Name: Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-09T21:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Erfahren Sie die schnelle Screening-Methode für HIV-1-Inhibitoren mittels Luciferase-Assay. Diese Technik ermöglicht die Bewertung zellulärer Zytotoxizität und antiviraler Wirksamkeit gegen Wildtyp- und resistenzbildende HIV-1-Stämme.

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Diese Forschung wurde durch die Interne Research Program der NCI unterstützt.

1. Vorbereitung der Master-Aktien <ol><li> Machen Master Aktien der in DMSO-Verbindungen getestet werden. Bereiten Aktien zu einem Standard-Konzentration von 20 mM. Hinweis: jede Konzentration oberhalb von 10 mm verwendet werden. Verbindungen, die als Positivkontrollen verwendet werden kann, um diesen Test zu validieren sind RAL-, EVG und DTG. </li><li> Sicherzustellen, dass die Verbindungen in DMSO durch Vortexen der Lösungen mehrmals für 15 sec und Inkubation bei RT für 1 h gelöst. Bewahren Sie die 20 mM Stammlösungen im Dunkeln bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Vorbereitung der 96-Well-Platten für Komponenten-Screening <ol><li> Wählen Sie die Zelllinie getestet werden (zB HOS oder TZM-bl) und Samen 100 ul dieser Zellen bei einer Dichte von 4 × 10 4 Zellen / ml (4000 Zellen / Vertiefung) in Medien (z. B. Dulbecco-modifiziertem Eagle-oder DMEM-Medium mit 5% (v / v) fötalem Rinderserum, 5% Serum neugeborener Kälber, und Penicillin (50 Einheiten / ml) und Strept ergänztomycin). </li></ol> 3. Erzeugung von Virus-Stocks Erzeugen VSV-G-pseudotypisierten HIV-Zellen durch Transfektion 293 32-34 (wie in Fig. 1, Schritt 1). <ol><li> Am Tag vor der Transfektion Platte 293-Zellen auf 100 mm-Schalen in einer Dichte von 1,5 × 10 6 Zellen. </li><li> Am Tag der Transfektion, Transfektion von 293-Zellen mit 16 ug Wildtyp-oder mutierten HIV (pNLNgoMIVR - ΔLUC) und 4 ug VSV (pHCMV-g) unter Verwendung der Calciumphosphat-Methode 35. </li><li> Etwa 6 Stunden nach der Calciumphosphat-Niederschlag wird aufgenommen, Wasch 293 Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Inkubation mit frischem Medium für 48 Stunden. [DMEM, ergänzt mit 5% (v / v) fötalem Rinderserum, 5% Serum neugeborener Kälber, und Penicillin (50 Einheiten / ml) und Streptomycin (50 ug / ml)]. </li><li> Ernten Sie den Virus enthaltenden Überstände durch Entfernen der Medien aus dem 100 mm DurchmesserGeschirr, verdeutlichen die Überstände durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit bei 3000 rpm für 10 min, die Überstände filtriert durch ein 45 &amp;mgr; m-Spritzenfilter Porengröße, Behandlung der Überstände mit Turbo DNase für 30 min bei RT inkubiert und die Überstände in verdünnten Medien für die Zubereitung in Infektionstests . Bewahren Sie die Virusüberstände eingefroren, aliquotiert, bei -80 ° C Anmerkung: Die Menge an p24 im Überstand wird mit einem HIV-1-p24-Enzym-Immunoassay-Kits bestimmt. Die p24-Konzentration verwendet wird, die Menge des Virus in der Probe zu steuern. Ungefähr 500 ng Virus zu HOS-Zellen auf 60 mm-Schalen plattiert bei einer Dichte von 1,5 x 10 5 Zellen / Schale am Tag vor der Infektion zugesetzt. Nach 48 h Inkubation werden die Zellen geerntet, durch Zentrifugation gesammelt, gewaschen und in 100 &amp;mgr; l PBS resuspendiert. In die gleiche Menge an Lumineszenz Reporter-Gen-Assay-Reagenz und messen Luciferase-Aktivität wie in den Abschnitten 5.4.1 und5.4.2. Daraus kann eine