Nucleosidtriphosphaten - von der Synthese zur biochemischen Charakterisierung

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, das Verfahren von der Synthese der modifizierten Nukleosidphosphate bis zu ihrer vollständigen biochemischen Charakterisierung zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der entsprechend geschützte Nukleosidvorläufer durch Anwendung eines vierstufigen Eintopfverfahrens in das entsprechende Triphosphat umgewandelt wird. Der zweite Schritt besteht darin, das resultierende Triphosphat zunächst durch eine Fällung und dann durch eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zu reinigen.

Als nächstes zeichnet sich das Triphosphat-Analogon durch Kernspinresonanz und matrixgestützte Laser-DESORPTIONSIONISATION, Flugzeit oder NMR und Maloff aus, um eine hohe Reinheit zu gewährleisten. Der letzte Schritt sind Primerverlängerungsreaktionen und terminale Desoxynukleotidtransferase- oder TDT-Polymerisationsreaktionen. Letztendlich werden die Reaktionsprodukte und damit die Substratakzeptanz des Triphosphats mittels Gelelektrophorese analysiert.

Der Vorteil dieser Methode im Vergleich zu anderen synthetischen Strategien wie dem Borge-Ansatz besteht darin, dass weniger Nebenprodukte gebildet werden und somit die Reinigung einfacher ist. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es sich um ein ziemlich langwieriges und kompliziertes Verfahren handelt, das Kenntnisse in mehreren Bereichen erfordert. Wir hatten die Idee, diese Methode zu filmen, als wir modifizierte Phosphate synthetisierten und es ziemlich schwierig fanden, ein detailliertes Verfahren zu finden.

Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist, dass sie auch für andere Fragestellungen im Bereich der modifizierten Nukleinsäuren eingesetzt werden kann. In der Tat kann es verwendet werden, um DNA-Enzyme zu selektieren, die ein breites Spektrum von Reaktionen katalysieren. Darüber hinaus kann dieses Verfahren für das funktionelle Tagging von Nukleinsäuren verwendet werden.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da Synthese- und Reinigungsschritte schwer zu erlernen sind, da Triphosphate polare und aktivierte Derivate sind, die mit Vorsicht behandelt werden müssen. Zu Beginn wird das durch Hydroxyl geschützte Nukleosid zweimal mit zwei Millilitern wasserfreiem Purin verdampft, bevor es über Nacht unter Vakuum getrocknet wird. Gleichzeitig löste das Dry Tribunal Ammoniumpyrophosphat unter Vakuum über Nacht am folgenden Tag das Nukleosid in mindestens 200 Mikrolitern trockenem Pyridin.

Fügen Sie dann 400 Mikroliter trockenes Dioxan als COS-Lösungsmittel hinzu. Zum Schluss fügen Sie das zyklische Phosphor-Drei-Derivat hinzu und lassen es 45 Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren. Als nächstes bereiten Sie eine Lösung aus trockenem Butylammoniumpyrophosphat in 170 Mikrolitern trockenem Dimethylformamid und 58 Mikrolitern frisch destilliertem Tributylamin vor.

Geben Sie die resultierende Lösung in das Reaktionsgemisch und lassen Sie sie 45 Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren. Bereiten Sie dann eine Lösung aus 160 Mikromolar Jod in 980 Mikrolitern Purin und 20 Mikrolitern Wasser vor. Die Lösung zum Reaktionsgemisch geben.

Um das Alpha-Phosphor-Zentrum zu oxidieren. Lassen Sie die resultierende dunkle Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur rühren. Verwenden Sie eine 10%ige wässrige Lösung von Natriumthiosulfat, um das überschüssige Jod zu löschen.

Entfernen Sie das Lösungsmittel unter Vakuum. Fügen Sie dann fünf Milliliter Wasser hinzu und lassen Sie die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen, um das zyklische Triphosphat moty zu hydrolysieren. In dieser Phase werden die Schutzgruppen in der Regel entfernt.

Geben Sie daher 30 % Imodiumhydroxid in die Rohprobe. 1,5 Stunden bei Raumtemperatur rühren, bevor das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt wird. Fügen Sie dann zwei Milliliter Wasser hinzu und teilen Sie die Mischung in Röhrchen.

