Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina
13. Oktober 2014
Immunhistochemie Protokolle werden verwendet, um die Lokalisierung eines bestimmten Proteins in der Netzhaut zu untersuchen. Calcium-Imaging-Techniken verwendet werden, um Calciumdynamik in retinalen Ganglienzellen und ihre Axone zu studieren.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die selektive Markierung von retinalen Ganglienzellen in der gesamten Präparation der Halterung durch eine Injektion eines Kalziumindikatorfarbstoffs durch einen Sehnervenstumpf. Dies wird erreicht, indem zuerst ein sehr hochaffiner Kalziumindikatorfarbstoff, wie z. B. Flow vier, in den Sehnervenstumpf injiziert wird. Als nächstes wird die Netzhaut von der Augenmuschel isoliert und in Quadranten unterteilt, um sie auf einen Objektträger zu montieren. In einer Aufnahmekammer, die so eingerichtet ist, dass sie physiologische Bedingungen nachahmt, werden die Beiträge von spannungsgesteuerten Kalziumkanälen zum Kalziumsignal nachgeahmt.
In retinalen Ganglien können Zellen in depolarisierten Zellen mit Hilfe von Kanalblockern gemessen werden. Letztendlich können die Ergebnisse semiquantitative Messungen des Beitrags der spannungsgebildeten Kalziumkanäle zu einem Signal wie einem kalumevozierten Kalziumsignal mit hohem Kaliumgehalt liefern. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. Elektroporation und Bulk-Loading, besteht in der Möglichkeit, retinale Ganglienzellen und ihre Axone selektiv in einer ganzen Präparation zu speichern, zu präparieren und ein Aims Medium oder eine ähnliche Lösung zu überwintern.
Wenn Sie nun beabsichtigen, Kalzium-Bildgebungsexperimente durchzuführen, füllen Sie die retinalen Ganglienzellen mit Fluss vier auf. Injizieren Sie 0,5 Mikroliter 40 Millimolar fließendes Vier-Penta-Kaliumsalz, das in Wasser rekonstituiert ist, in den Sehnerv, der etwa einen Millimeter hinter dem Augapfel stumpft. Übertragen Sie den Augapfel auf Säugetier-Ringer.
Mit 95 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid oder einer Stunde bei Raumtemperatur gefüllt. Bewahren Sie die Zubereitung im Dunkeln auf. Sezieren Sie die Augen unter einem Mikroskop mit kontrollierter Lichtintensität.
Machen Sie mit einer Rasierklinge vorsichtig einen kleinen Schnitt an der Vorderseite des Augapfels und entfernen Sie die Hornhaut. Entfernen Sie dann die Linse mit einer Pinzette von der inneren Netzhautoberfläche. Halten Sie die Sklera fest.
Wenn Sie den Glaskörper mit den anderen Pinzetten entfernen, schälen Sie die Glaskörperbasis vorsichtig in Richtung der Netzhautmitte. Die resultierende Vorbereitung, die als I-Becher bezeichnet wird, kann für die immunhistochemische Ganzbettpräparation, die Kalziumbildgebungsvorbereitung oder für Querschnitte der Netzhaut zur Herstellung einer immunhistochemischen Ganzbettpräparation verarbeitet werden. Machen Sie zuerst vier Schnitte an der Netzhaut, damit sie flach liegt.
Legen Sie die Netzhaut mit der Ganglienzellschicht nach unten auf den Glasdeckel. Zweitens, geben Sie einen Tropfen Lösung auf die Netzhaut und bedecken Sie sie bei Bedarf mit Zellulosefilterpapier, glätten Sie die Netzhaut mit einem Pinsel oder einer Pinzette. Drittens, wenn die Netzhaut völlig flach ist und sich vom Filterpapier löst, legen Sie sie wieder in die Lösung.
Um das Präparat zuerst zu verarbeiten, geben Sie es für 10 bis 15 Minuten in 4%Paraformaldehyd. Waschen Sie dann die Netzhaut dreimal in 0,1 molaren Phosphatpuffer bei pH 7,4 für 30 Minuten pro Waschgang für insgesamt 90 Minuten. Als nächstes inkubieren Sie die Netzhäute über Nacht bei vier Grad Celsius in 500 Mikrolitern Blockierungslösung.
Diese Lösung besteht aus 5%normalem Ziegenserum oder Eselserum in Phosphatpuffer mit 0,3% Tritton und 0,1% Natriumazid über die nächsten fünf bis sieben Tage, inkubieren Sie die Netzhäute in der primären Antikörperlösung bei vier Grad Celsius. Die Zusammensetzung dieser Lösung muss empirisch ermittelt werden. Waschen Sie die primäre Antikörperlösung genauso ab, wie das Fixiermittel abgewaschen wurde.
