Name: Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Lernen Sie die selektive Markierung retinaler Ganglienzellen in der Rattenretina durch Calcium-Indicator-Injektion in den Sehnervenstumpf. Diese Methode ermöglicht präzise Calcium-Imaging und Untersuchung spannungsabhängiger Calciumkanäle.

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Wir danken Dr. S. Stella und Helen Vuong für Beiträge zur Kalzium-Imaging-Protokoll. Wir danken Herrn Dr. K. Blätter für Dreharbeiten für den Interview-Szenen. Wir danken Dr. Arlene Hirano für ihre Kommentare zum Manuskript. Diese Forschung und Entwicklungsprojekt wurde von den Autoren an der David Geffen School of Medicine an der UCLA durchgeführt und wird von einer vertraglichen Vereinbarung, die von der US Army Medical Research &amp; Materiel Command (USAMRMC) vergeben und verwaltet wurde möglich gemacht und die Telemedizin &amp; Advanced Technology Forschungszentrum (TATRC) in Fort Detrick, unter Vertragsnummer MD: W81XWH-10-2-0077. Unterstützung für diese Studien kam auch von NIH EY04067 und VA Merit Review (NB). NZB ist ein VA Karriere Research Scientist.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für das Wohlergehen der von der US Public Health Service Politik Menschen Pflege und Verwendung von Labortieren und der University of California-Los Angeles (UCLA) Tierforschung Committee Versuchstieren durchgeführt. Männliche und weibliche erwachsene Sprague-Dawley-Ratten (Charles River Lab, Wilmington, MA) im Alter von 3-5 Wochen wurden verwendet. 1. Tier-und Gewebepräparation für Wholemount Retina und Immunhistochemie Protokoll <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Materialien und Werkzeuge: einem Binokular, 2 Pinzetten mit sehr feinen Spitzen, Schere, Zellulosefilterpapier, Kunststoffpipette und einem Objektträger. </li><li> Euthanize die Ratte in einer geschlossenen Kammer von tief Betäubung des Tieres mit 1-3% Isofluran gefolgt durch Enthauptung mit einer Guillotine. Die Augen mit einem Paar von Iris Schere und in eine Petrischale mit der extrazellulären Lösung zu entfernen. Hibernate A, Ames Medium oder physiologischen Lösungen empfohlen. </li><li> [Optional Schritt, wenn Verfüllung der RGZ mit Fluo-4 ist erwünscht]. Führen Sie die Fluo-4 Kennzeichnung wie in den Schritten 2.3-2.4 beschrieben. </li><li> Verwendung des Binokular (Lichtstärke: 1,6 x 10 8 Photonen / mm 2 ⋅sec), entfernen Sie die Hornhaut durch das Abschneiden der vor dem Auge Ball. Entfernen Sie die Linse und Glas von der inneren Netzhautoberfläche mit einer Pinzette. So entfernen Sie den Glaskörper, stabilisieren den Augapfel, indem die Lederhaut fest mit einer Zange. Ziehen Sie leicht dem Glaskörperbasis in Richtung der Mitte der Netzhaut, mit der anderen Zange. Die Zubereitung wird in diesem Stadium wird als Augenmuschel, die für Gefrierschnitte verwendet. Mehr Details über Gefrierschnitte können in den Referenzen 14,15 gefunden werden. </li><li> Entfernen Sie die Netzhaut von der Augenmuschel. Dann stellen vier Schnitte, damit der Netzhaut flach zu legen. Halterung sanft auf die Netzhaut auf einem Objektträger mit der Photorezeptorschicht auf. Geben Sie einen Tropfen der Lösung auf die Netzhaut und legte cellulose Filterpapier auf der Netzhaut. Sobald die Netzhaut wird an der Filterpapier, legen die Netzhaut wieder in Lösung. Wenn nötig, glätten die Netzhaut mit einem Pinsel oder einer Pinzette. </li><li> Legen Sie die Netzhäute wholemounted in 4% PFA für 10-15 min zur Fixierung. </li><li> Dreimal Waschen der wholemounted Netzhaut für 30 min in 0,1 M Phosphatpuffer (PB), pH 7,4. Sperrung der Netzhaut mit 5% normalem Ziegenserum oder Esel Serum in 0,1 PB, enthaltend 0,3% Triton X-100 und 0,1% NaN 3 bei 4 ° C über Nacht. Wir empfehlen ein Gesamtvolumen von 500 ul für alle Schritte zur Blockierung Lösungen und Antikörper zu speichern. </li><li> Am nächsten Tag, bebrüten die Netzhaut wholemounts mit dem primären Antikörper 5-7 Tage bei 4 ° C. Optimale Verdünnungen muss vom Anwender bestimmt werden. </li><li> Waschen der Netzhaut 3 x 30 min in 0,1 M PB und Inkubation über Nacht bei 4 ° C in das entsprechende Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper, der gegen die Spezies des primären Antikörpers (Konzentration 1: 1000) gerichtet ist. </li><li> Nach drei abschließenden Waschanlagen von 30 min mit je PB, montieren die Netzhaut in Montagemedium. Verschließen