Ein In vivo Vernetzung Ansatz zur Proteinkomplexe Von Isolieren Drosophila Embryonen
23. April 2014
Mehrkomponenten-Protein-Komplexe spielen eine entscheidende Rolle bei der zellulären Funktion und Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Verfahren verwendet, um native Protein-Komplexe von Drosophila-Embryonen isoliert nach in vivo Vernetzung durch Reinigung der vernetzten Komplexe für die nachfolgende Struktur-Funktions-Analyse.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Protein-Komplexe aus lebenden Drosophila-Embryonen mithilfe eines In-vivo-Vernetzungsansatzes zu gewinnen. Dazu werden zunächst Tausende von Fliegen in einen Populationskäfig gebracht und frühe Embryonen gesammelt. Anschließend werden die Proteine in vivo mit Formaldehyd vernetzt, wodurch ihre internen Protein-Komplexe stabilisiert werden.
Dann werden Proteinextrakte aus den vernetzten Embryonen hergestellt, um die Protein-Komplexe immunpräzipitieren zu können. Die Ergebnisse identifizieren die isolierten Protein-Komplexe mittels Western-Blot-Analyse. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu etablierten Methoden, wie der traditionellen Isolierung von Protein-Komplexen mit in-vitro-Ansätzen, besteht darin, dass dieser in-vivo-Ansatz es uns ermöglicht, vorübergehende, aber funktionell bedeutende Protein-Protein-Interaktionen nachzuweisen, die mit herkömmlichen in-vitro-Methoden möglicherweise nicht erfasst werden können.
Die Technik wird Dr. Min Gao, ein Postdoktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Mischen Sie zunächst Wasser und Fliegenagar mit einem Rührstab. Sterilisieren Sie diese Mischung während des Autoklaviervorgangs.
Mischen Sie Saccharose in Apfelsaft und erhitzen Sie diese Mischung auf einer Platte auf 70 Grad Celsius. Anschließend kombinieren Sie die Mischungen und lassen Sie sie abkühlen, bis das Agar nach 15 Minuten erstarrt ist. Stellen Sie frisches Methyl-4-hydroxybenzoat in Ethanol her.
Dies ist das Konservierungsmittel. Geben Sie es der erstarrenden Mischung hinzu und rühren Sie fünf Minuten lang um. Anschließend gießen Sie die Mischung in 300 Quadratzentimeter große Plastik- oder Styroporschalen, ohne Blasen zu bilden.
Lagern Sie die Platten bei vier Grad Celsius und verwenden Sie sie innerhalb einer Woche. Bereiten Sie einen Populationskäfig mit 40 bis 50.000 Fliegen vor, aus dem Embryonen gesammelt werden sollen. Befestigen Sie zwei frische Maisgrieß-Melasse-Platten, auf deren Oberfläche etwa vier Gramm Bäckerhefe verteilt wurden, am Populationskäfig.
Lassen Sie die Fliegen 48 Stunden lang bei 25 Grad Celsius auf diesen Platten leben. Nach zwei Tagen streuen Sie etwa ein Gramm Hefe auf zwei Agarplatten mit Apfelsaft und ersetzen Sie die Platten im Populationskäfig durch diese Platten. Nach einer Stunde ersetzen Sie die Platten im Käfig durch zwei weitere Platten desselben Typs.
Die beiden Sammelplatten, die die Fliegen eine Stunde lang benutzt haben, werden mit Embryonen beladen. Die Embryonen zusammen mit Wasser von der Platte suspendieren und mit einem Pinsel helfen, sie zu lösen. Anschließend durch ein zweilagiges Sieb gießen.
Die obere Schicht besteht aus einem 850-Mikron-Stahlgitter und die untere Schicht aus einem 75-Mikron-Stahlgitter. Die Embryonen sammeln sich auf dem feineren Gitter und werden mithilfe eines Pinsels von groben Rückständen getrennt. Überführen Sie die Embryonen in einen feinen Nylonsiebkorb, der aus dem oberen Teil eines 50-Milliliter-Konizflaschenverschlusses hergestellt ist.
