Name: Gleichzeitige pH-Messung in endozytischen und Cytosolic Fächer in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Erfahren Sie die simultane pH-Messung in endosomalen und zytosolischen Kompartimenten lebender Zellen mittels konfokaler Mikroskopie. Diese Methode nutzt HPTS- und SNF-F1-Sonden für präzise intrazelluläre pH-Dynamik-Analysen.

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Wir danken Dr. Gilles Dupuis für die kritische Lektüre des Manuskripts. 
Finanzierung
Diese Arbeit wurde unterstützt von den Canadian Institutes for Health Research, Zuschuss # MOP-126173. C.M.D ist Mitglied des vom Fonds de la Recherche en Santé (FRSQ) finanzierten Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel.

1. Herstellung von Lösungen für Cellular pH-Kalibrierung <ol><li> Fügen Sie die folgenden Verbindungen zu fünf separate 50 ml konische Röhrchen bis 5 Lösungen für die Kalibrierung verwendet werden vorbereitet: <ul><li> NaCl (1 ml von 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g in 10 ml H 2 0) </li><li> KCl (6,75 ml 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g in 10 ml H 2 0) </li><li> Glucose (1 ml von 1 M D-Glucose) (1 M D-Glucose = 1,80 g in 10 ml H 2 0) </li><li> MgS0 4 (0,05 ml von 1 M MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1,20 g in 10 ml H 2 0) </li><li> 20 mM HEPES (1 ml von 1 M HEPES) (1 M HEPES = 2,38 g in 10 ml H 2 0) </li><li> CaCl 2 (0,05 ml 1 M CaCl 2) (1 M CaCl 2 = 1,47 g in 10 ml H 2 0) Bereiten alle Lösungen in doppelt destilliertem H 2 O (ddH 2 O). </li></ul></li><li> Füllen Sie jede Lösung mit 35 ml ddH2O und mit einem Magnetrührer mischen, bis soLösung erreicht wird. </li><li> Der pH-Wert jeder Lösung mit 1 N KOH oder 1 N HCl auf pH-Werte von 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 und 7,5 erhalten. Dann wird das Volumen mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 50 ml einzustellen. </li><li> Maßnahme 5 mg Nigericin und es auf 670 ul absolutem EtOH hinzufügen, um eine 10 mM Stammlösung Nigericin vorzubereiten. Achtung: Nigericin ist hochtoxisch und müssen mit großer Sorgfalt (Handschuhe, Schutzbrille und Maske) behandelt werden. Mische die Lösung durch Umdrehen bis die Nigericin vollständig gelöst ist. </li><li> In 0,05 ml 10 mM Nigericin (Endkonzentration 10 uM), um die Eichlösungen. Ionophor Nigericin ist, die Permeabilität der Zellmembran erhöht und bewirkt Äquilibrierung von intrazellulären und extrazellulären pH-Wert in Gegenwart eines depolarisierenden Konzentration der extrazellulären K +. </li><li> Eichlösungen kann bis zu 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden, </li></ol> 2. Zellpräparation <ol><li> Unter einer biologischen safety Haube, Samenzellen in 35 mm x 10 mm Kulturschalen in 2 ml Wachstumsmedium mit 10% fötalem Rinderserum und Antibiotika ergänzt. Verwenden der Menge von Zellen benötigt wird, um ungefähr 50% Konfluenz nach 24 Stunden zu gewährleisten. HINWEIS: In unseren Experimenten verwenden wir die HT-1080-Zelllinie und Platte 1 x 10 5 Zellen pro Kulturschale. </li><li> Bestimmen der Anzahl von Kulturschalen für das Experiment und die Platte 5 zusätzliche Kulturschalen für die Kalibrierung verwendet werden, benötigt. </li><li> Ort Kulturschalen bei 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator für mindestens 24 Stunden. </li></ol> 3. Herstellung von pH-Messsonden <ol><li> Bereiten Sie eine 1 M Stammlösung des fluoreszierenden pH-Sonde 8-Hydroxypyren-1, 3,6 trisulfonsäure, Trinatriumsalzes (HPTS / Pyranin) in ddH 2 0. Diese Lösung muss bei RT gelagert und vor Licht geschützt werden. </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 mM 5 - (und-6)-Carboxy seminaphthorhodafluor Acetoxymethylester Acetat (C-SNARF-01.00; genannt Thereâach SNARF-1) durch Lösen von 1 mg SNARF-1 in 1,76 ml DMSO. Durch