Sie die Deckgläser mit Nagellack für eine längere Lagerung. Proben bei 4 ° C und vor Licht schützen. </li></ol> 2. Kennzeichnung der Ganglienzellen und Axone in Rat Wholemount Netzhäute mit einem Calcium-Indikator-Farbstoff <ol><li> Bereiten 1000 ml Ringer-Säuger (in mM) 125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3 enthält, und 10 Glucose mit 95% O 2/5% CO geperlt &#173; 2. </li><li> Führen Sie die Präparation wie in den Schritten 1.2-1.4 beschrieben. </li><li> Um retinalen Ganglienzellen (RGC) und ihre Axone mit einem Calcium-Indikator-Farbstoff in den Sehnerv Stumpf laden, injizieren 0,5 ul Fluo-4 Pentapotassium Salz (40 mM Stamm in H 2 O) ca. 1 mm hinter dem Augapfel mit einer Spritze . Zur Messung dynamischer Anstieg der Ganglienzelle [Ca2 + </sup&gt;] i eine Anzeige mit hoher Affinität, wie Fluo-4 mit K d von 345 nM, ist optimal. Fluo-4 bietet den zusätzlichen Vorteil, dass eine sehr hohe Quantenausbeute, was zu einer Emissionserhöhung von&gt; 100-fach, wenn Calcium gebunden. </li><li> Legen Sie die Augenmuschel in Säuger Ringer-mit 95% O sprudelte 5.2% CO &#173; 2 für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li></ol> 3. Calcium Imaging Protokoll zur retinalen Ganglienzellen und Axonen. <ol><li> Entfernen Sie das Auge, Linse und Glaskörper wie in den Schritten 1.1-1.4 beschrieben. Isolieren Sie die Netzhaut von der Augenmuschel und teilen sich in Quadranten. Hängen Sie eine Quadranten Ganglienzellseite nach oben auf einem Glasobjektträger und verwenden Sie eine Harfe Scheibe Raster, um es zu stabilisieren. Halten Sie die anderen Stücke dunkeladaptierten in Säuger Ringer-mit 95% O sprudelte 5.2% CO &#173; 2 auf Eis für die spätere Verwendung. </li><li> Superfuse die Aufzeichnungskammer, die mit Säuger-Ringer-Lösung undhalten Sie die Lösung kontinuierlich sprudelnde mit 95% O 2/5% CO 2. </li><li> Bild das Gewebe unter dem Mikroskop. Verhaltensexperimente bei Raumtemperatur (~ 23 ° C) zu erreichen oder physiologischen Temperaturen durch Erwärmen der Stufe Erhitzen des Wasserbades unter der Probe oder der Anwendung warmer Luft auf die Oberfläche der Probe. Hinweis: Es ist wichtig zu beachten, dass viele Zellfunktionen werden durch Temperatur, die eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase intrazellulären 16 spielt geregelt. Jedoch können Einführung Erwärmung misst die Rate des Photobleichen, Verdampfung des Mediums und Fokusdrift durch thermische Ausdehnung verursachte 17 zu erhöhen. Verwendung von Raumtemperatur sinkt intrazellulären Kompartimentierung Fluo-4 18. </li><li> Durchführen einer Steuerung von zwei gepaarten hohen K +-Impulse in der Abwesenheit von Arzneimittel. Depolarisieren RGZ und RGC Axone durch die Erhöhung der [K +] o von 3 mm bis 60 mm für 33 sec bei jedem Impuls zu aktivierenVGCCs mit einem Acht-Kanal-Schwerkraft Superfusionssystem. Reduzieren Na + von 57 mM bis isosmolarity in der erhöhten K +-Lösung zu erhalten. </li><li> Den Beitrag der verschiedenen VGCCs auf die Kalzium-Signal mit der Verwendung von allgemeinen oder spezifischen Ca-Kanal-Blocker. Zum Beispiel kann die Verringerung der Calcium-Signal nach der Verabreichung einer nicht-spezifische Calciumkanal-Blocker, Kobalt, ein semi-quantitatives Maß für den Beitrag der VGCCs der hohen K + -evoked Calciumsignals. </li><li> Erwerben Fluoreszenzintensität Werte, indem Sie eine Region of Interest (ROI) um die RGZ von Interesse (Abbildung 2). </li><li> Normalisieren der Änderung der durch den zweiten Hoch K + Peak, der durch den ersten Hoch K + Peak erzeugt Änderung erzeugten Fluoreszenzintensität. Dann zum Testen spezifischer Calcium-Kanal-Blocker, gelten Medikamente nur während der zweiten Hoch K + Impuls eines Paares und normalisieren diese Spitze gegender erste Spitzenwert. So messen Sie die Auswirkungen der Droge auf der hohen K + Peak, teilen Sie die Amplitude der zweiten K + Peak durch die des ersten. Analyse sollte dieser Werte in Bezug auf ihre Übereinstimmungen Steuerungen von gepaarten hohen K + Peaks in Abwesenheit des Arzneimittels gemessen abgeleitet geführt werden. </li><li> Erwerben Sie Bilder mit 5 Sekunden-Intervallen. Auf Foto-Bleich zu vermeiden, halten Sie die Laseranregung so gering wie möglich. Bereitzustellen Anregung durch den 488 nm-Linie des Argon-Lasers, während der Photovervielfacherröhre sammelt die Fluoreszenzemission durch einen 505 nm-LP-Filter. </li></ol>