Spülen Sie die Embryonen mit Wasser ab und trocknen Sie sie im Sieb auf einem Papierhandtuch. Tauchen Sie die Embryonen anschließend drei Minuten lang in eine 50%ige Bleichlösung ein. Schwenken Sie sie in der Bleichlösung, spülen Sie sie danach gründlich mit Wasser ab und tupfen Sie sie trocken.
Die Embryonen werden anschließend etwa 15 Sekunden lang in Isopropanol getaucht. Durch Schwenken lösen sich die Embryonenklumpen auf, wobei der Vorgang nicht länger als 30 Sekunden dauern sollte. Die Embryonen abtupfen und danach fünf Minuten lang in Heptanlösung überführen.
Pipettieren Sie die Heptanlösung häufig über die Embryonen, um ein Verklumpen der Embryonen zu verhindern, tupfen Sie die Embryonen trocken und waschen Sie sie in PBST. Nach einer dreiminütigen Spülung überführen Sie die Embryonen auf dem Netz in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern PBST. Entfernen Sie das Netz, sodass die Embryonen in der Lösung verbleiben, und beobachten Sie zwischen 100 und 300 Mikroliter Embryonen.
Absetzen lassen, das PBST abpipettieren und unmittelbar mit der Vernetzung der Embryonen fortfahren. Zunächst 10 Milliliter frisch zubereitete 0,2 % Formaldehyd in PBST zu den Embryonen geben. Inkubieren Sie sie unter leichtem Rühren bei 25 Grad Celsius für 10 Minuten.
Nach 10 Minuten Reaktionszeit die Embryonen absinken lassen und die Lösung entfernen. Dann die Lösung schnell durch 10 Milliliter 0,25 molarer Glycinlösung in PBST ersetzen, um die Reaktion zu stoppen. Das Gefäß weitere fünf Minuten schütteln. Nach dem Stoppen der Reaktion die Lösung entfernen und die Embryonen dreimal mit jeweils 10 Milliliter PBST waschen.
Entfernen Sie den restlichen PBST mittels Pipettenabsaugung und lagern Sie die Embryonen bei minus 80 Grad Celsius, bis sie benötigt werden. Homogenisieren Sie 500 Mikroliter vernetzte Embryonen unter Verwendung eines Down-Homogenisators und zweier Milliliter Lysepuffer. Dies erfordert etwa 15 Hubbewegungen mit einem eng anliegenden Stößel.
Überführen Sie das Lysat in ein Mikrozentrifugenröhrchen und lassen Sie es 15 Minuten lang vorsichtig schütteln. Zentrifugieren Sie anschließend das Lysat fünf Minuten bei 16.000 ×g. Überführen Sie den Überstand in ein 15-Milliliter-Röhrchen.
Das Pellet kann entsorgt werden. Geben Sie nun zum Überstand 40 Mikroliter der Anti-HA-Agros-Rüben-Suspension hinzu. Lassen Sie dies etwa 2,5 Stunden unter Schütteln inkubieren, nachdem die Kugelkonjugation abgeschlossen ist.
Zentrifugieren Sie die Kügelchen bei 2.500 Gs für fünf Minuten. Lassen Sie etwa 250 Mikroliter Überstand im Röhrchen und resuspendieren Sie die Kügelchen darin. Überführen Sie die suspendierten Kügelchen auf einen 10-Mikrometer-Filter in einer Säulenzentrifuge.