Fügen Sie 12 Milliliter einer 2%igen Lösung von Natrium pro Chlorat in Aceton hinzu und zentrifugieren Sie 30 Minuten lang, bevor Sie den Vorgang wiederholen. Noch einmal. Die Reagenzien, die bei der Synthese aus dem Triphosphat verwendet werden, fallen aus, bilden einen öligen Rückstand und ermöglichen die Trennung der Lösungsmittel, wodurch die anschließende Umkehrphasen-HPLC-Reinigung nach der Lufttrocknung des öligen Rückstands erheblich vereinfacht wird.

Es wird ein P 31-NMR-Spektrum der Rohprobe gemäß den Standardverfahren aufgezeichnet. Nach der NMR löste sich der ölige Rückstand in vier Millilitern destilliertem Wasser auf. Beginnen Sie die HPLC-Reinigung mit der Aufbereitung von 50 millimolaren Triethylammoniumbicarbonat in Reinstwasser als EENT A und in 50 % Acetylnitril als eent B, wie im Textprotokoll beschrieben, entgasen Sie beide EENT unter Vakuum und rühren Sie 20 Minuten lang.

Bereiten Sie eine analytische Probe vor, indem 10 Mikroliter des rohen Triphosphats in 300 Mikrolitern destilliertem Wasser gelöst werden. Verwenden Sie dann in 40 Minuten einen Gradienten von 0 % B bis 100 % B. Injizieren Sie die Probe in ein HPLC-System, das mit einer semi-präparativen umgekehrten Phase-C-18-Säule ausgestattet ist.

Passen Sie das HPLC-Programm entsprechend der Verweilzeit des Triphosphats und des Diphosphats an. Reinigen Sie das Rohgemisch unter diesen Bedingungen und durch Entfernen früher Fraktionen, die etwas Diphosphat enthalten könnten, kombinieren Sie alle Fraktionen, die das Produkt enthalten, und gefriertrocknen Sie es. Anschließend mehrmals mit Reinstwasser mitverdampfen.

Beurteilen Sie die Reinheit des Triphosphats durch NMR und Maloff durch Anwendung von Standardprotokollen. Typische Ausbeuten, die durch die Anwendung dieses Protokolls erzielt werden, liegen im Bereich von 30 bis 70%, abhängig vom Substrat für fünf Grundierungen und der Markierung des Primers. Mischen Sie den Primer und die Reagenzien wie im Textprotokoll beschrieben und inkubieren Sie die Markierungsreaktion 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Während der Markierungsreaktion wird eine G 10 Cidex-Säule vorbereitet, indem eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze mit siloisierter Glaswolle verstopft und die Spitze mit G 10-Lösung gefüllt wird. Schleudern und dreimal mit 500 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser waschen und ein letztes Mal mit 50 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser waschen. Nach der Inkubation der Markierungsreaktion wird die Kinase 10 Minuten lang bei 70 Grad Celsius durch Hitze deaktiviert.

Anschließend wird das Reaktionsgemisch durch den G 10 geleitet. Um das freie radioaktive Markierungsgel zu entfernen, reinigen Sie den radioaktiv markierten Primer und gewinnen Sie durch Anwendung der Crush-and-Soak-Methode Ethanolfällung und G 10-Entsalzung des entgangenen Oligonukleotids zurück. Für die Primerverlängerungsreaktion kombinieren Sie ein PICA-Mol radioaktiv markierten Primer, P eins 10 PICA Mol Primer, P ein und 10 PICA Mol Template, T eins in 10 x Reaktionspuffer und knien Sie in heißem Wasser.

Anschließend über 45 Minuten allmählich auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Legen Sie das Röhrchen auf Eis und fügen Sie den Nukleosidphosphat- oder DNTP-Cocktail und eine Einheit des DNA-Polymerase-Eises hinzu. Schließen Sie die Reaktion mit Wasser für ein Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern ab und inkubieren Sie bei der optimalen Arbeitstemperatur des Enzyms.