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Die Autoren haben keine Angaben.

1) Immunhistochemie auf Fluo-4-Lokalisierung in den Ganglienzellen in der Netzhautwholemounts zeigen, und 2) Calcium Imaging, Kalzium Dynamik in retinalen Ganglienzellen und ihre Axone zu analysieren: In diesem Artikel haben wir zwei verschiedene Techniken beschrieben. Immunhistochemie unter Verwendung wholemounts wurde verwendet, um die Lokalisierung von Proteinen in den Nager Retina 20-23 offenbaren. Es gibt jedoch einige Einschränkungen. Die Qualität der Färbung hängt stark von...

Retinalen Ganglienzellen (RGCs) exprimieren L, N, P / Q-und T-Typ VGCC wie durch pharmakologische Blockade dieser Komponenten der gesamten Zelle bestimmt Ca-Kanalstrom 1,2. VGCC sind Trans multimeren Proteine, die in Transmitterfreisetzung, Gen-Transkription, Zellregulation und der synaptischen Plastizität 3,4,5 beteiligt sind. Groß, Trans α 1 porenbildenden Untereinheiten, die biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften des Kanals, in erster Linie Hilfsextrazellulären α-Untereinheiten und 2 δ intrazellulären β-Untereinheiten zu etablieren: Funktions VGCCs bestehen aus mindestens drei verschiedene Klassen von Untereinheiten. Die beiden letztgenannten Form heteromeren Komplexe mit verschiedenen α-Untereinheiten 1 und ändern Sie die Gating-Kinetik und den Handel mit den Kanälen in der Plasmamembran 6. In den letzten Jahrzehnten wurden viele Techniken eingesetzt, um Protein expre studierenSpaltung, wie der Immunhistochemie, Enzyme-linked Immunosorbent Assay, Western-Analyse und Durchflusszytometrie. Diese Techniken erfordern die Verwendung spezifischer Antikörper zum Nachweis eines bestimmten Proteins von Interesse und liefern leistungsstarke Werkzeuge für die Lokalisierung und Verteilung spezifischer Proteine ​​in unterschiedlichen Geweben. Techniken zum Nachweis und zur Quantifizierung der mRNA Expression eines bestimmten Proteins, wie Northern-Blot-Analyse, RT-PCR, quantitative Echtzeit-RT-PCR, in situ-Hybridisierung, cDNA-Microarrays und Ribonuclease Protection Assay einen alternativen Ansatz bei der Antikörper nicht ohne weiteres verfügbar ist oder wenn die Expressionsniveaus eines bestimmten Proteins niedrig sind 7. , Eine Beschränkung auf die Verwendung von solchen molekularen Techniken ist jedoch die erforderliche Identifizierung der Gensequenz. Um Proteine ​​in der Netzhaut zu lokalisieren, kann die Immunhistochemie auf wholemount Netzhaut durchgeführt werden. Aufgrund der Zugänglichkeit der RGCs, der WholemountVorbereitung bietet eine hervorragende Plattform, um die Lokalisierung von spezifischen Proteinen auf die RGC Somata und ihre Axone zu studieren. Zusätzlich zu ihrer Lokalisierung, können einige funktionelle Eigenschaften der VGCCs in RGCs durch die Verwendung von Calcium-Imaging-Techniken nachgewiesen werden. Wir beschreiben eine Kalzium-Imaging-Protokoll, um selektive Markierung RGZ mit einem Calcium-Indikatorfarbstoff, um intrazelluläre Kalziumdynamik