wiederholtes Pipettieren gründlich mischen. SNARF-1-Lösung muss bei -20 ° C gelagert und vor Licht geschützt werden. </li></ol> 4. Zellmarkierung <ol><li> Sechzehn Stunden vor der Live-Cell-Imaging, fügen 2 ul 1M HPTS Stammlösung (Endkonzentration 1 mM) zu jeder Kulturschale mit 2 ml Vollmedium. </li><li> Bringen Sie die Kulturschalen in den Inkubator. Die HPTS Sonde zell impermeante, daher Label Organellen muss die Sonde durch pinocytosis genommen werden. Diese Bedingung erfordert, dass die Zell Inkubationen mit HPTS in serumhaltigem Kulturmedium durchgeführt. </li><li> Nach der Inkubation mit HPTS, waschen Sie die Zellen zweimal mit sterilem PBS und 2 ml Serum-freiem Medium für mindestens 2 Stunden. Inkubation mit SNARF-1 benötigt, um in serumfreiem Medium durchgeführt, da Serum kann die Aufnahme der Sonde zu verhindern. </li><li> In 10 ul einer 1 mM SNARF-1-Stammlösung zu erhalten afinal Konzentration von 5 uM und lassen Zellen für 20 min bei 37 ° C unter schwachem Licht inkubiert. C-SNARF-1-Konzentration und Inkubationszeit kann je nach Zelltyp variieren. </li><li> Am Ende der Inkubation wurden die Zellen zweimal Waschen in sterilem PBS und 2 ml serumfreies Medium. </li></ol> 5. Zugabe von pH-Modulatoren <ol><li> Um zu beurteilen, ob die Methode können pH-Veränderungen in den Zellen erkennen können verschiedene Reagenzien, die intrazellulären pH-Modulation verwendet werden: <ul><li> Bafilomycin A1, ein spezifischer Inhibitor der V-ATPase-5 </li><li> Na + / H +-Austauscher Isoform 1 (NHE-1) 6 </li><li> NH 4 Cl, eine schwache Base, die intrazelluläre pH 7 erhöht </li></ul><ol><li> Stocklösungen der oben genannten Reagenzien: <ul><li> Bafilomycin A1: 160 ul DMSO hinzufügen 10 ug Bafilomycin A1 um eine Stammlösung von 100 uM erhalten </li><li> EIPA: add 25 mg EIPA auf 1,67 ml Methanol obtaina Endkonzentration von 50 mM </li><li> NH 4 Cl: Man löst 0,53 g Ammoniumchlorid in 10 ml ddH 2 O auf eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten. </li></ul> Hinweis: Alle Stammlösungen sind bei 4 ° C aufbewahrt werden, außer Bafilomycin A1, die bei -20 ° C gelagert und vor Licht geschützt werden müssen. </li><li> In getrennten Kulturschalen, fügen Sie eines der Reagenzien, wie unten beschrieben: <ul><li> 2 ul 100 uM Bafilomycin A1 (Endkonzentration 100 nM) </li><li> 1 ul 50 mM EIPA (Endkonzentration 25 uM) </li><li> 40 ul 1 M NH 4 Cl-Lösung (Endkonzentration 20 mM) </li></ul></li><li> Die Zellen für 30 min bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Fahren Sie mit der Bildaufnahme. </li></ol> 6. Technische Daten des Live-Cell-Imaging-Mikroskop und Akquisition Einstellungen <ol><li> Führen Sie Live-Cell-Imaging mit ein 40X-Objektiv auf einer spektralen invertierten konfokalen Mikroskopie montiertpe mit einem motorisierten XY-Tisch, eine Kammer, die mit Glasboden Kulturschalen in einer kontrollierten Umweltbedingungen (Temperatur, Luftfeuchtigkeit, CO 2)-Stufe Inkubator bietet Platz ausgestattet. </li><li> Das konfokale Instrument (Olympus FV1000) verwendet, hier ist ausgestattet mit: <ul><li> Ein Diodenlaser 405 nm </li><li> A 40 mW Argon-Laser (458 nm, 488 nm, 515 nm) </li><li> Ein Helium-Neon-Laser (543 nm) </li><li> Fluorit-10X-Objektiv, NA0.4 </li><li> Ein LUCPLFLN 40X-Objektiv, NA0.60 </li><li> Ein PLAPONSC PLAN APO 60x Öl-Objektiv, NA1.4 </li><li> Ein dichroitischen Spiegel DM 405/458/488/543 </li><li> Ein SDM 560 und ein SDM 640 dichroitischen Filter </li><li> Ein BA655-755-Sperrfilter </li><li> Ein Strahlteiler BS20/80 </li><li> Datenanalyse-Software für die Bildaufnahme und-analyse, </li></ul></li><li> Sobald die Bühne Inkubator hat bis zu 37 ° C erwärmt und das Mikroskop aufgebaut ist, legen Sie eine Kulturschale zuvor mit HPTS und SNARF-1 in der konfokalen Imaging-Bühne Kammer inkubiert. </li><li> Aach Ortung einen