Transcript und Metabolite Profiling für die Beurteilung von Tabakbaum und Pappel als Rohstoff für die Bio-basierte Industrie
16. Mai 2014
Pflanzenbiomasse bietet eine erneuerbare Ressource für mehrere Produkte, einschließlich Kraftstoff, Futtermittel-, Lebensmittel-und einer Vielzahl von Materialien. In diesem Papier untersuchen wir die Eigenschaften von Tabakbaum (Nicotiana glauca) und Pappel als geeignete Quellen für eine Bioraffinerie-Pipeline.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Metaboliten- und RNA-Sequenzierungsdaten aus Tabakbaumblattmaterial für systembiologisch orientierte Schätzungen zu gewinnen und zu optimieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das biologische Material einer Entwicklungsblattserie gesammelt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Extraktion des Materials mit den entsprechenden Lösungsmitteln in Abhängigkeit von der anschließenden Analyse durchzuführen.
Anschließend werden Metaboliten und Kohlenwasserstoffe mittels Gaschromatographie, Massenspektrometrie oder GCMS gemessen und die Transkripte mittels RNA-Sequenzierungsdatenerfassung analysiert. Letztendlich wird die Kombination aus Metaboliten-Profiling und Transkriptionsprofilierung mittels RNA-Sequenzierung verwendet, um zu zeigen, wie Tabakbaumblätter langkettige Kohlenwasserstoffe und andere wichtige Verbindungen entwickeln. Mit dieser Methode können wichtige nützliche Metaboliten, die in den Blättern des Tabakbaums gebildet werden, identifiziert und quantifiziert werden.
Diese Methode kann jedoch einen Einblick in das Metabolom des Tabakbaums geben. Es kann auch für andere Systeme wie Tabak oder verwandte Arten verwendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, aus den Blättern des Tabakbaums gute RNA zu extrahieren.
In diesem multi Bioo PRO Video sehen Sie, wie Mitglieder aus der FERNA-Gruppe Metabolisierung extrahieren und profilieren. Mit GCMS werden Sie auch sehen, wie ein Mitglied der Fraser Group Kohlenwasserstoffe extrahiert, und auch ein Mitglied aus meiner eigenen Gruppe, das RNA für die RNA-Sequenzierung extrahiert. Beginnen Sie mit dem Anbau von Neko Oceana Glauca-Pflanzen in Töpfen mit einem Durchmesser von 30 Zentimetern, die M enthalten, zwei professionelle Anbaumedien, wie im Textprotokoll beschrieben, um die Primärmetaboliten vorzubereiten. Ernten Sie die Blätter und Stängel der Pflanze und frieren Sie das Material sofort ein, lyophilisieren Sie das gefrorene Pflanzenmaterial durch Gefriertrocknung für drei Tage, mahlen Sie dann die lyophilisierten Proben mit einer Mischmühle mit Metallkugeln, aliquotieren Sie das resultierende fein gemahlene trockene Material in ein Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen oder ein Glasfläschchen. Als nächstes aliquotieren Sie 10 Milligramm Blatt oder 20 Milligramm Stängel, gemahlenes trockenes Pflanzenmaterial in zwei Milliliter Schraubverschluss mit rundem Boden
.1,4 Milliliter 100%Methanol zugeben und 10 Sekunden lang wirbeln. Fügen Sie dann 60 Mikroliter Rib Atol als internen quantitativen Standard hinzu, bevor Sie es vortexen. Fügen Sie weitere 10 Sekunden lang eine Edelstahlkugel hinzu und homogenisieren Sie das Material mit einer Rührmühle für zwei Minuten bei 25 Hertz, nachdem Sie 10 Minuten lang zentrifugiert haben.
Bei 11.000-facher Schwerkraft wird der Überstand in ein Glasfläschchen übertragen. Fügen Sie 750 Mikroliter Chloroform und 1,5 Milliliter Wasser hinzu, bevor Sie die Mischung 10 Sekunden lang vortexen. Dann werden 150 Mikroliter aus der oberen Phase in ein frisches 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt.
Trocknen Sie anschließend die Proben mit einem Schnellsauger. Es ist zwingend erforderlich, dass die Proben zwischen drei und 24 Stunden lang auf Trockenheit reduziert werden, bis keine Restflüssigkeit mehr vorhanden ist. Nach dem Trocknen 40 Mikroliter Methinhydrochlorid hinzufügen.