geeignete Verdünnung des Virus, wie in Schritt 4.6 beschrieben werden. </li></ol> 4. Substanz-Screening in 96-Well-Platten Bildschirm jede Verbindung in dreifacher Ausfertigung und der Mittelwert der Ergebnisse. Hinweis: Die Wirkung jeder Verbindung auf die virale Replikation wird durch Normierung auf die Ebene der Replikation in Abwesenheit von Verbindung erhalten wird korrigiert. <ol><li> Bestimmen Sie die Summenkonzentrationsbereich zu sehen sein. Hinweis: in der Regel werden die Bildschirme mit 11 Reihenverdünnungen durch Zugabe der Verbindung zu der Platte Spalte für Spalte und Bildschirme mit sieben serielle Verdünnungen gemacht werden, indem die Verbindung von Zeile vorgenommen. Ein dreifacher Reihe von Brunnen muss für die Verbindung keine Steuer reserviert werden. Darüber hinaus muss eine Spalte oder eine Zeile leer bleiben als negativ / Hintergrundkontrolle handeln. Schließlich sei es eine zelluläre Zytotoxizität oder Infektiosität Assay wird diktieren, ob Virus zugegeben. </li><li> Vorbereitenserielle Verdünnungen von der 20 mM Stammlösung. Die Konzentrationen sind in Abhängigkeit von der empirisch ermittelten Bereich von zu testenden Konzentrationen gewählt (wie in Tabelle 1 gezeigt). Bereiten Sie die Verdünnungen in Medien bei 10x die gewünschte endgültige Konzentration, dh wenn die endgültige Konzentration wird bis 100 um, machen Sie eine 1 mM Arbeits Lager. Anmerkung: Verbindungen mit IC 50 s über 5-10 um üblicherweise nicht gute Kandidaten für die Wirkstoffentwicklung. In den ersten Tests prüfen wir die Verbindungen nur gegen den WT-Vektor. Vielversprechende Verbindungen, die effektiv hemmen die WT-Vektor werden dann gegen eine Auswahl von resistenten Mutanten getestet. </li><li> Entfernen der 96-Well-Platten aus dem Inkubator und fügen die serielle Verdünnungen der zu den Vertiefungen in dreifacher Ausführung getestet werden Verbindungen (wie in Fig. 1, Schritt 2 gezeigt). Hinweis: Der in die Vertiefung gegeben Volumen sollte 1/10 Volumen Endkonzentration sein. So fügen Sie 22 &amp;mgr; l / (Endvolumen pOST-Virus zusätzlich 220 ul) für die Infektiosität Assays. Für Zytotoxizitätsassays, fügen Sie 11 ul / (Endvolumen 110 ul / Vertiefung). </li><li> Geben die 96-Well-Platten in den Inkubator. Für eine zelluläre Zytotoxizität Bildschirm, brüten die 96-Well-Platten 48 h bei 37 ° C und keine weiteren Manipulationen werden in Protokoll Nr. 4 benötigt: gehen Sie zu Protokoll 5 Für Infektiosität Assays, folgen weiter den Anweisungen in Protokoll Nr. 4.. </li><li> Nur Infektiosität Assays. Entfernen der Platten aus dem Inkubator nach einem Minimum von 3 h Inkubation bei 37 ° C mit den Verbindungen zu analysieren. Anmerkung: Dies ermöglicht die Verbindung von den Zellen vor der Infektion mit dem HIV-Vektor aufgenommen werden. </li><li> Bereiten Sie eine Verdünnung der Lager-Virus 33, 34 (in der Regel ca. 01.03 Uhr), die eine Luciferase-Signal zwischen 0,2-1,5 relativen Luciferase-Einheiten (RLE) in unbehandelten Zellen produzieren wird. Eine ganze Platte wird ca. 10 ml Verdünnung nehmented-Virus. Füge 100 &amp;mgr; l Virus zu jeder der Vertiefungen, unter Verwendung von entweder 8 oder 12 Mehrkanalpipette. Sie Virus zu den negativen / Hintergrund-Kontrollvertiefungen nicht hinzu. Rückgabe der Platten an den 37 ° C-Inkubator für 48 Stunden. Hinweis: 1:3 Lager Verdünnung des Virus ist typisch Verdünnung, die eine Luciferase-Signal zwischen 0,2 -1,5 RLUs basierend auf