Bereich von Interesse, stellen die Anschaffungs Einstellungen Software Abbildung 1. <ul><li> Richten Sie zwei virtuelle Kanalsätze. </li><li> Initiieren Sie die erste Phase, die HPTS Anregung bei 405 nm und Emission bei 505 entspricht Sammlung - 525 nm und SNARF-1-Anregung bei 543 nm und Emissions Kollektion bei 570 bis 600 nm auf. </li><li> Initiieren Sie die zweite Phase, die HPTS Anregung bei 458 nm und Emission bei 505 entspricht Sammlung - 525 nm und SNARF-1-Anregung bei 543 nm und Emissions Kollektion bei 640 bis 650 nm auf. </li><li> Das konfokale Blende ist standardmäßig auf 175 um eingestellt und optimale Blende muss auf 300 um manuell eingestellt werden. </li><li> Nehmen Bild von Stapelserien horizontale optische Schnitte (800 x 800 Pixel) von 0,4 um Dicke. </li></ul></li></ol> HINWEIS: Ein 40X-Objektiv ist sinnvoll, mehrere Zellen gleichzeitig zu beobachten und funktioniert gut für Organelle Betrachtung. , Räumliche Auflösung und Signalintensität sind jedoch better erreicht mit einem 60x Öl-Objektiv. Darüber hinaus gibt es keine Anregung oder Emission Übersprechen zwischen den beiden Farbstoffen. 7. Kalibrierung von pH-Messsonden <ol><li> Vor der Kalibrierung entfernen Medium von der Kulturschale zuvor mit HPTS und SNARF-1 inkubiert, zweimal mit sterilem PBS und dann 2 ml einer der fünf Kalibrierungslösungen. </li><li> Legen Sie die Kulturschale in die konfokale Stufenkammer. </li><li> Fahren Sie mit Zeitraffer-Bildaufnahme nach den folgenden Einstellungen: <ol><li> Stellen Sie die Anzahl der Bilder und Intervalldauer Zeiten für das Experiment. Hinweis: Wir verwenden in der Regel eine 1 min Intervall zwischen den Bildern für bis zu 30 min. </li><li> Programmieren Sie den Auslöser, um zwischen dem Erwerb von jedem Bild zu schließen. </li></ol></li><li> Notieren Sie sich die Fluoreszenzintensität pro min in einem Tabellenkalkulationssoftware und bestimmen Sie die Zeit, in der Fluoreszenzintensität ist stabil. Die intrazelluläre pH-Wert in der Regel nach 15 stabil - 20 min. </li><li> REPEAT Schritte 7.1 bis 7.4 mit einer neuen Kulturschale für jede verbleibende Kalibrierungslösung. </li></ol> 8. Datenerfassung <ol><li> Sobald die Kalibrierung durchgeführt wurde, zu erwerben Beispieldaten 4-5 zufällig ausgewählten Feldern mit 15-20 Zellen pro Feld. Zwei Bilder werden für jedes Feld erhalten: eine für HPTS Kennzeichnung (Vesikel) und die zweite für SNARF-1-Kennzeichnung (Cytosol). </li><li> Hintergrundfluoreszenz (extrazellulären Bereich) ist digital von Fluoreszenzbilder der beiden Sonden abgezogen. Beschriftete Vesikel und Cytosol von ihren jeweiligen gespeicherten Bilder werden mit Hilfe eines binären Maske ausgewählt. Für jeden pH-Messfühler sind Fluoreszenzintensitäten auf einer numerischen Skala (0-4,095 Graustufenskala) gemessen. Eine mittlere Intensität aller Pixel in der Organelle oder Zytoplasma wird berechnet und die Werte werden verwendet, um Fluoreszenz-Verhältnisse zu berechnen. </li></ol> 9. Datenanalyse <ol><li> Verschiedene Software-Pakete sind für die Datenanalyse im Handel erhältlich. DhFluoView Software. </li><li> In einer Tabellenkalkulation, Datensatzwerte und berechnen Fluoreszenzverhältnisse wie folgt: Im Fall von HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm) und, im Fall von SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm ). </li><li> Zeichnen Sie die Daten mit Hilfe wissenschaftlicher Grafik-Software wie GraphPad Prism. Das Grundstück sollte Fluoreszenzverhältnisse (Y-Achse) in Abhängigkeit von pH-Wert (X-Achse) zu porträtieren. Kurvenanpassung unter Verwendung nicht-linearer Regression gelöst. </li><li> Sammeln Fluoreszenzintensitäten der Proben, wie in Schritt 8.2 beschrieben und berechnen Fluoreszenzverhältnisse. Verwenden Eichkurven-Verhältnisse in pH-Werte zu transformieren. </li></ol>

