Die Nutzung der Oropharyngeale Intratracheale PAMP Verwaltung und bronchoalveoläre Lavage, um die Immunantwort in Mäusen Bewerten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Verwendung von oropharyngealer intratrachealer Verabreichung, LPS-Verabreichung und bronchoalveolärer Lavage zu demonstrieren, um die Immunantwort des Wirts bei Mäusen zu bewerten. Dies wird erreicht, indem die Maus zunächst mit LPS durch oropharyngeale Verabreichung geimpft wird. Im zweiten Schritt wird eine Trachealkanüle mit bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit eingeführt oder dann durch die Kanüle gesammelt, um die lokale Entzündungsreaktion zu beurteilen.

Im letzten Schritt wird die Lunge mit Formalin für die histopathologische Beurteilung aufgeblasen. Letztendlich können das Zytokinprofil des Darms und die Histopathologie der Lunge analysiert werden, um die Immunantwort des Wirts auf LPS zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der intranasalen Verabreichung und der chirurgischen intratrachealen Verabreichung besteht darin, dass diese Technik relativ einfach durchzuführen ist und eine genaue Dosierung und Lungenablagerung ermöglicht.

Um intratracheal zu injizieren, injizieren Sie zuerst das LPS. Hängen Sie eine anästhesierte Maus an eine Intubation auf. Stellen Sie sich an die vorderen Schneidezähne und stellen Sie sicher, dass das Tier sicher fixiert ist und Maul und Zunge zugänglich sind.

Sichern Sie die Zunge vorsichtig mit einer geraden Pinzette, fassen Sie dann die Zunge mit einer abgewinkelten Pinzette und ziehen Sie den Muskel vorsichtig aus dem Mund, bis beim Halten der Zunge ein leichter Widerstand zu spüren ist. Verabreichen Sie in dieser Position eine Dosis von 50 Mikrolitern LPS in den Rachen und bedecken Sie die Nasenlöcher des Tieres sofort mit einem behandschuhten Finger für fünf bis 10 Atemzüge, um das Bad nach der Tötung aufzufangen. Als nächstes machen Sie einen horizontalen Schnitt über die Länge der Bauchhöhle und einen vertikalen Schnitt von der Bauchhöhle zum Unterkiefer der Maus.

Fassen Sie dann beide Seiten des Schnittes mit der Pinzette und ziehen Sie die Haut sanft von den darunter liegenden Bauch- und Brusthöhlen weg. Machen Sie anschließend einen großen Schnitt entlang der Länge der Bauchhöhle von den Genitalien bis zum Brustbein und achten Sie darauf, dass das Zwerchfell nicht durchtrennt wird. Verschieben Sie dann vorsichtig den Darm in der Bauchhöhle, um den Zugang zu einer der Nieren zu ermöglichen.

Durchtrennen Sie die Nierenvene, die zur Niere führt, um als Abflusspunkt für die Durchblutung zu dienen. Schneiden Sie dann das Zwerchfell mit einer Schere ein, wobei Sie darauf achten, Lunge und Herz zu vermeiden. Um die linke Seite des Herzens freizulegen, verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um das Herz manuell mit PBS zu perfundieren.

Das restliche Blut sollte aus dem Pfortaderschnitt abfließen. Schneide dann mit einer stumpfen, stumpfen Schere vorsichtig den Brustkorb entlang des Brustbeins durch. Darauf achten, dass das Herz und die Lunge nicht geschnitten werden.

Isolieren Sie vorsichtig das Herz und die Lunge und schneiden Sie dann vorsichtig jeden Abschnitt des Brustkorbs mit der stumpfen, stumpfen Schere so nah wie möglich an der Wirbelsäule ab. Nachdem Sie beide Rippenabschnitte vollständig entfernt haben, trennen Sie die Speicheldrüsen, um die Luftröhre freizulegen, und schneiden Sie vorsichtig die Muskeln über der Luftröhre durch, ohne die Luftröhre selbst zu durchtrennen. Trennen Sie nun das Schlüsselbein und fassen Sie sanft die Thymusdrüse und heben Sie sie vom Herzen weg.