Schütteln Sie die Mischung dann in einem horizontalen Heizblockschüttler zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie 70 Mikroliter M-S-T-F-A-Mischung hinzu und schütteln Sie sie erneut zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Schleudern Sie die Tropfen auf dem Deckel zuvor durch eine kurze Zentrifugation herunter, bevor Sie die Flüssigkeit in Glasfläschchen umfüllen, die für die GC-MS-Analyse geeignet sind.
Analysieren Sie die Daten nach GCMS, indem Sie eine Software für die Analyse von Massenspektrometriedaten konfigurieren und die zu verarbeitende Datenanalyse auswählen. Erstellen Sie eine Tabelle der erkannten Peaks von Interesse in Übereinstimmung mit der Verbindungsstoffklasse. Identifizieren Sie die Peaks durch Koalition von Standardverbindungen, annotieren Sie anschließend die erkannten Peaks mithilfe von Massenspektrometrieanalysen, Algorithmen zur strukturellen Charakterisierung, Literaturrecherche und Metabolitendatenbanksuche für die Kohlenwasserstoffextraktion.
Etwa 200 Milligramm frisch geerntete ncoa glauco-Blätter zwei bis 20 Minuten unlöslich tauchen, die Blätter entfernen und die Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung vollständig trocknen. Anschließend werden die Proben in einem Milliliter Hexan in HPLC-Qualität resuspendiert. Fahren Sie mit der GCM-Analyse der Proben unter Verwendung der Parameter fort, die im Textprotokoll aufgeführt sind.
Verarbeiten Sie zunächst die Chromatogramm-Komponenten mit einem automatisierten MS. Dekonvolutions- und Identifikationssystem und das NIST 98 MS. Bibliothek. Bestätigung der Identifizierung von gesättigten langkettigen Akan-Kohlenwasserstoffen durch Vergleich von Retentionszeiten und klassischen Fragmentierungsmustern mit bekannten authentischen Standards. Als nächstes bestimmen Sie Kohlenwasserstoffe quantitativ, indem Sie integrierte Peakbereiche mit Dosis-Wirkungs-Kurven vergleichen.
Konstruiert aus authentischen Standards, berechnen Sie Mittelwerte und Standardfehler der Mittelwerte mit Hilfe von Excel-Software. Dieses Protokoll kombiniert die TRIOL-RNA-Extraktion mit einem RN Easy Kit, um qualitativ hochwertige RNA-Mahlung von 100 Milligramm gefrorenem Pflanzenmaterial in zwei Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit einer Metallkugel durch eine Mischmühle zu erhalten. Nach der Homogenisierung der Probe wird ein Milliliter Triol hinzugefügt, nachdem das Material 10 Minuten lang bei 12.000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius zentrifugiert wurde.
Den Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführen. Fügen Sie 200 Mikroliter Chloroform hinzu und drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, bevor Sie es drei Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Zentrifugieren die Mischung 15 Minuten lang erhitzen.
Die obere wässrige Phase wird wie bisher in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Fügen Sie ca. 2,5 Volumen Ethanol hinzu. Drehen Sie das Röhrchen mehrmals um und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius.
Verschieben Sie als Nächstes die Probe einschließlich des Niederschlags in eine Spin-Säule. Zentrifugieren Sie die Säule 15 Sekunden lang bei 8.000-facher Schwerkraft und verwerfen Sie den Durchfluss. Geben Sie 700 Mikroliter Waschpuffer RW one, der im Extraktionskit enthalten ist, in die Schleudersäule und Zentrifuge.
Nachdem Sie den Durchfluss verworfen haben, fügen Sie erneut 500 Mikroliter des zweiten Waschpuffers, RPE, in die Schleudersäule hinzu. Zentrifugieren Sie die Säule erneut und verwerfen Sie den Durchfluss, bevor Sie mehr Puffer-RPE hinzufügen und zentrifugieren. Setzen Sie dann wie zuvor die Spin-Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen ein und fügen Sie 50 Mikroliter RNAs mit freiem Wasser hinzu, um die RNA eine Minute lang bei 8.000-facher Schwerkraft zu eluieren.