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<li>Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-pH+crosstalks+in+rat+mast+cells%3A+cytosolic+alkalinization%2C+but+not+intracellular+calcium+release%2C+is+a+sufficient+signal+for+degranulation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation.</a> Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).</li>
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</ol>

Es wurde kein Interessenkonflikt erklärt.

Quantitative pH-Messung in lebenden Zellen von verschiedenen zellulären Kompartimenten wird benötigt, um pH-Schwankungen in Zell-Antworten auf externen Herausforderungen genau zu messen. Allerdings ist eine der größten Hürden, die bleibt, um einfach und gezielt zellulären Kompartimenten. In diesem Zusammenhang haben einige Studien den Einsatz von HPTS als intrazellulärer pH-Indikator durch Elektroporation oder Mikroinjektion in Zellen eingebracht 8-10 hervorgehoben. Diese Techniken leiden unter schwerwiegende...

<table><tbody><tr><td>Lösungen für die Kalibrierung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose (Dextrose)</td><td>Fischer</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Fischer</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Fischer</td><td>M-1612</td><td></td></tr><tr><td>Deionisiertes Wasser</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Calbiochem</td><td>481990</td><td>Giftig durch Einatmen oder bei Berührung mit der Haut</td></tr><tr><td colspan="4">Vor Licht geschützt bei 4 & Grad; C</td></tr><tr><td>Kulturschalen & leer 35 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>354456</td><td></td></tr><tr><td>pH-Messsonden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäure (HPTS)</td><td>Life technologies</td><td>H-348</td><td>Bei Raumtemperatur von Licht fernhalten</td></tr><tr><td>5-(und-6)-Carboxyy SNARF&reg;-1, Acetoxymethylester, Acetat</td><td>Life Technologies</td><td>C-1271</td><td>Von Licht und Luftfeuchtigkeit bei -20 Grad fernhalten; C</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Fischer</td><td>BP231-1&nbsp;</td><td>schädlich</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Natriumphosphat einbasisch</td><td>Fischer</td><td>S369-1</td><td>115 g</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat einbasisch</td><td>J.T Baker</td><td>3246-01</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Deionisiertes Wasser</td><td>N/A</td><td>N/A Auf</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Autoklav bringen und pH-Wert auf 7,4</td> <td>einstellen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 100X</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td>40,5 g</td></tr><tr><td>Entsalztes Wasser</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Bringen Sie auf 5 L</td></tr><tr><td>pH-Modulatoren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1793</td><td></td></tr><tr><td>5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amilorid (EIPA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3085</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid</td><td>Fischer</td><td>A649-500</td><td></td></tr></tbody></table>

gleichzeitige ph-messung in endozytischen und cytosolic fächer in lebenden zellen mittels konfokaler mikroskopie