messen. Der Beitrag der unterschiedlichen VGCCs um das Calciumsignal in verschiedenen Zellkompartimenten können mit der Verwendung von subtypspezifischen Ca-Kanalblocker, isoliert werden. Vielleicht einer der vorteilhaften Aspekte des hier beschriebenen Calciumabbildungstechnik ist die Möglichkeit, gleichzeitig und unabhängig voneinander von mehreren RGCs und ihre Axone aufzuzeichnen. Obwohl viele physiologische Techniken, wie beispielsweise Voll Patch-Clamp-Aufnahme, eine hohe Zeitauflösung Aufnahmen Membranströme, die somatische oder axonale Quelle thesaufgezeichnet e Ströme nicht unterschieden werden und Aufnahmen können nur von einem einzelnen Neuron zu einem Zeitpunkt vorgenommen werden. Multielektroden-Arrays (MEA) sind in der Lage, gleichzeitig die Aufzeichnung Spitzen von vielen Zellen, aber weder erkennen noch zu benachteiligen die Aktivierung, beispielsweise unterschiedliche Subtypen von Calciumkanälen. MEAs bevorzugt von Zellen, die in der Nähe einer bestimmten Elektrode 8 und Satzes aus Zellen, die große Spitzen 9 erzeugen befinden aufzuzeichnen. Optischen bildgebenden Verfahren bieten eine alternative Strategie, um die gleichzeitige und unabhängige Aufnahmen von ganzen Populationen von Zellen, die mit dem von der Einzelzellmikroelektroden-und Patch-Clamp-Aufzeichnung und MEA Aufnahme gewonnenen Informationen integriert werden können ermöglichen. Obwohl die hier beschriebenen Kalzium-Imaging-Techniken wurden eingesetzt, um die Dynamik von Kalzium RGZ studieren können Patch-Clamp-und MEAs auch parallel zur weiteren Aufklärung der Ionenströme und Spick Eigenschaften der RGZ werden. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Seit verschoben Amakrinzellen machen etwa 60% der neuronalen Population in der Ganglienzellschicht in der Netzhaut der Maus 10, unser Ziel war es, eine Ladetechnik, die selektiv Etiketten RGZ mit einem synthetischen Kalzium-Indikator-Farbstoff in einer Gebrauchs wholemount Vorbereitung. Obwohl synthetische Calcium-Indikator-Farbstoffe eine ausgezeichnete Plattform für die Untersuchung der intrazellulären Calciumdynamik hat weitverbreitete Verwendung durch die Unfähigkeit behindert, um spezifische Populationen von Neuronen in einem bestimmten Netzwerk effektiv zu laden. Viele Techniken wie Bulkbeladung 11 und Elektroporation 8,12 durchgeführt, um zu laden ganze Populationen von Zellen, aber solche Techniken nicht zwischen bestimmten Zelltypen zu unterscheiden. Genetisch kodierte Calciumindikatoren liefern die Fähigkeit, selektiv zu markieren spezifischen Populationen von Zellen, jedoch erfordern solche Verfahren die Herstellung von transgenen Tieren 13. Unsere Technik beschreibt ein method selektiv beschriften RGZ in der wholemount Herstellung über Sehnerv Stumpf Injektion eines Kalzium-Indikator-Farbstoff. Zusammengenommen, strukturelle und physiologische Techniken in diesem Artikel beschrieben eine Plattform bieten, um die Lokalisierung und den Beitrag der VGCCs auf die Kalzium-Signal in RGZ und ihre Axone zu studieren.