Entfernen Sie die verbleibende DNA mit einem DNA-freien Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bestimmen Sie im letzten Schritt die Qualität der RNA. Die RNA sollte RNA-Integritätszahlen über acht haben, bevor sie zur Sequenzierung der nächsten Generation geschickt wird.
Das HPLC-Profil zeigt ein repräsentatives Ergebnis der Isoprenoid-Analyse von ncoa glauca Blattextrakten. Die verschiedenen ISOPRENOIDE ab C 40 wurden mit Hilfe eines Photodiodenarray-Detektors detektiert. Die Peaks wurden auf der Grundlage von Codechromatographie und spektralem Vergleich zwischen authentischen Standards annotiert.
Die beiden MS-Chromatogramme sind das Ergebnis einer primären Metabolitenanalyse aus ncoa, glauco-Blatt- und Stängelmaterial. Das MS-Spektrum eines Serin entsprechenden Peaks ist ebenfalls angegeben, als Beispiel wird repräsentative Ausgabe des Bioanalysators gezeigt, der zur Bestimmung der Qualität der RNA verwendet wird. Die beiden Hauptpeaks im Chromatogramm entsprechen 18 s und 25 s ribosomaler RNA, wobei die RNA in dieser Probe auf intakte RNA hinweist.
Zusätzliche Peaks von fragmentierter ribosomaler RNA würden im Falle einer teilweise oder stark degradierten RNA auftreten, sobald sie beherrscht ist. Diese Technik kann schnell durchgeführt werden und ist mit der Analyse anderer Metaboliten nach diesem Verfahren kompatibel. Andere Methoden wie die realtime PCR oder andere Methoden der RNA-Analyse können verwendet werden, um zusätzliche Fragen wie die Produktion kleiner RNAs oder die Expression spezifischer Gene zu beantworten.
Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie man Metabolitendaten aus dem Tabakbaum extrahiert und auswertet.
Übersicht
Diese Studie untersucht die Eigenschaften des Tabakbaums (Nicotiana glauca) und der Pappel als mögliche Quellen für eine Biorefinerie-Pipeline. Der Schwerpunkt liegt auf der Optimierung von Metaboliten- und RNA-Sequenzierungsdaten aus Tabakbaumblättern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pflanzenbiologie
- Biorefinerie-Prozesse
- Metabolomik
Hintergrund
- Pflanzenbasierte Biomasse ist eine nachwachsende Ressource für verschiedene Produkte.
- Die Blätter des Tabakbaums werden aufgrund ihrer metabolischen Eigenschaften untersucht.
- Das Verständnis von Metabolitenprofilen kann die Anwendungsmöglichkeiten in der Biorefinery-Technologie verbessern.
- Mittels RNA-Sequenzierung lässt sich die Genexpression im Zusammenhang mit der Produktion von Metaboliten analysieren.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Extraktion und Profilierung von Metaboliten aus Blättern des Tabakbaums.
- Optimierung der RNA-Sequenzierung für die transkriptionelle Analyse.
- Identifizierung und Quantifizierung nützlicher Metaboliten in Blättern des Tabakbaums.
Verwendete Methoden
- Sammlung von Blattmaterial der Tabakpflanze aus einer Entwicklungsreihe.
- Extraktion von Metaboliten mittels Lösungsmittel für nachfolgende Analysen.
- Bestimmung von Metaboliten und Kohlenwasserstoffen mittels Gaschromatographie und Massenspektrometrie.
- RNA-Extraktion und Sequenzierung zur Transkript-Profilierung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Extraktion und Profilierung von Metaboliten aus Tabakbaumblättern.
- Identifizierung von langkettigen Kohlenwasserstoffen und anderen wichtigen Verbindungen.
- Erkenntnisse zum Metabolom des Tabakbaums und dessen potenzielle Anwendungen.
- Methode anwendbar auf andere verwandte Arten.
Schlussfolgerungen
- Die Studie liefert eine robuste Methode zur Extraktion von Metaboliten und RNA.
- Die Ergebnisse vertiefen das Verständnis der Blattentwicklung des Tabakbaums.