Dann inkubieren Sie die Netzhäute in Sekundärantikörpern in einer Konzentration von eins bis 1000 über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Sekundärantikörper mit drei weiteren Waschungen und Phosphatpuffer. Montieren Sie dann die Netzhäute zur Visualisierung und versiegeln Sie sie mit Nagellack.
Diese Dias müssen im Dunkeln bei vier Grad Celsius gelagert werden. Beginnen Sie mit der Herstellung einer Calcium-Imaging-Vorbereitung für die gesamte Montierung aus dem I-Becher in Ringern. Schneiden Sie zunächst das Netzhautgewebe in Quadranten.
Platzieren Sie einen Quadranten flach auf der Aufzeichnungskammer, wobei die Ganglienschicht nach oben und damit die Photorezeptorschicht nach unten zeigt. Trocknen Sie die Umgebung vorsichtig mit einem Kim-Tuch ab und legen Sie die gefettete Harfe vorsichtig auf das Taschentuch. Laden Sie nun die Netzhautpräparation auf das Rig und beenden Sie die Einrichtung des Achtkanal-Schwerkraft-Superfusionssystems.
Wenn sich die montierte Netzhaut nach dem Einsetzen der Harfe bewegt, entfernen und reinigen Sie die Harfe vorsichtig. Trocknen Sie den Bereich um die Netzhaut herum und montieren Sie die Harfe super. Schmelzen Sie die Aufnahmekammer mit Säugetier-Ringer-Lösung und lassen Sie die Lösung kontinuierlich mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid sprudeln.
Führen Sie zunächst als Kontrolle ohne Medikamente 33 Sekunden lang zwei paarweise Impulse mit hohem Kaliumgehalt von drei Millimolar bis 60 Millimolar durch. Depolarisierend sollte der RGC die spannungsgesteuerten Kalziumkanäle aktivieren, wenn das Präparat funktioniert. Fahren Sie nun mit den Experimenten fort.
Nifedipin und spannungsabhängige Kalziumkanalblocker vom L-Typ werden häufig verwendet, um den Beitrag von spannungsgesteuerten Kalziumkanälen vom L-Typ zu dem durch Depolarisation evozierten Kalziumsignal Kobalt zu bewerten. Ein unspezifischer Kalziumkanalblocker kann verwendet werden, um spannungsgesteuerte Kalziumkanäle nicht selektiv zu blockieren. Scannen Sie die Vorbereitung alle fünf Sekunden, um den fluoreszierenden rgc zu visualisieren und Bilder davon aufzunehmen.
Verwenden Sie eine möglichst geringe Laserleistung. Die Anregung sollte auf 488 Nanometer eingestellt werden und die Emission sollte mit einem 505-Nanometer-LP-Filter gesammelt werden. Unter Verwendung der beschriebenen Protokolle wurde eine Immunmarkierung gegen das Ganglienzellprotein R-B-P-M-S durchgeführt, bei dem es sich um ein RNA-bindendes Protein mit multiplem Spleißfluss handelt. Vier.
Die Färbung war in der Tat auf Ganglienzellen beschränkt, basierend auf der Antikörperspezifikation. Als nächstes wurde der Beitrag der spannungsgesteuerten Kalziumkanäle zum Kalziumsignal in den R-GCs unter Verwendung der vom rgc erfassten Fluoreszenzintensitätswerte untersucht. Auf der Basisebene sind RGC- und RGC-Axone mit Fluss vier gekennzeichnet.
Um die Fluoreszenzintensitätswerte zu erfassen, wurden ROIs auf die Ganglienzelle, die Somata und/oder die Axone gelegt. Nach dem Auftragen von hohem Kaliumgehalt auf die gesamte Montierungspräparation stieg das Fluoreszenzsignal des RG C'S an. Es folgte eine anschließende Absenkung der Fluoreszenzintensitätswerte in Gegenwart von Kobalt während des zweiten hohen Kaliumpulses.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man retinale Ganglienzellen selektiv mit einem synthetischen Kalziumindikator in einer ganzen Präparation belastet
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur selektiven Markierung retinaler Ganglienzellen mithilfe eines Calciumindikator-Farbstoffs durch Injektion in den Stumpf des Sehnervs. Die Technik ermöglicht die Untersuchung der Calciumdynamik in diesen Zellen und ihren Axonen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Immunhistochemie
Hintergrund
- Die Kalzium-Bildgebung ist entscheidend für das Verständnis zellulärer Dynamik.
- Retinale Ganglienzellen spielen eine Schlüsselrolle bei der visuellen Verarbeitung.
- Bestehende Methoden zur Zellmarkierung weisen Einschränkungen auf.
- Diese Technik bietet einen selektiveren Ansatz.
Zweck der Studie
- Markierung der Ganglienzellen der Retina in Ganzpräparaten.
- Messung der Kalziumdynamik in diesen Zellen.
- Beurteilung des Beitrags spannungsabhängiger Kalziumkanäle.