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Der intrazelluläre pH-Wert ist streng reguliert und es wurden Unterschiede im pH-Wert zwischen dem Zytoplasma und den Organellen berichtet1. Die Regulierung des zellulären pH-Werts ist entscheidend für die homöostatische Kontrolle physiologischer Prozesse, zu denen gehören: Protein-, DNA- und RNA-Synthese, vesikulärer Transport, Zellwachstum und Zellteilung. Veränderungen der zellulären pH-Homöostase können zu nachteiligen funktionellen Veränderungen führen und das Fortschreiten verschiedener Krankheiten fördern2. Für die Messung des intrazellulären pH-Werts stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, von denen jedoch nur sehr wenige die gleichzeitige Messung des pH-Werts im Zytoplasma und in Organellen ermöglichen. Hier beschreiben wir detailliert eine schnelle und genaue Methode zur gleichzeitigen Messung des zytoplasmatischen und organellären pH-Werts mittels konfokaler Mikroskopie an lebenden Zellen3. Dieses Ziel wird durch die Verwendung von zwei pH-empfindlichen ratiometrischen Farbstoffen erreicht, die eine selektive zelluläre Kompartimentpartitionierung aufweisen. Zum Beispiel ist SNARF-1 im Zytoplasma kompartimentiert, während HPTS in endosomalen/lysosomalen Organellen kompartimentiert ist. Obwohl HPTS häufig als zytoplasmatischer pH-Indikator verwendet wird, kann dieser Farbstoff nach seiner Aufnahme durch die Pinozytose spezifisch Vesikel entlang des endosomal-lysosomalen Weges markieren3,4. Mit diesen pH-empfindlichen Sonden ist es möglich, den pH-Wert innerhalb des endozytären und zytoplasmatischen Kompartiments gleichzeitig zu messen. Die optimale Anregungswellenlänge von HPTS variiert je nach pH-Wert, während sie für SNARF-1 von der optimalen Emissionswellenlänge abhängt. Nach der Beladung mit SNARF-1 und HPTS werden die Zellen in verschiedenen pH-kalibrierten Lösungen kultiviert, um für jede Sonde eine pH-Standardkurve zu erstellen. Die Zellbildgebung durch konfokale Mikroskopie ermöglicht die Eliminierung von Artefakten und Hintergrundgeräuschen. Aufgrund der spektralen Eigenschaften von HPTS ist diese Sonde besser geeignet für die Messung des leicht sauren endosomalen Kompartiments oder zum Nachweis einer Alkalisierung der endosomen/lysosomalen Organellen. Diese Methode vereinfacht die Datenanalyse, verbessert die Genauigkeit von pH-Messungen und kann verwendet werden, um grundlegende Fragen im Zusammenhang mit der pH-Modulation während der Zellreaktion auf externe Herausforderungen zu beantworten.

Für die gleichzeitige Messung von pH-Wert sowohl in der intrazellulären und der endosomalen / lysosomalen Zellkompartimenten wurden die ratiometrische Fluoreszenz-pH-Messfühler SNARF-1 und HPTS verwendet. SNARF-1 ist mit dem Zytosol beschränkt wohin HPTS ermöglicht ratiometrische pH-Messung der endosomalen / lysosomalen Kompartiment. Zellbeladung mit HPTS für 16 Stunden ermöglicht seine selektive Lokalisierung in Endosomen / Lysosomen 4. Ein typisches Beispiel der Fluoreszenz von HT-1080-Zellen mit den pH-Mes...

Es stehen mehrere Methoden zur Messung des intrazellulären pH-Werts zur Verfügung, aber nur sehr wenige davon ermöglichen die gleichzeitige Messung des zytoplasmatischen und organellären pH-Werts. Hier beschreiben wir detailliert eine schnelle und genaue Methode zur gleichzeitigen Messung des zytoplasmatischen und vesikulären pH-Werts durch ratiometrische Bildgebung lebender Zellen.