einer p24-Test zeigt, dass die Viruskonzentration im Überstand beträgt ca. 500 ng in 1,0 ml produzieren wird. </li></ol> 5. Vorbereitung und Messung der Zytotoxizität und Infektiosität in 96-Well-Platten <ol><li> Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen (Phenolrot in den Medien mit der Luciferase-Signal stören). Verwenden Sie eine Glaspipette mit einer 200 ul Pipettenspitze bis zum Ende befestigt. Start an der Spitze der Medien und langsam arbeiten nach unten in Richtung der unteren Ecke des Brunnens. Zu viel Zeit verbringen Sie am unteren Rand des Brunnens, oder Zellen können aus dem Bohrloch entfernt werden. </li><li> 100 l PBS, ergänzt mit 0,5 mM MgCl 2 in jede Vertiefung. Dies muss unmittelbar erfolgen, nachdem das Medium entfernt, so dass die Zellen nicht austrocknen. </li><li> Nur für Zytotoxizitätsassays, 5 ml Substratpuffer von der ATP-Lumineszenz-Nachweistest zu jeder Flasche des gefriergetrockneten Reagenz geliefert. Ein Fläschchen für eine 96-Well-Platte aus. <ol><li> In 50 ul Zelllysepuffer von der ATP-Lumineszenz-Nachweistest in jede Vertiefung. Schütteln der Platte mit 96 Vertiefungen bei 700 Upm bei Raumtemperatur für 5 min unter Verwendung eines kompakten Thermomixer. </li><li> In 50 ul des rekonstituierten ATP Lumineszenz-Nachweis-Assay-Reagenz in alle Vertiefungen mit Ausnahme der Negativkontrolle / Hintergrund-Brunnen. Schütteln bei 700 Upm bei Raumtemperatur für 5 min unter Verwendung eines kompakten Thermomixer. Die Platten bei RT für 20 Minuten inkubieren, um Zeit für Signalentwicklung zu ermöglichen. </li><li> Lesen Sie die 96-Well-Platte mit dem Mikroplatten-Luminometer. Hinweis: Öffnen Sie die SoftMax Pro Mikroplatten-Luminometer Programm. Stellen Sie sicher, das Luminometer Lumi ist zu messenzenz bei einer Empfindlichkeit von 5 Messwerten / gut. </li></ol></li><li> Nur für die Infektiosität Assays, 10 ml Substratpuffer von der Lumineszenz Reporter-Gen-Assay auf jeder Flasche des gefriergetrockneten Reagenz geliefert. Ein Fläschchen ist ausreichend für jede Platte mit 96 Vertiefungen. <ol><li> 100 l rekonstituiert Lumineszenz Reporter-Gen-Assay-Reagenz in jede Vertiefung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min, um Zeit für Signalentwicklung ermöglichen. </li><li> Lesen Sie die 96-Well-Platte mit Hilfe eines Mikroplatten-Luminometer, wie in Abschnitt 5.3.3 durchgeführt. </li></ol></li></ol> 6. Bestimmung der CC 50 und IC 50-Werte für die Verbindungen <ol><li> Übertragen Sie die Daten aus der Luciferase-Mikroplatten-Luminometer in eine Excel-Tabelle. <ol><li> Durchschnittliche sowohl die Luciferase Daten in dreifacher Ausfertigung und Hintergrund / Steuerdaten. Subtrahieren Sie die durchschnittliche Hinter / Steuersignal von der dreifachen durchschnittlichen Signal für den gesamten Konzentrationsbereich. </li> &lt;li&gt; normalisieren die Hintergrund korrigierten mittleren Signal für die Konzentrationsbereiche gegen die Aktivität, ob es sich um Zytotoxizität oder Infektiosität in Abwesenheit irgendeiner Verbindung, um die prozentuale Inhibierung zu bestimmen. Hinweis: prozentuale Hemmung wird als die Luciferase-Aktivität in Anwesenheit von Arzneimittel in der Abwesenheit von Arzneimittel, multipliziert mit 100 geteilt durch die Luciferase-Aktivität bestimmt. </li></ol></li><li> Verwenden Kaleidagraph Software-Programm zu CC 50 und IC 50-Werte zu erhalten <ol><li> Übertragen Sie sowohl die empirisch ermittelten Konzentrationsbereich und prozentuale Hemmung der Luciferase-Aktivität in Kaleidagraph. </li><li> Zeichnen Sie die Daten mit dem Konzentrationsbereich auf der x-Achse und die prozentuale Inhibierung der Luciferase-Aktivität auf der y-Achse. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschreiben eine schnelle, effiziente und reproduzierbare Assay zum Screening von Verbindungen, die für die Zytotoxizität und auf ihre Fähigkeit, die Replikation von sowohl WT-und arzneimittelresistenten HIV-1 hemmen, verwendet werden können. Die Fähigkeit, schnell Verbindungen zu identifizieren und prüfen ihre Wirksamkeit und Zytotoxizität bei der Entwicklung von neuen und verbesserten Arzneimitteln gegen HIV-1 wichtig. Sobald Bleiverbindungen identifiziert werden, können Analoga der Bleiverbindung hergestellt werden und unter Verwendung des gleichen Assays. Der Test ist relativ einfach. Es gibt sowohl positive und negative Kontrollen, die dem Benutzer die häufigsten Probleme (toxische Verbindungen, Probleme mit dem Vektor stock) Diagnose zu ermöglichen. Die Verwendung eines Dreifachsatzes von Vertiefungen ohne zugesetzte Verbindung zeigt, dass die Virusinfektion aufgetreten. Die Tatsache, dass die Cytotoxizität in einem unabhängigen Test gemessen vermeidet Fehlinterpretation einer Verringerung der Luciferase von Zytotoxizität als eine spezifische Wirkung auf die virale Replikation verursacht werden. Die kritischen Schrittein dem Protokoll werden die Platten vorbereitet, so dass die Zellen gleichmäßig in den Vertiefungen verteilt sind, daß die Bohrungen über die entsprechenden Konzentrationen der zu prüfenden Verbindungen, indem die gleiche Menge an Virus zu jeder der Vertiefungen, und die Messung der Luciferase-Aktivität Bestimmung der CC 50 und IC 50-Werte. Der Test ist sicher, quantitative und reproduzierbar. Der Test ist sicher, weil der Vektor-Replikation defekt. Der Test ist quantitativ und reproduzierbar, da sie auf einer einzigen Runde Vektor, der Luciferase exprimiert, die genau und bequem untersucht werden kann, nach. In einer mehrjährig Virusreplikation Assay wird die gemessene IC 50 hängt von der Anzahl der viralen Lebenszyklen; dies ist ein besonderes Problem, wenn die Tests umfassen sowohl WT und resistenten Viren, die deutlich unterschiedliche Replikations Kapazitäten haben können. Es wurden mehrere enzymatische Tests zuvor berichtet, dassverwendet werden, um an Inhibitoren screenen. Assays, die Echtzeit-PCR-Technologie beinhalten, um integrierte DNA messen erfordern gereinigt rekombinante Proteine ​​(e) und sind in der Regel sowohl arbeitsintensiv und teuer 36, 37. Obwohl es möglich ist, die enzymatische Assays verwenden, um die Wirkung der Verbindungen auf die andere virale Enzyme (RT und Protease) zu messen, wobei jedes Enzym erfordert eine eigene Testsystem. Die eine Runde Vektor-Assay wie beschrieben, kann verwendet werden, ohne Änderung an für RT-Inhibitoren zu screenen. Ein ähnlicher Test kann verwendet werden, um Protease-Inhibitoren zu screenen; jedoch in einem Protease-Inhibitor-Assay, die Verbindungen müssen auf die die Vektoren verwendet Zellen hinzugefügt werden. Eine verwandte Assay mit verschiedenen Zellen und Vektoren können auch verwendet werden, um Umschlag (env) und das Eindringen von HIV-Fusionsinhibitoren screenen. Schließlich kann der Assay verwendet werden, in einem größeren Maßstab, mit automatisierten Roboterspendern. So kann der Assay verwendet