Entfernen Sie dann den Thymus mit einer Schere, um zu vermeiden, dass das Herz oder die Lunge geschnitten werden. Verwenden Sie als Nächstes eine abgewinkelte, scharfe, scharfe Schere, um einen kleinen horizontalen Schnitt zu machen, der groß genug ist, um eine Kanüle fest in der Luftröhre zu befestigen, ein bis zwei Ringe unterhalb des Kehlkopfes. Führen Sie dann eine Kanüle so ein, dass das konische Ende zwei bis drei Trachealringe ausstreckt.

Führen Sie unterhalb des Schnitts eine Seidennaht zwischen der Luftröhre und der Speiseröhre durch und ziehen Sie die Naht fest an die Kanüle, um sie zu sichern. Füllen Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze mit HBSS und führen Sie den Köder mit einer langsamen, aber gleichmäßigen Bewegung vorsichtig in die Kanüle ein. Als nächstes injizieren Sie etwa 900 Mikroliter des HBSS in die Luftröhre, um die Lunge aufzublasen, und geben Sie dann sofort mit dem Ziehen des HBSS das wiederhergestellte Ventil in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen ab.

Nach zweimaliger Wiederholung der Spülung sammeln sich etwa drei Milliliter Ventil. Lagern Sie das Ventil auf Eis, um die Lunge zu präparieren Für die histopathologische Analyse führen Sie eine 10-Milliliter-Spritze in einen Lungenaufblasständer ein und befestigen Sie den Schlauch am Köder, den Köder am Absperrhahn und den Absperrhahn an der Spritze, vergewissern Sie sich, dass sich der Absperrhahn in der geschlossenen Position befindet, und füllen Sie dann die Spritze mit neutral gepufferter Formalinlösung. Wenn die Spritze vollständig mit Fixiermittel gefüllt ist, legen Sie ein saugfähiges Handtuch unter das offene Ende des Schlauchs und öffnen Sie den Absperrhahn, damit das Fixiermittel den Schlauch füllen kann.

Sobald das Fixiermittel aus dem Schlauch zu fließen beginnt, schließen Sie sofort den Absperrhahn und füllen Sie die Spritze bis zum Rand mit Fixiermittel nach. Dann führt das zweite Stück Nahtfaden vorsichtig unter der Luftröhre hindurch, etwa ein bis zwei Trachealringe. Binden Sie unterhalb des Endes der Kanüle einen einzelnen losen Knoten in die Naht und führen Sie dann den Schlauch aus der Mausblase ein.

Stelle dich in die Kanüle. Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie die Lungen durch die Schwerkraft aufblasen. Und wenn die Lunge ihr maximales Aufblasniveau erreicht hat, ziehen Sie die Naht fest und binden Sie einen zweiten Knoten.

Schließen Sie den Absperrhahn, entfernen Sie den Schlauch von der Kanüle und fassen Sie dann die Naht mit einer Pinzette. Ziehen Sie die Naht fest nach unten in Richtung Brusthöhle und ziehen Sie die Kanüle vorsichtig zurück in Richtung Nase der Maus, um die Kanüle zu entfernen. Heben Sie als Nächstes die Luftröhre vorsichtig von der Halshöhle weg und verwenden Sie eine stumpfe Schere, um die Luftröhre mit der Gezeitennaht zu durchtrennen.

Sobald die Luftröhre vom darunter liegenden Gewebe befreit ist, beginnen Sie, die Luftröhre von der Maus wegzuziehen und die Lunge vorsichtig aus der Brusthöhle zu heben. Schneiden Sie dann vorsichtig das Bindegewebe durch, das die Lunge in der Brusthöhle hält, mit einer gleichmäßigen Aufwärtskraft und ziehen Sie die Luftröhre weiter vom Körper der Maus weg, wobei Sie darauf achten, die Lunge nicht zu schneiden. Zum Schluss fixieren Sie die Lunge in 10 Millilitern gepuffertem Formin.