<table><tbody><tr><td>Gerade Schere</td><td>WPI</td><td>14124-G</td><td>Präparierwerkzeuge</td></tr><tr><td>Gerade Pinzette</td><td>WPI</td><td>501985</td><td>Präparierwerkzeuge</td></tr><tr><td>gebogene Irisschere</td><td>WPI</td><td>504487</td><td>Präparierwerkzeuge</td></tr><tr><td>Zellulose-Filterpapier</td><td>Millipore</td><td>HABP04700</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate A</td><td>Invitrogen</td><td><ein href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp; productID=A1247501">A12475-01</a></td><td>Medien</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vektor</td><td>H-1000<</td><td>a href="https://www.google.com/url?sa=t&amp; rct=j& q=& esrc=s& Quelle=Web& cd=1& cad=rja& sqi=2& ved=0CC0QFjAA& url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279& ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw& usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA& sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg& bvm=bv.48705608,d.cGE">Eindeckmedien für Fluoreszenz</a></td></tr><tr><td>Fluo-4-Pentakalium</td><td>Invitrogen</td><td>F-14200</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Abbott Laboratories</td><td>05260-05</td><td>Anästhesie-Objektträger</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>22-178-277</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 5 Pascal Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 40X (NA 0,8) Objektiv Linse</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Antikörper</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A-11034</td><td>Sekundärer Antikörper</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>ProSci, Poway, CA</td><td></td><td>Ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper&nbsp; wurde gegen den N-Terminus des RBPMS&nbsp; Polypeptid (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, von einem kommerziellen Anbieter (ProSci, Poway, CA).</td></tr></tbody></table>

immunhistochemischen und calcium imaging methoden in der wholemount rat retina

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In diesem Beitrag beschreiben wir die Werkzeuge, Reagenzien und die praktischen Schritte, die für notwendig: 1) erfolgreiche Vorbereitung von wholemount Netzhaut für die Immunhistochemie und 2) Kalzium-Imaging für die Untersuchung von spannungsabhängigen Calcium-Kanal (VGCC) vermittelt Calcium-Signalgebung in der Netzhaut Ganglienzellen. Die Kalzium-Imaging-Methode beschreiben wir circumvents Fragen über nicht-spezifische Belastung von Vertriebenen Amakrinzellen in der Ganglienzellschicht.

Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern bietet eine Plattform, um die Lokalisierung von bestimmten Proteinen von Interesse in der Netzhaut und des Calciumbildgebungstechnik zu untersuchen erlaubt die Untersuchung der Beiträge der VGCCs den Calciumdynamik in den retinalen Ganglienzellen und ihre Axone. Durch die Verwendung eines Antikörpers gegen den Ganglienzellprotein RBPMS (RNA-Bindeprotein mit mehreren Spleißen), die selektiv markiert RGCs 19, konnten wir zeigen, dass der ...

Immunhistochemie Protokolle werden verwendet, um die Lokalisierung eines bestimmten Proteins in der Netzhaut zu untersuchen. Calcium-Imaging-Techniken verwendet werden, um Calciumdynamik in retinalen Ganglienzellen und ihre Axone zu studieren.

Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, retinale Ganglienzellen in der Ganzpräparat-Präparation gezielt über eine Injektion eines Kalziumindikatorfarbstoffs in den Sehnervstumpf zu markieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Kalziumindikatorfarbstoff mit sehr hoher Affinität, wie beispielsweise Fluo-4, in den Sehnervstumpf injiziert wird. Anschließend wird die Netzhaut vom Augenbecher isoliert und in Quadranten unterteilt, um sie auf einem Objektträger zu montieren. In einer Ableitungskammer, die unter physiologischen Bedingungen betrieben wird, können so die Beiträge spannungsabhängiger Kalziumkanäle zum Kalziumsignal untersucht werden.In retinalen Ganglienzellen können an depolarisierten Zellen mithilfe von Kanalblockern gemessen werden. Letztendlich können so halbquantitative Messungen des Beitrags spannungsabhängiger Kalziumkanäle an einem Signal wie einem durch hohes Kalium ausgelösten Kalziumsignal gewonnen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie Elektroporation und Bulk-Loading, liegt in der Möglichkeit, retinale Ganglienzellen und ihre Axone in einer Whole-Mount-Präparation gezielt zu markieren. Lagern Sie die präparierten Augen in einem geeigneten Medium wie Hibernat A oder einer ähnlichen Lösung.Wenn Sie nun Kalzium-Bildgebungsexperimente durchführen möchten, füllen Sie die retinalen Ganglienzellen mit Fluo-4 rückwärts auf. Injizieren Sie 0,5 µL einer 40 mmolaren Fluo-4-Penta-Kaliumsalzlösung, die in Wasser rekonstituiert wurde, in den Sehnervenstumpf etwa einen Millimeter hinter dem Augapfel. Überführen Sie das Augapfelpräparat in Säugetier-Ringer-Lösung.Mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid durchblubbert oder eine Stunde bei Raumtemperatur belassen. Die Zubereitung lichtgeschützt aufbewahren. Die Augen unter einem Mikroskop mit geregelter Lichtintensität dissezieren.Erzeugen Sie mit einer Rasierklinge vorsichtig einen kleinen Einschnitt an der Vorderseite des Augapfels und entfernen Sie die Hornhaut. Entfernen Sie dann die Linse von der inneren Netzhautoberfläche mit einer Pinzette. Halten Sie die Sklera fest.Beim Entfernen des Glaskörpers mit der anderen Pinzette den Glaskörperansatz vorsichtig zur Mitte der Retina hin ablösen. Die resultierende Präparation, die als I-Tasse bezeichnet wird, kann für die immunhistochemische Ganzpräparation, die Kalzium-Bildgebung oder für transversale Netzhautschnitte zur immunhistochemischen Ganzpräparation aufbereitet werden. Zunächst vier Schnitte in die Retina machen, damit sie flach aufliegt.Platzieren Sie die Netzhaut auf dem Glasdeckel, wobei die Ganglienzellschicht nach unten weist. Zweitens geben Sie einen Tropfen Lösung auf die Netzhaut und bedecken Sie sie gegebenenfalls mit Zellulosefilterpapier; glätten Sie die Netzhaut mit einem Pinsel oder einer Pinzette. Drittens, wenn die Netzhaut vollständig flach ist und sich vom Filterpapier löst, legen Sie sie zurück in die Lösung.Um die Präparation zunächst zu bearbeiten, überführen Sie sie 10 bis 15 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd. Anschließend waschen Sie die Netzhäute dreimal in 0,1 molarer Phosphatpufferlösung bei pH 7,4, wobei jede Waschung 30 Minuten dauert, insgesamt also 90 Minuten. Danach inkubieren Sie die Netzhäute über Nacht in 500 µL Blockierungslösung bei vier Grad Celsius. Diese Lösung enthält 5 % normales Ziegen- oder Essserum in Phosphatpuffer mit 0,3 % Tritton und 0,1 % Natriumazid. Inkubieren Sie die Netzhäute über die nächsten fünf bis sieben Tage in der Primärantikörperlösung bei vier Grad Celsius. Die Zusammensetzung dieser Lösung muss empirisch