werden, um große Bibliotheken von Verbindungen gegen WT und m screenenutant HIV. Die Tatsache jedoch, kann der Assay einen Inhibitor der HIV-Replikation, die in verschiedenen Stadien des viralen Lebenszyklus weist auf eine Beschränkung in der Interpretation der Daten wirkt, zu erfassen. Von selbst der Test wird nicht definiert, welcher Schritt im Lebenszyklus durch eine Verbindung blockiert. Wenn diese Frage stellt, kann es durch Verwendung der Zeit des Assays zusätzlich 38 gelöst werden, und durch Testen der Verbindung gegen gereinigten rekombinanten viralen Proteinen. Leider trotz des Erfolgs der Anti-HIV-Arzneimittel, gibt es immer noch Probleme mit sowohl Beständigkeit und Toxizität. In Abwesenheit einer wirksamen Anti-HIV-Impfstoff, ist es notwendig, nicht nur neue therapeutische Arzneimittel, die wirksam sein werden anhand der vorhandenen Arzneimittel-resistenten Mutanten, sondern auch zu prophylaktischen Medikamente, die die Ausbreitung des Virus zu reduzieren entwickeln zu entwickeln. Wenn die prophylaktische Anwendung von Anti-HIV-Medikamente incudes die Behandlung von nicht-infizierten Menschen wird dieser Ansatz eine besondere Belastung für die Entwicklung von Medikamenten, haben l sind platzierenittle oder keine langfristige Toxizität.

Die Verfügbarkeit von Medikamenten, die an einige wesentliche Schritte in der HIV-1 viralen Lebenszyklus zu Kombinationstherapie (so genannte hochaktive antiretrovirale Therapie oder HAART), die sich stark verbessert hat die Behandlung von HIV-1-Infektionen, und die langfristige Überlebensrate geführt der Patienten. HAART, die typischerweise verwendet Kombinationen von zwei Nukleosid-Reverse-Transkriptase-(RT)-Hemmer und entweder ein Protease-Inhibitor oder ein Nicht-Nukleosid-RT-Hemmer, wurde jetzt eine tödliche Krankheit umgewandelt in ein Leben lang Zustand 1-5. Trotz der vielen Erfolge von HAART in verzögerter Unterdrückung der Virusreplikation, hat es jedoch Einschränkungen. HAART nicht auszurotten HIV, so dass die Patienten nicht geheilt und Therapie ist das Leben lang. Es gibt Probleme mit Medikamententoxizität und mit der Entstehung von resistenten Sorten. Widerstand kann auf alle zugelassenen Anti-HIV-Medikamente, einschließlich der neu zugelassenen Medikamente, die HIV-Integrase (IN) Ziel kommen. Arzneimittelresistenz entsteht wahrscheinlich becaVerwendung von spontanen Mutationen, die während der viralen Replikation (Fehlerrate von 3 x 10 -5 Mutationen / base / Replikationszyklus) auftreten 6. Wenn Mutationen entstehen in den Genen, die für die Ziele der Anti retrovirale Medikamente codiert, wird eine kleine Teilmenge dieser Mutationen zu einer Verringerung der Empfindlichkeit des Virusstammes, um die Medikamente führen. Um die Entwicklung von Resistenzen zu vermeiden, muss Wirkstoffkonzentrationen auf einem Niveau, das die HIV-Replikation vollständig zu unterdrücken, aufrecht erhalten werden. Schlechte Einhaltung der Therapieregime verschärft das Problem, und kann auf die schnelle Entwicklung von Resistenzen führen 7-9. Obwohl Wirkstoffkonzentrationen bei Patienten aufgrund unterschiedlicher Resorption, Stoffwechsel, Verteilung und Ausscheidung Ebenen variieren können hohe Wirkstoffkonzentrationen, um die Toxizität 10 führen. Seit Therapie weiterhin für das Leben des Patienten, gibt es ernsthafte Sicherheitsbedenken hinsichtlich der langfristigen Toxizität von Antiretroviren. Die antiretrovirale Medikamente häufig