Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist das Screening von interessanten Verbindungen, um ihre zelluläre Zytotoxizität und ihre Fähigkeit zur Hemmung von Wildtyp- oder arzneimittelresistentem HIV in einer einzigen Runde zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem die Zellen zuerst den Verbindungen zur Aufnahme ausgesetzt und dann die behandelten Zellen mit Luciferase inkubiert werden, die Wildtyp- oder arzneimittelresistente HIV-Expression erzeugt. Anschließend kann die Luciferase-Aktivität des Virus gemessen werden.

Letztendlich kann das Luciferase-Auslesesignal verwendet werden, um die Hemmung der HIV V 1-Virusvektorreplikation durch die Verbindungen zu quantifizieren. Diese Technik hat therapeutische Implikationen, da sie zum Screening neuer Verbindungen verwendet werden kann, die eine bessere Wirksamkeit gegen arzneimittelresistentes HIV aufweisen. Solche Verbindungen könnten möglicherweise in antiretroviralen Therapien bei HIV-Patienten eingesetzt werden: Am Tag vor der Transfektionsplatte wurden 2 93 Zellen auf 100-Millimeter-Schalen mit einer Dichte von 1.500.000 Zellen behandelt.

Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit 16 Mikrogramm Wildtyp- oder mutiertem HIV und vier Mikrogramm VSV mit der Calciumphosphat-Methode app. Sechs Stunden später waschen Sie die 2 93 Zellen zweimal mit PBS und inkubieren sie dann 48 Stunden lang mit frischem Medium. Zwei Tage später erntet man das Virus, das S-Überstände enthält, aus den Schalen mit einem Durchmesser von 100 Millimetern und klärt die Überstände durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit für 10 Minuten bei 1.620 G bei Raumtemperatur.

Als nächstes filtrieren Sie die Überstände durch einen Spritzenfilter mit einer Porengröße von 45 Mikromolen und behandeln die Virussuspensionen mit Turbo-DNAs. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur verdünnen Sie das Virus mit frischen Medien und lagern es bei minus 80 Grad Celsius. Um das Screening der Verbindungen in einem Infektiositätsassay am Tag vor dem Experiment durchzuführen, säen Sie 4.000 der interessierenden Zellen in jede Vertiefung eines 96

Füllen Sie 100 Mikroliter Medien ein und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid. 24 Stunden später verdünnen Sie die Verbindung aus der Stammlösung seriell in frisches Medium. Die endgültigen Konzentrationen hängen von einem empirisch ermittelten Konzentrationsbereich ab, der in der Tabelle dargestellt ist.

Fügen Sie als nächstes die serielle Verdünnung der Verbindungen in dreifacher Ausfertigung zu den Vertiefungen hinzu. Bei einem Zehntel des Volumens der Endkonzentration wird die entsprechende Verdünnung der Verbindungen mit den Zellen mindestens drei Stunden lang inkubiert. Verwenden Sie nach der Inkubation eine Mehrkanalpipette, um 100 Mikroliter verdünntes Virus in jede der Vertiefungen zu geben.

Akzeptieren Sie die negativen Kontrollvertiefungen. Dann inkubieren Sie die Platten für weitere 48 Stunden. Verwenden Sie nach der Inkubation eine Glaspipette, die mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ausgestattet ist, um das Medium aus den Vertiefungen zu aspirieren, beginnend an der Oberseite des Mediums und langsam nach unten zur unteren Ecke der Vertiefung.

Geben Sie sofort 100 Mikroliter PBS, ergänzt mit 0,5 Millimolar Magnesiumchlorid, in jede Vertiefung und fügen Sie dann zur Messung der Luciferase-Aktivität 10 Mikroliter des Substratpuffers aus dem Lumineszenz-Reporter-Gen-Assay in jedes Fläschchen mit dem mitgelieferten lyophilisierten Reagenz hinzu. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter des rekonstituierten Reagenzes in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit sich das Signal entwickeln kann. Lesen Sie abschließend die 96-Well-Platte mit einem Mikroplatten-Luminometer ab.

Die Luziferase-Werte aus einem erfolgreichen Wirkstoff-Screening-Verfahren sind in der Tabelle dargestellt. Es ist zu beachten, dass potentiell potente Verbindungen eine zunehmende Luciferase-Aktivität aufweisen, wobei die Kontrolle in diesem repräsentativen Kaleido-Transplantat das höchste Signal aufweist. Die Konzentration der Verbindung im Vergleich zur prozentualen Hemmung der Luziferaktivität wurde aufgetragen, um zu bestimmen, ob die Verbindung die Replikation des Wildtyps oder des arzneimittelresistenten HIV wirksam hemmt.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine gleichmäßige Menge an Zellen und Viren genau in alle Vertiefungen der Platten zu verteilen und sicherzustellen, dass die richtige Konzentration der Verbindungen in jede Vertiefung gegeben wird.