ermittelt werden. Spülen Sie die Primärantikörperlösung genauso ab, wie zuvor das Fixativ abgespült wurde.Anschließend inkubieren Sie die Netzhäute über Nacht bei vier Grad Celsius mit einem Sekundärantikörper in einer Konzentration von 1 zu 1000. Entfernen Sie den Sekundärantikörper durch drei weitere Waschungen mit Phosphatpuffer. Danach montieren Sie die Netzhäute zur Visualisierung und verschließen sie mit Nagellack.Diese Präparate müssen im Dunkeln bei vier Grad Celsius gelagert werden. Beginnen Sie mit der Herstellung einer Kalzium-Bildgebungsganzpräparation aus dem I-Becher in Ringer-Lösung. Schneiden Sie das retinale Gewebe zuerst in vier Segmente.Platzieren Sie ein Quadrant flach in die Aufnahmekammer, sodass die Ganglienzellschicht nach oben und somit die Photorezeptorschicht nach unten zeigt. Trocknen Sie den umgebenden Bereich vorsichtig mit einem Kim-Tuch ab und setzen Sie vorsichtig die gefettete Harfe auf das Gewebe auf. Laden Sie nun die Netzhautpräparation am Aufbau auf und vervollständigen Sie die Einrichtung des achtkanaligen gravitationsgetriebenen Überströmungssystems.Falls die präparierte Netzhaut verrutscht, nachdem der Harfenhalter eingesetzt wurde, entfernen und reinigen Sie den Halter vorsichtig. Trocknen Sie den Bereich um die Netzhaut herum und bringen Sie den Harfenhalter erneut an. Füllen Sie die Aufnahmekammer mit Ringer-Lösung für Säugetiere und lassen Sie die Lösung kontinuierlich mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid durchblubbern.Zunächst führen Sie als Kontrolle ohne Wirkstoffe zwei gepaarte Pulse mit hohem Kaliumgehalt von drei Millimolar auf 60 Millimolar für jeweils 33 Sekunden durch. Bei Depolarisation sollte das Ganglienzellpräparat, sofern funktionsfähig, spannungsabhängige Kalziumkanäle aktivieren. Fahren Sie nun mit den Experimenten fort.Nifedipin und L-Typ-spannungsabhängiger Kalziumkanal-Blocker werden häufig verwendet, um den Beitrag der L-Typ-spannungsabhängigen Kalziumkanäle zum depolarisationsinduzierten Kalziumsignal mit Kobalt zu bewerten. Ein unspezifischer Kalziumkanal-Blocker kann verwendet werden, um spannungsabhängige Kalziumkanäle unspezifisch zu blockieren. Scannen Sie das Präparat alle fünf Sekunden, um Bilder der fluoreszierenden RGC zu visualisieren und aufzuzeichnen.Verwenden Sie eine möglichst geringe Laserleistung. Die Anregung sollte auf 488 Nanometer eingestellt und die Emission mit einem 505 Nanometer LP-Filter gesammelt werden. Mit den beschriebenen Protokollen wurde eine Immunfärbung gegen das Ganglienzellprotein R-B-P-M-S durchgeführt, welches ein RNA-bindendes Protein mit mehrfachem Spleißablauf.Four ist.Die Färbung beschränkte sich tatsächlich auf Ganglienzellen, basierend auf der Antikörperspezifikation. Anschließend wurde der Beitrag der spannungsgesteuerten Kalziumkanäle zum Kalziumsignal in den RGCs anhand der fluoreszenten Intensitätswerte untersucht, die von den RGCs gewonnen wurden. Auf Grundniveau sind RGCs und RGC-Axone mit Fluor vier markiert zu sehen.Um Fluoreszenzintensitätswerte zu erhalten, wurden ROI auf die Ganglienzelle, Somata und/oder Axone platziert. Nach der Applikation von hohem Kalium an die Präparation in Ganzer Montierung nahm das Fluoreszenzsignal der RG-Zellen zu. Dies wurde gefolgt von einer anschließenden Abnahme der Fluoreszenzintensitätswerte in Gegenwart von Kobalt während des zweiten Hochkaliumreizes.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Ganglienzellen der Retina selektiv mit einem synthetischen Calciumindikatorfarbstoff in einer Ganzpräparat-Präparation belädt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine...