- Mögliche Auswirkungen auf Biorefinerie-Prozesse unter Verwendung von pflanzlicher Biomasse.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht eine systematische Profilierung von Metaboliten und Transkripten in Blättern des Tabakbaums und unterstützt die Identifizierung langkettiger Kohlenwasserstoffe und Isoprenoide, die für die Entwicklung biobasierter Rohstoffe relevant sind. Durch die Integration von GC-MS und RNA-Sequenzierung schafft sie eine Grundlage zur Bewertung der Eignung von Pflanzenbiomasse in nachhaltigen Biorefinery-Prozessen. Der Ansatz trägt zur Risikominderung bei der Zielvalidierung bei, indem Metabolitprodukte mit transkriptioneller Aktivität in einem krankheitsrelevanten System verknüpft werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Korrelation von Metaboliten und Transkripten im Tabakbaum.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch Identifizierung funktioneller Signalwege, die an der Kohlenwasserstoff- und Isoprenoidbiosynthese beteiligt sind.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Identifizierung von Leitverbindungen durch Quantifizierung bioaktiver Verbindungen mit potenziellem industriellen Nutzen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Analyse vor, indem reproduzierbare Protokolle für die Metaboliten-Extraktion und -Detektion etabliert werden.
- Operationaler Wert: Gewährleistet die Standardisierung von Assays durch einheitliche Verfahren zur Lösungsmittel-Extraktion, Derivatisierung und GC-MS-Analyse.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform bei verwandten Arten aufgrund anpassungsfähiger Extraktions- und Sequenzierungsverfahren.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Biomarker-Korrelation: Verknüpft Metabolitenprofile (z. B. langkettige Kohlenwasserstoffe) mit transkriptioneller Aktivität und unterstützt so die Entdeckung von Biomarkern in pflanzlichen Systemen.
- Relevanz präklinischer Modelle: Verwendet den Tabakbaum als krankheitsrelevantes System zur Untersuchung der Biomasseakkumulation und stressreaktiver Signalwege.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Liefert quantitative Daten, um Entscheidungen über die Weiterverfolgung oder Einstellung von Rohstoffauswahlen für Biorefinery-Anwendungen zu unterstützen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie die Metabolitenprofilerstellung mit der transkriptionellen Analyse verknüpft, um hypothesengetriebene Zielvalidierungs- und Leitsubstanzenidentifizierungsphasen zu unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Wegen durch die Korrelation von Metabolitspiegeln mit Genexpressionsdaten aus der RNA-Sequenzierung.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Tests durch standardisierte, reproduzierbare Quantifizierung von Metaboliten und Kohlenwasserstoffen mittels GC-MS mit internen Standards.
- Analytik: Erzeugt quantitative Peakflächen-Daten und spektrale Ausgaben, die einen vergleichenden Analysenansatz über Entwicklungsstadien und Behandlungsbedingungen hinweg ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Kontinuität, indem metabolit-transkriptbezogene Beziehungen identifiziert werden, die die Biomassenutzung vorhersagen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Profilierung von Metaboliten und Transkripten, die auch auf andere Pflanzenarten in Biorefinery-Prozessen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unschärfen durch Multi-Omics-Korrelationen verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch standardisierte Extraktions-, Derivatisierungs- und Sequenzierungsprotokolle.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Weiterentwicklung oder Einstellung, indem quantitative Metabolit- und Transkriptdaten zur Priorisierung von Rohstoffen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht risikoadjustierte Fortschrittsentscheidungen auf Grundlage validierter, biomarkerähnlicher Ergebnisse in Pflanzensystemen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Extraktion pflanzlicher Metabolite, der Bedienung von GC-MS und der Beurteilung der RNA-Integrität.
- Setzt Zugang zu GC-MS, HPLC, Mühlenmixern, Speed-Vacs und Infrastruktur für die RNA-Sequenzierung voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Arbeitsgruppen hinsichtlich Lösungsmittelvolumina, Zentrifugationsparameter und Derivatisierungszeiten.
- Beinhaltet Anpassungen bezüglich unterschiedlicher Gewebefestigkeit der Pflanzen und Stabilität der Metabolite über verschiedene Arten hinweg.
- Aufgrund der Abhängigkeit von Referenzdatenbanken zur Annotation ist die Methode, wie in der Quelle angegeben, auf gut charakterisierte Metabolite beschränkt.