Gleichzeitige pH-Messung in endozytischen und Cytosolic Fächer in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den vesikulären und zytosolischen pH-Wert in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie gleichzeitig zu messen. Dazu werden die Zellen zunächst mit den pH-Sensoren HPTS und SNF F1 inkubiert, die jeweils die endosomalen und lysosomalen Kompartimente sowie das Zytosol markieren. Anschließend werden die Zellen in einer umweltkontrollierten Kammer unter einem konfokalen Mikroskop platziert, und die Software wird so eingestellt, dass sie die Fluoreszenz der Sonden in der Kammer misst.Die Zellen werden mit verschiedenen pH-kalibrierten Lösungen inkubiert. Mithilfe einer nichtlinearen Regression wird eine pH-Standardkurve erstellt. Exponentielle Gleichungen werden für beide Sonden bestimmt und anschließend verwendet, um die Fluoreszenzintensitäten der Proben in pH-Werte umzuwandeln.Diese Methode ermöglicht die Bestimmung des vesikulären und zytosolischen pH-Werts aus Proben nach verschiedenen Behandlungen und erlaubt die Untersuchung der Regulation des intrazellulären pH-Werts während biologischer Prozesse. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Messung des intrazellulären pH-Werts besteht darin, dass unsere Methode die Erfassung der Dynamik des intrazellulären pH-Werts in lebenden Zellen ermöglicht, während Artefakte und Hintergrundrauschen während der Bildgebung eliminiert werden. Bei der Demonstration des Verfahrens wird Fess Lucier, der Doktorand, der diese Methode entwickelt hat, behilflich sein. Für die zelluläre pH-Kalibrierung ist es notwendig, eine Reihe von fünf 50-Milliliter-Lösungen im pH-Bereich von 5,5 bis 7,5 in 0,5er-Schritten herzustellen.Geben Sie zur Einstellung der pH-Werte tropfenweise eine normale Kaliumhydroxid- oder Salzsäurelösung hinzu. Geben Sie dann jeder pH-kalibrierten Lösung 0,05 Milliliter des IOR-Gersins bei 10 Millimolar zu, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolar Risin zu erreichen, wodurch die Zellmembranpermeabilität in Gegenwart depolarisierender Konzentrationen von extrazellulärem Kalium erhöht wird. Säen Sie Zellen unter einem Abzug in 35-Millimeter-Kulturschalen mit zwei Millilitern Medium, das 10 % fetalen Rinderserum und Antibiotika enthält, mit dem Ziel, nach 24-stündiger Inkubation bei 37 Grad Celsius eine Konfluenz von 50 % zu erreichen.Nachdem alle erforderlichen Platten für das Experiment beimpft wurden, zusätzliche fünf Platten zur Kalibrierung beimpfen. Diese Platten 24 Stunden, 24 Stunden später und 16 Stunden vor der Bildaufnahme inkubieren. Am nächsten Morgen etwa drei Stunden lang zwei Mikroliter der Organellenmarkierung HPTS bei einer Konzentration von einem Molar hinzufügen, um eine Endkonzentration von einem Millimolar HPTS in der Lösung zu erreichen.Vor der Bildgebung. Entfernen Sie HPTS durch zwei Waschungen mit PBS. Geben Sie anschließend zwei Milliliter serumfreies Medium hinzu und lassen Sie die Zellen mindestens zwei weitere Stunden inkubieren.Kurz vor der Bildgebung inkubieren Sie die Zellen mit fünf Mikromolar SNF1, indem Sie 10 Mikroliter einer einmillimolaren SNF1-Lösung hinzufügen, und zwar nach der SNF1-Inkubationszeit. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und geben Sie zwei Milliliter serumfreies Medium hinzu, anschließend fortfahren mit der Bildgebung. Die Zellen.Die Bildgebung der Zellen sollte mit einem spektralen invertierten Scanning-Konfokalmikroskop durchgeführt werden, das mit einem motorisierten Objekttisch und einer Umweltkammer ausgestattet ist. Bei Verwendung von Kunststoff-Petri-Schalen ist ein 40x-Objektiv am geeignetsten. Die Software sollte für zwei virtuelle Kanalsätze in der Software eingestellt werden; justieren Sie die Anregewellenlänge und die Emissionswellenlängen.Für HPTS und SNF eins ist die konfokale Blende standardmäßig auf 175 Mikrometer eingestellt, und die optimale Blende muss manuell auf 300 Mikrometer eingestellt werden. Sobald die Kammer auf 37 Grad Celsius erwärmt ist, starten Sie die Kalibrierung, waschen Sie eine Zellkulturplatte zwei weitere Male mit PBS und ersetzen Sie anschließend das Medium durch die erste Kalibrierungslösung. Platzieren Sie nun die Zellen in die Kammer und kalibrieren Sie beide pH-empfindlichen Farbstoffe, indem Sie bis zu 30 Zeitrafferaufnahmen in einminütigen Abständen aufnehmen.Jeder Bildstapel kann mit einer Dicke von 0,4 Mikrometern und 800 quadratischen Pixeln aufgenommen werden. Zwischen den Bildern muss der Verschluss so programmiert werden, dass er geschlossen bleibt. Notieren Sie die Fluoreszenzintensität jede Minute, die typischerweise nach etwa 20 Minuten stabil wird.Sobald die Fluoreszenz stabil ist, nehmen Sie Bilder von vier oder fünf Feldern auf, die 15 bis 20 Zellen und beide Sonden enthalten. Diese Bilder werden für die Kurvenberechnungen verwendet. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Kalibrierlösung.Danach fortfahren mit der Bildaufnahme der Platten unter experimentellen Bedingungen, für die keine Waschungen erforderlich sind. Bei der Analyse jedes Bildes zunächst die Hintergrundfluoreszenz der extrazellulären Umgebung digital subtrahieren. Anschließend markierte Vesikel und Zytoplasma aus gespeicherten Bildern mithilfe einer binären Maske auswählen. Für jede pH-Sonde werden die Fluoreszenzintensitäten auf einer Skala von null bis 4.095 gemessen.Berechnen Sie die mittlere Intensität für alle Pixel im Organell oder im Zytoplasma. Berechnen Sie anhand dieser Werte die Fluoreszenzverhältnisse für HPTS und für snf. Erstellen Sie eine Kalibrierungskurve, indem Sie die für jede Kalibrierungslösung erhaltenen Fluoreszenzverhältnisse in Abhängigkeit vom pH auftragen. Die Anpassung der Kalibrierungskurve sollte mithilfe einer exponentiellen Gleichung erfolgen.Zuletzt verwenden Sie die Kalibrierungskurven, um die Verhältnisse in pH-Werte umzuwandeln, und erhalten so die pH-Werte im Cytosol und in den Organellen lebender Zellen unter experimentellen Bedingungen. Es wurde eindeutiger Nachweis erbracht, dass HPTS sowohl endosomale als auch lysosomale Kompartimente markiert, durch Kofärbung mit Alexa 5 46-konjugiertem Transferrin zur Färbung von Endosomen oder mit einer fluoreszierenden lytrophilen Sonde, Lyo tracker.Tiefrote Zeitrafferaufnahmen wurden für jede Sonde wie bei HT 10 80 Zellen beschrieben aufgenommen. Die Fluoreszenzstabilität wurde in fünf Kalibrierlösungen nach 15 Minuten getestet, beispielsweise mit pH 6 und pH 7,5. In der Kalibrierkurve für einen gegebenen pH-Wert repräsentiert die Daten das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten bei 558 zu 405 Nanometern für HPTS bzw. bei 644 zu 584 Nanometern für SNF1. Beide Kurven wurden mit einer exponentiellen Gleichung angepasst.Die Effizienz der Methode in lebenden HT 10 80-Zellen wurde unter Verwendung von Ammoniumchlorid, einer schwachen Base, die den intrazellulären pH-Wert erhöht, überprüft. Die Base erhöhte den pH-Wert sowohl des Cytosols als auch der Vesikel. Die Methode wurde außerdem mit B mycin, A one, einem Inhibitor von va a TPAs bamy, A one, evaluiert, der eine Alkalinisierung sowohl endosomaler als auch lysosomaler Kompartimente hervorrief, jedoch den cytosolischen pH-Wert nicht veränderte.Zuletzt wurde EIPA, ein Inhibitor von NHE1, getestet. Es acidifizierte das Cytosol bis auf einen pH-Wert von 6,62, beeinflusste den pH-Wert jedoch nicht weiter. Bislang.Die Untersuchung der zellulären pH-Homöostase war bisher sowohl durch schnelle pH-Änderungen innerhalb der Zellen als auch durch einen Mangel an Werkzeugen zur Untersuchung des pH-Werts in Zellen eingeschränkt. Wir beschreiben hier eine einfache, schrittweise Methode, um simultan den pH-Wert im Zytosol und in Endosomen einzelner lebender Zellen zu messen. Dies ist besonders wichtig für die Untersuchung der zellulären pH-Homöostase in Zellen, in denen Mutationen oder Wirkstoffe den Ein- und Ausstrom von Protonen in den endosomalen Kompartimenten beeinflussen können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das Video zeigt die gleichzeitige Messung des intrazellulären Kalziumspiegels und der Veränderungen des Membranpotentials in Endothelzellen von Hirnarteriensegmenten von Mäusen. Die isolierte Endothelröhre wird mit einem fluoreszierenden Kalziumindikator beladen und mit einem Medikament behandelt, das die intrazelluläre Kalziumfreisetzung induziert, was zu einer Änderung des Membranpotentials führt. Die Fluoreszenz des Indikators ermöglicht die Messung des Kalziumspiegels, und eine...