Entfernen Sie die Lösung durch eine zehnsekündige Zentrifugation bei 12.000 G. Waschen Sie die Kügelchen in der Säule mit 200 Mikrolitern Waschpuffer und einer weiteren Zentrifugation. Wiederholen Sie diesen Schritt insgesamt dreimal. Geben Sie anschließend 40 Mikroliter Elutionspuffer zu den Kügelchen hinzu und inkubieren Sie sie 15 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Schütteln Sie das Gefäß während dieses Zeitraums alle fünf Minuten vorsichtig, um das Ouit zu sammeln. Zentrifugieren Sie die Säule erneut bei 12.000 ×g für 10 Sekunden. Die Wirksamkeit der Vernetzung sowie die Reinigung der vernetzten Protein-Komplexe wurde mittels SDS-Page auf einem 3–7%-Stufengel analysiert, gefolgt von einer Westernblot-Analyse. Embryonen, die das HA-Tag und das GFP-Protein exprimieren, wurden verwendet, um das Ausmaß der Vernetzung zu überprüfen und verschiedene Formaldehydkonzentrationen für das Protokoll zu testen.
Der größte Teil des GFP in den behandelten Embryonen vernetzte sich nicht, daher tritt dies nicht auf. Ein zufällig vernetzter Zweierkomplex wurde mit der nicht vernetzten Kontrolle verglichen. Zwei Proteine, die sich nicht vernetzten, sind als Band bei 285 Kilodalton sichtbar, die frei wandert.
Das vernetzte Protein zwei ist schwerer und wandert in einem rohen Proteinglysat weniger weit. Etwa die Hälfte des Proteins zwei war in vivo mit seinen Interaktionspartnern vernetzt. Bei Vergleichsversuchen wurde mit HA-Peptid eluiert, wobei sowohl das komplexgebundene als auch das freie Tubulinprotein in der Elutionsfraktion nachgewiesen wurde, nachdem die Kügelchen gewaschen worden waren.
Nach Entfernung von SDS weitgehend freie Röhrchen mit minimalem Röhrchen-Komplex. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Massenspektrometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Methoden zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung der Proteinbestandteile in den isolierten Komplexen.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur Isolierung nativer Protein-Komplexe aus Drosophila-Embryonen unter Verwendung eines In-vivo-Vernetzungsansatzes vor. Die Technik ermöglicht die Erfassung vorübergehender Proteinwechselwirkungen, die für zelluläre Funktionen entscheidend sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Proteinbiochemie
- Entwicklungsbiologie
Hintergrund
- Mehrkomponteige Protein-Komplexe sind für verschiedene zelluläre Funktionen unerlässlich.
- Herkömmliche Methoden können vorübergehende Protein-Wechselwirkungen übersehen.
- Die in-vivo-Vernetzung bietet eine Möglichkeit, diese Wechselwirkungen zu stabilisieren.
- Drosophila-Embryonen dienen als Modell zur Untersuchung von Protein-Komplexen.
Zweck der Studie
- Isolierung von Protein-Komplexen aus lebenden Drosophila-Embryonen.
- Nutzung der In-vivo-Vernetzung zur Erfassung vorübergehender Wechselwirkungen.
- Analyse der Struktur und Funktion dieser Protein-Komplexe.
Verwendete Methoden
- Fliegen in einen Populationskäfig füllen, um frühe Embryonen zu sammeln.
- Proteine in vivo mit Formaldehyd vernetzen.
- Proteinextrakte aus vernetzten Embryonen herstellen.
- Proteinkomplexe mittels Immunpräzipitation zur Analyse isolieren.
Hauptergebnisse
- Nachweis isolierter Protein-Komplexe mittels Western-Blot-Analyse.
- Beleg der Wirksamkeit der in-vivo-Vernetzung.
- Erfassung transienter Protein-Protein-Interaktionen.
- Vergleich mit herkömmlichen in-vitro-Methoden unterstreicht die Vorteile.
Schlussfolgerungen
- Der In-vivo-Ansatz ist überlegen für die Untersuchung dynamischer Proteinwechselwirkungen.
- Diese Methode kann das Verständnis der Funktionen von Protein-Komplexen verbessern.