In Modellen der LPS-Exposition führt sowohl die Körpertemperatur als auch das Gewicht, unsere typischen Surrogatmarker für die Morbidität und das Fortschreiten der Krankheit bei Tieren, die LPS-Provokation innerhalb der ersten sechs Stunden zu einem signifikanten Abfall der Körpertemperatur, wie in der Grafik dargestellt, der im Laufe von 24 Stunden allmählich wieder auf den Ausgangswert ansteigt. Das Körpergewicht nimmt jedoch im Laufe von 24 Stunden stetig ab, dann erreicht es seinen Höhepunkt und erholt sich in den nächsten 48 bis 72 Stunden allmählich. Daher ist die Körpertemperatur ein geeigneterer Marker, um die frühen Stadien der Entzündungsinitiierung zu bewerten.

Während das Körpergewicht in späteren Stadien der Pathogenese und Genesung zuverlässiger ist, führt die LPS-Exposition der Atemwege zu einem signifikanten Zustrom von Leukozyten. Die Lunge innerhalb der ersten sechs Stunden Zellen, die mit der angeborenen Immunantwort des Wirts assoziiert sind, können in der Klappenklappe beobachtet werden. Die Zellularität nimmt dann in den nächsten 24 bis 48 Stunden weiter zu, wenn die Immunantwort ihren Höhepunkt erreicht und anschließend in eine Phase der Entzündungsauflösung eintritt. Nach 24 Stunden ist eine signifikante Anzahl von Neutrophilen in der Lunge vorhanden und kann nach einer differentiellen Färbung in der Klappe beobachtet werden.

Die Beurteilung der Klappenzellularität bietet eine robuste und quantifizierbare Technik zur Charakterisierung der Zellen, die mit der Immunantwort des Wirts in der Lunge assoziiert sind. Dieser Anstieg steht im Einklang mit einem signifikanten Einstrom von Neutrophilen in die Atemwege, Blutgefäße und das Lungenparenchym. Die Lungenhistopathologie kann mit Hilfe eines semiquantitativen Scoring-Systems, wie im Bild zu sehen ist, effektiv beurteilt werden.

LPS induziert eine signifikante Zunahme von perivaskulären, peribronchiolären und parenchymalen Entzündungen. Die Verabreichung von LPS induziert hohe Konzentrationen an lokalen und systemischen proinflammatorischen Mediatoren, einschließlich mehrerer Zytokine, die mit der angeborenen Immunantwort assoziiert sind, wie von Eliza nachgewiesen. Häufige Zytokine, die nach der LPS-Verabreichung in der Lunge hochreguliert werden, sind TNF, Alpha, IL, eins, beta und IL sechs. Die systemischen Zytokinspiegel können auch im Serum mit den gleichen Techniken bestimmt werden, die für die Darmbeurteilung gezeigt wurden.

Die Methode der Fixierung durch Schwerkraftverschiebung ermöglicht optimale histopathologische Bewertungsbedingungen im Vergleich zu nicht aufgeblähten Lungen oder manuell aufgeblasenen Lungen, die durch die Schwerkraft fixiert sind. Das Aufblasen weist einheitliche Merkmale auf, die eine genaue Bewertung, eine geringere Alveolarschädigung, eine verbesserte Visualisierung und eine höhere Auflösung ermöglichen. Bei der Bewertung von Entzündungen führt das manuelle Aufblasen der Lunge in der Regel zu ungleichmäßigen Aufblasbereichen. Diese Bereiche sind oft teilweise aufgebläht, was zu einem Gewebekollaps führt, der von unerfahrenen Gutachtern häufig als pathologische Merkmale missverstanden wird.

Das manuelle Aufblasen führt auch dazu, dass Bereiche der Lunge übermäßig aufgebläht werden, was zu stark geschädigten Alveolarräumen führt. Nicht aufgeblähte Lungen weisen kollabierte Alveolarräume und Bereiche auf, die ohne umfangreiches Training schwer zu lösen und zu bewerten sind. Da das Organ kollabiert ist, ermöglicht diese Technik auch keine Visualisierung der Lunge, wie sie in situ erscheint.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man LPS-vermittelte akute Lungenentzündungen bei Mäusen mit einem einfachen nicht-chirurgischen oropharyngealen und trachealen Verabreichungsverfahren und einer Gewebeentnahme induziert und beurteilt.