakte Organe zu untersuchen, beispielsweise durch die Kartierung neuronaler Netzwerke im Gehirn. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man zelluläre und subzelluläre Strukturen in gesamten Organen transparent macht und abbildet sowie anschließend visualisiert und analysiert.

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