Fügen Sie dann 20 Mikroliter Stopplösung hinzu und erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius. Abkühlen lassen, die Proben bei null Grad Celsius abkühlen lassen. Vor der Auflösung durch Denaturierung der Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

Visualisieren Sie die Banden mit einem Phospho-Imager für die TDT-Polymerisation, verdünnen Sie den einzelsträngigen, unmarkierten Primer P zwei und den radiomarkierten Primer in einem Mikroliter TDT-Puffer. Legen Sie das Röhrchen auf Eis und fügen Sie den DNTP-Cocktail und die TDT-Polymerase hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation fügen Sie 10 Mikroliter der Stopplösung hinzu, bevor Sie die Proben fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzen und dann auf null Grad Celsius abkühlen.

Nachdem Sie die Probe durch Denaturierung der Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgelöst haben, visualisieren Sie die Banden mit einem Phospho-Imager. Hier ist ein typisches rohes P 31 NMR-Spektrum eines modifizierten DNTP dargestellt, bei dem die charakteristischen Signale der Phosphorzentren beobachtet werden können. Darüber hinaus Signale, die von der Diphosphat- und Monophosphatseite ausgehen.

Produkte zusammen mit höheren Phosphaten werden in dieser Phase immer beobachtet. Hier ist die Umkehrphasen-HPLC-Analyse des Rohgemisches dargestellt. Der Hauptpeak entspricht dem Fünf-Prime-Phosphat, während das Hauptnebenprodukt, das Fünf-Prim-Diphosphat, eine etwas geringere Retentionszeit aufweist.

Schließlich wird nach einer gründlichen Umkehrphase, der HPLC-Reinigung, das modifizierte DNTP durch NMR charakterisiert und maldi hier ist das Maloff-Spektrum des Sulfaids, modifizierten DUTP-Analogons dargestellt. Das Natriumaddukt ist bei einer Massenüberladung von 712,54 zu sehen, und es ist keine Spur von Diphosphat vorhanden. Sowohl das P 31 NMR- als auch das Protonen-NMR-Spektren sind entscheidend für die Beurteilung der Reinheit des modifizierten dps.

Da das Vorhandensein von unerwünschten Farbstoff- und Monophosphaten charakteristische Signale liefert, ist hier das Ergebnis von primären Verlängerungsreaktionen mit trans-Prolin-modifiziertem DUTP, Histamin-modifiziertem DATP und Valeriansäure-modifiziertem DCTP, die entweder als Einzelmodifikationen als Kombinationen von zwei modifizierten DN-dps oder zusammen zusammen mit einem einzigen natürlichen DGTP verwendet werden. Abschließend wurden repräsentative TDT-vermittelte Polymerisationsreaktionen mit verschiedenen modifizierten DUTP-Analoga mittels denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. In diesem Zusammenhang sind cis-Prolin-modifiziertes DUTP und peptidmodifiziertes DUTP die besten Substrate für TDT.

Da die Tailing-Wirkungsgrade vergleichbar sind oder stattdessen über denen des natürlichen DTTP liegen, ist harnstoffmodifiziertes DUTP in diesem Zusammenhang ein eher schlechtes Substrat. Da nur wenige polydisperse, längere Oligonukleotide beobachtet werden können, kann diese Technik nach der Beherrschung in etwa einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig zu bedenken, dass nukleare cyrische Phosphate die von der Natur aktivierten Bausteine sind und daher beim Umgang mit ihnen nach ihrer Herstellung Vorsicht geboten ist.

Forscher auf dem Gebiet der Nukleinsäuren nutzen diese Methode, um kombinatorische Selektionen zur Erzeugung modifizierter Abers und katalytischer Nukleinsäuren zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie modifizierte Phosphate mit dem vierstufigen Ein-Pop-Verfahren synthetisiert und charakterisiert werden, gefolgt von einer Umkehrphasen-HPLC-Aufreinigung und primären Verlängerungsreaktionen. Es werden einige experimentelle Details deutlich, die normalerweise nicht in experimentellen Abschnitten zu finden sind.

Diese Methode kann in Kombination mit anderen Techniken wie der PCR verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. In der Tat kann es verwendet werden, um die Verträglichkeit von modifizierten Triphosphaten mit Methoden der In-VIO-Selektion zu bewerten.