Gleichzeitige Messung des intrazellulären Calcium- und Membranpotentials in einem zerebralen Endothel der Maus

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Der phagosomale pH-Wert beeinflusst die Phagosomenreifung, die Produktion von Oxidationsmitteln, die phagosomale Abtötung sowie die Antigenpräsentation. In dieser Arbeit beschreiben wir eine ratiometrische Methode zur Messung von Zeitverlaufs- und Endpunkt-pH-Veränderungen in einzelnen Phagosomen in lebenden Fresszellen mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Diese Handschrift beschreibt eine einfache Methode, um die phagosomalen und pH-Bereich sowie die cytoplasmatische pH von menschlichen und Maus-Neutrophilen unter Verwendung des ratiometrischen Indikatoren seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, oder S-1 zu messen. Dies wird in lebenden Zellen konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse erreicht werden.

Abbilden der Neutrophilen Phagosomen und Zytoplasma Mit einem Ratiometrisch pH-Indikator

Mitochondria kann das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (Δ &amp; psi; m) verwenden , Calcium (Ca 2+) zu maskieren, so dass sie cytosolischen Ca 2+ zu formen innerhalb der Zelle signalisiert. Wir beschreiben ein Verfahren zum gleichzeitigen Messen Mitochondrien Ca 2+ -Aufnahme und ΔΨ m in lebenden Zellen Fluoreszenzfarbstoffe und konfokale Mikroskopie.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Kennzeichnung für die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins mit einem pH-empfindlichen Fluorophors, superecliptic pHluorin (SEP), erlaubt die subzelluläre Lokalisierung, Ausdruck und Handel bestimmt werden. Imaging September-markierten Proteinen mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ermöglicht die Quantifizierung von Proteinspiegel im peripheren ER und Plasmamembran.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren für die quantitative Darstellung der Komplexbildung des SNARE-Proteine, basierend auf Förster Resonance Energietransfer und Fluoreszenz Lifetime imaging-Mikroskopie ermöglicht.

Visualisierung von intrazellulären SNARE Menschenhandel durch Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

Hier demonstriert werden Protokolle zur intakten zerebralen Endothelzellen "Röhren" und (2) die gleichzeitige Messung von endothelialen Kalzium und Membranpotential im Endothel-derived Hyperpolarisation (1) frisch zu isolieren. Des weiteren können diese Methoden für die pharmakologische Optimierung von Endothelzellen Kalzium und elektrische Signalisierung als Einzel- oder interaktive experimentellen Variablen.

Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Hier wird das Protokoll der Conpokal-Technik vorgestellt, das konfokale und atomare Kraftmikroskopie zu einer einzigen Instrumentenplattform vereint. Conpokal bietet die gleiche Zelle, die gleiche Region, fast gleichzeitige konfokale Bildgebung und mechanische Charakterisierung von lebenden biologischen Proben.

Nahezu simultanes Laserscanning Konfokal- und Atomkraftmikroskopie (Conpokal) auf lebenden Zellen

Dieses Protokoll beschreibt ein konfokales Bildgebungsverfahren zum Nachweis von drei Fusionsmodi in rindischen Nebennierenchromaffinzellen. Diese Fusionsmodi umfassen 1) Close-Fusion (auch Kiss-and-Run genannt), bei der sich die Fusionspore öffnet und schließt, 2) Stay-Fusion, bei der die Fusionspore geöffnet und die geöffnete Pore erhalten bleibt, und 3) Shrink-Fusion, einschließlich der Schrumpfung der fusionierten Vesikel.

Konfokale Mikroskopie zur Messung von drei Modi der Fusionsporendynamik in Nebennierenchromaffinzellen

Das Protokoll beschreibt eine fortschrittliche mikrofluidische Plattform zur quantitativen Messung der Zytokinsekretionsdynamik einzelner mononukleärer Zellen des menschlichen peripheren Blutes. Die Plattform misst bis zu drei Zytokine parallel (IL-6, TNFα und IL-1β) für jede einzelne Zelle, die beispielsweise mit Lipopolysaccharid stimuliert wird.

Mikrofluidischer Ansatz zur Auflösung der gleichzeitigen und sequentiellen Zytokinsekretion einzelner polyfunktioneller Zellen 

Erfahren Sie die simultane pH-Messung in endosomalen und zytosolischen Kompartimenten lebender Zellen mittels konfokaler Mikroskopie. Diese Methode nutzt HPTS- und SNF-F1-Sonden für präzise intrazelluläre pH-Dynamik-Analysen.

Gleichzeitige pH-Messung in endozytischen und Cytosolic Fächer in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie

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