Verwendete Methoden
- Injektion eines Calciumindikatorfarbstoffs mit hoher Affinität in den Sehnervstumpf.
- Isolierung und viertelungsweise Aufteilung der Netzhaut zum Aufbau.
- Verwendung von Kanalblockern zur Beurteilung von Calciumsignalen in depolarisierten Zellen.
- Aufzeichnung in einer Kammer, die physiologische Bedingungen nachahmt.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Markierung der Ganglienzellen der Retina und ihrer Axone.
- Messung von Kalziumsignalen als Reaktion auf Depolarisation.
- Quantitative Bewertung des Beitrags spannungsabhängiger Kalziumkanäle.
- Aufzeigen der Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden.
Schlussfolgerungen
- Die Technik bietet eine zuverlässige Methode zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen.
- Sie vertieft das Verständnis der Kalziumdynamik in diesen Neuronen.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methode aufbauen, um weitere Erkenntnisse zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die selektive Markierung von retinalen Ganglienzellen in Ganzpräparaten und löst damit eine zentrale Herausforderung bei der Zielvalidierung in der Neurowissenschaft, bei der unspezifische Markierungen die mechanistische Interpretation erschweren. Durch die Isolierung der Beiträge des Kalziumsignals von spannungsabhängigen Kalziumkanälen unterstützt der Ansatz eine vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der Entschärfung von Signalwegen für die Entdeckung neurotherapeutischer Wirkstoffe. Die Technik bietet ein krankheitsrelevantes System zur Bewertung der Zielinteraktion und funktioneller Messgrößen in Modellen retinaler Ganglienzellen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch gezielte Markierung von retinalen Ganglienzellen zur Isolierung zielgerichteter Kalziumsignale.
- Operativer Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem eine unspezifische Beladung verlagerte amacriner Zellen in der Ganglienzellschicht umgangen wird.
- Prädiktiver Wert: Stützt das Vertrauen in das Zielmolekül durch semi-quantitative Messung des Beitrags spannungsabhängiger Kalziumkanäle zu depolarisationsinduzierten Signalen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem retinale Ganglienzellen und ihre Axone in einer Ganzpräparat-Präparation isoliert werden.
- Quantitative Ausgabe: Ermöglicht die Messung der Fluoreszenzintensität in definierten Regionen von Ganglienzellkörpern und Axonen für die Wirkstoff-Screening.
- Reproduzierbarkeit: Standardisiert die Präparation durch viertelweise Aufteilung und Einbettung auf Objektträgern unter physiologisch nachgeahmten Bedingungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Bietet ein Modell der retinalen Ganglienzelle, das mit den visuellen Verarbeitungswegen für die translationale Biomarkerforschung übereinstimmt.
- Präklinische Kontinuität: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung durch Messung der Kalziumdynamik als Reaktion auf Depolarisation durch hohes Kalium und Anwendung von Kanalblockern.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Klärt die Rolle von L-Typ- und unspezifischen spannungsabhängigen Kalziumkanälen bei der Kalziumsignalgebung unter Verwendung von Nifedipin und Kobalt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur präklinischen Evaluierung, indem sie selektive zelluläre Markierungen und funktionelle Kalzium-Signale erzeugt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen mittels Injektion eines hochaffinen Kalziumindikatorfarbstoffs in den Sehnervenstumpf.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays und quantitative Fluoreszenzmessungen durch kontrollierte Depolarisation und Bildgebung in einer Ableitkammer.
- Analytik: Ermöglicht den Vergleich von Bedingungen anhand von Fluoreszenzintensitätswerten, die vor und nach der Applikation von Kanalblockern erhoben wurden.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität durch die Modellierung von systemrelevanten, krankheitsbezogenen Funktionen retinaler Ganglienzellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Methode zur Untersuchung der Kalziumdynamik in neuronalen Präparationen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Unschärfen in Studien zur Kalziumsignalisierung.
- Operativer Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Ganzpräparaten der Retina.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen, Kapital-Effizienz und geringeres biologisches Risiko in fortgeschrittenen Phasen von Neurotarget-Programmen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Fortschrittsentscheidungen basierend auf quantitativen Bewertungen der Kalziumsignalisierung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Expertise in Mikrochirurgie für die Injektion in den Sehnervstumpf und die Netzhautdissektion.
- Ist abhängig von einer Infrastruktur für Fluoreszenzmikroskopie mit 488 nm Anregung und 505 nm LP Emissionsfilterung.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Lösungsherstellung, einschließlich mammalem Ringer und Blockiermitteln.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen über verschiedene Modellsysteme hinweg aufgrund artenspezifischer Netzhautanatomie und unterschiedlicher Effizienz der Farbstoffaufnahme.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Variabilität der Farbstoffaufnahme und die Notwendigkeit, die Proben im Dunkeln bei 4 °C zu lagern, um die Signalintegrität zu bewahren.