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em&gt; In vivo</em

Das hier beschriebene Protokoll dient zur strukturellen Bewertung eines Wholemount-Netzhautpräparats. Dazu gehören Beschreibungen der Gewebedissektion, der Montage auf einem hydrophilisierten Membraneinsatz aus Polytetrafluorethylen (PTFE), der Bolusbeladung mit fluoreszierenden Markern und ein Vergleich der Fixierung mit Carbodiimid und Paraformaldehyd für die immunhistochemische Analyse zellulärer und synaptischer Komponenten.

Optimiertes Protokoll für die retinale Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie

Wir beschreiben ein Protokoll, um Ca 2+ Dynamik in den Axonterminalen von Zapfen-Photorezeptoren mit einem ex-vivo Scheibe Vorbereitung der Maus Netzhaut zu überwachen. Dieses Protokoll ermöglicht umfassende Studien der Kegel Ca 2+ Signalisierung in einem wichtigen Säugetiermodellsystem der Maus.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Wir führen drei verschiedene Gewebe Vorbereitung Techniken für immunhistochemische Visualisierung der Ratte retinalen mikrovaskuläre perizyten, d. h. Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone Isolierung des vaskulären-Netzes.

Netzhaut Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone isoliert Gefäßsystem Vorbereitungen für immunhistochemische Visualisierung von Mikrovaskulären Perizyten

In-vivo-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Biologie in Gesundheit und Krankheit. Dieses Protokoll beschreibt die transpupille Bildgebung der Netzhaut der Maus mit einem Standard-Zwei-Photonen-Mikroskop. Es zeigt auch verschiedene In-vivoimaging-Methoden, um mehrere zelluläre Kohorten der Netzhaut fluoreszierend zu markieren.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

Wir präsentieren ein Protokoll, um das Hirnstamm der erwachsenen Maus von der ventralen Seite zu entlarven. Durch die Verwendung einer Gradienten-Refraktiven Indexlinse mit einem Miniaturmikroskop kann die Kalzium-Bildgebung verwendet werden, um die Aktivität von minderwertigen oliv-neuralen Somata nin vivo zu untersuchen.

In vivo Calcium Imaging in Maus Inferior Olive

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung eines großen (6 x 3 mm2) Schädelfensters mit Lebensmittelverpackung, transparentem Silikon und Deckglas. Dieses Schädelfenster ermöglicht in vivo Weitfeld- und Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebungsexperimente in derselben Maus.

Im lebenden Organismus Weitfeld- und Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung einer Maus mit einem großen Schädelfenster

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Bildgebung von Kalziumantworten im Colliculus superior (SC) von wachen Mäusen, einschließlich der Abbildung der Aktivität einzelner Neuronen mit Zwei-Photonen-Mikroskopie, während der Kortex bei Wildtyp-Mäusen intakt bleibt, und der Abbildung des gesamten SC mit Weitfeldmikroskopie bei Mäusen mit Teilkortex-Mutante.

Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus

Netzhautprothesen haben die Fähigkeit, visuelle Wahrnehmungen zu erzeugen. Um die Entwicklung neuer Prothesen voranzutreiben, werden Ex-vivo-Methoden benötigt, um Geräte vor der Implantation zu testen. Dieser Artikel bietet ein umfassendes Protokoll zur Untersuchung der Kalziumaktivität in der retinalen Ganglienzellschicht bei elektrischer Stimulation.

Kalzium-Bildgebung bei elektrisch stimulierten, flach montierten Netzhäuten

Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECI) ermöglichen eine robuste Analyse der sensorischen Neuronensignalisierung auf Populationsebene. Hier haben wir einen neuartigen Ansatz entwickelt, der eine in vivo GECI-Visualisierung der Aktivität von Trigeminusganglien bei Ratten ermöglicht.

In-vivo Kalzium-Bildgebung von sensorischen Neuronen im Trigeminusganglion der Ratte

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Isolierung der Netzhaut der gesamten Maus und zur Durchführung einer Immunfärbung zur Markierung aller retinalen Ganglienzellen (RGCs). Dem Prozess folgt die Bildgebung und automatische Zählung von RGCs mit KI-basierter Software, die eine einfache, schnelle und genaue Methode zur Quantifizierung von RGCs in der gesamten Netzhaut der Maus bietet.

Immunfärbung und automatische Zählung von retinalen Ganglienzellen der Maus

Lernen Sie die selektive Markierung retinaler Ganglienzellen in der Rattenretina durch Calcium-Indicator-Injektion in den Sehnervenstumpf. Diese Methode ermöglicht präzise Calcium-Imaging und Untersuchung spannungsabhängiger Calciumkanäle.

Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina

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