- Zukünftige Studien könnten diese Technik auf andere Organismen ausweiten.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Erfassung flüchtiger Protein-Protein-Wechselwirkungen in nativen zellulären Umgebungen bleibt eine entscheidende Herausforderung bei der Zielvalidierung und der mechanistischen Entschärfung von Risiken. Dieser in-vivo-Vernetzungsansatz ermöglicht die Stabilisierung instabiler Komplexe direkt in Drosophila-Embryonen und erhält so physiologisch relevante Wechselwirkungen, die bei herkömmlichen Lysen verloren gehen könnten. Die Methode unterstützt frühe Entdeckungsphasen, indem sie eine genauere Darstellung der endogenen Komplekszusammensetzung bereitstellt und dadurch das Vorhersagevertrauen bei der nachgeschalteten Zielbewertung verbessert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem vorübergehende Protein-Komplexe zur funktionellen Analyse stabilisiert werden.
- Operativer Wert: Verringert falsch-negative Ergebnisse bei der Zielvalidierung, indem Interaktionen erfasst werden, die in vitro übersehen werden.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Risikominderung durch die Erhaltung der nativen Komplexarchitektur in einem krankheitsrelevanten Modellsystem.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme auf, die für die Assay-Standardisierung und Reproduzierbarkeitsprüfungen geeignet sind.
- Operativer Wert: Erzeugt quantitative Ergebnisse mittels Immunpräzipitation und Massenspektrometrie zur zuverlässigen Verbindungsbewertung.
- Wissenschaftlicher Wert: Verbessert die Bereitschaft für das Screening, indem native ähnliche Nachweise zur Zielinteraktion bereitgestellt werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet krankheitsrelevante Einblicke in Systeme durch die Isolierung von Komplexen aus sich entwickelnden Embryonen, einem Modell für konservierte zelluläre Prozesse.
- Operationaler Wert: Stellt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung sicher, indem die Integrität der Komplexe erhalten bleibt.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtert die mechanistische Risikominimierung, indem die Zielbindung mit funktionellen Ergebnissen in der Keimbahnentwicklung verknüpft wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Testung von Target-Hypothesen bis hin zur Identifizierung von Leitstrukturen ein, insbesondere dort, wo vorübergehende Wechselwirkungen die Eignung des Targets beeinflussen. Sie ergänzt die phänotypische Bildschirmanalyse, indem sie einen mechanistischen Kontext für beobachtete Phänotypen bereitstellt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen durch die Isolierung nativer Komplexe unter nahezu physiologischen Bedingungen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitstellung von Assays durch die reproduzierbare Isolierung von durch Vernetzung stabilisierten Komplexen.
- Analytik: Liefert quantitative Messungen mittels Western Blot und Massenspektrometrie, um die Zusammensetzung von Komplexen unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Schafft einen Bezug zur präklinischen Kontinuität, indem konservierte Interaktionsnetzwerke in einem genetisch zugänglichen Modell aufgedeckt werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Plattform zur Isolierung von Komplexen aus verschiedenen Geweben und Organismen, sobald angepasst.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Mehrdeutigkeiten bei Target-Bindungsstudien verringert werden.
- Operationaler Wert: Fördert Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Vernetzungs- und Abbruchschritte.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem transiente Wechselwirkungen aufgedeckt werden, die auf funktionelle Relevanz hindeuten können.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung basierend auf der Stabilität nativer Komplexe und der Stärke der Wechselwirkungen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Embryonen, in der Vernetzungschemie und in Immunpräzipitationstechniken.
- Hängt vom Zugang zu Homogenisierungs-, Zentrifugier- und Filtrationsgeräten für die Lysatzubereitung ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Arbeitsgruppen hinsichtlich der Formaldehydkonzentration, des Zeitpunkts der Reaktionsbeendigung und der Waschstringenz.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf nicht-embryonales Gewebe oder alternative Modellsysteme angewendet wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie eine mögliche Übervernetzung bei hohen Formaldehydkonzentrationen, die Epitope verbergen oder die Elution behindern kann.