in HAART verwendet werden, können negative Auswirkungen haben einnd gab es Fälle, wo die Nebenwirkungen wurden lebensbedrohlich 11-15. Die Probleme, die Patienten stoßen mit der Entwicklung von Widerstand und Toxizität zugrunde liegen, die Notwendigkeit, neue Medikamente, die die Replikation der gemeinsamen resistenten Stämme des Virus mit wenig oder keine langfristige Toxizität effektiv blockieren zu entwickeln. Somit besteht ein Bedarf an einem Assay, der für die Verbindungen, die wesentlichen Schritte schnell blockieren im viralen Lebenszyklus zu screenen kann. Hier beschreiben wir ein effizientes Assay, der verwendet werden kann, um die Zytotoxizität der Verbindungen A und ihre Fähigkeit, die Replikation von sowohl WT-und Arzneimittel-resistente HIV-Stämme schnell und effizient zu blockieren auszuwerten. Der Test wir verwenden, ist ähnlich zu einem Test, der entwickelt wurde, um für eine Arzneimittelresistenz in Virus aus Patienten isoliert 16-18 screenen. Obwohl der Test kann ohne Modifikation zum Screening auf Verbindungen, die HIV reverse Transkription blockieren kann verwendet werden, werden wir describe mit dem Test zu bewerten, IN-Inhibitoren. IN ist ein essentielles virales Enzym, das die virale DNA in das zelluläre Genom 19 einfügt. Obwohl eine Reihe von vielversprechenden IN Inhibitoren entwickelt werden, von denen einige derzeit in klinischen Studien nur Isentress 20, 21 (auch als Raltegravir oder RAL bekannt) und in jüngerer Zeit, Elvitegravir (EVG) 22 und Dolutegravir (DTG) 23 wurden von der FDA zugelassen. Diese Verbindungen sind sowohl gegen HIV-B-B-Subtypen und nicht in Zellkultur und in Patienten 24, 25 aktiv. Die Behandlung mit RAL wählt für Arzneimittel-resistente HIV-1-IN-Mutanten, einschließlich Y143R, N155H und G140S/Q148H 24, 26-31. N155H G140S/Q148H und reduzieren auch die Wirksamkeit von EVG, die die Notwendigkeit, IN Strangtransfer-Inhibitoren (INSTIs), die wirksam gegen diese Resistenz-Mutationen sind Design und Entwicklung der zweiten Generation betont.

<table><tbody><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-017</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite Lumineszenz-ATP-Detektions-Assay-System</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016941</td><td></td></tr><tr><td>Steady Lite Plus hochempfindliches Lumineszenz-Reporter-Gen-Assay-System</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016751</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS</td><td>Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini EM</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 Microwell Weiß Polystyrol Platte</td><td>Thomas Scientific</td><td>12-566-26</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer Compact</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1442-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Millex HA Filtereinheit, 0,45 &Mikro; M</td><td>Millipore</td><td>SLAHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK050B001KT</td><td></td></tr><tr><td>HOS-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>TZM-bl Zellen</td><td>NIH AIDS Reagenzprogramm</td><td>8129</td><td></td></tr><tr><td>pNL4.3&Delta; Env.LUC</td><td>NIH-NCI HIV Drug Resistance Program - Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>NIH-NCI Drug Resistance Program - Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td>0200-310</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid-screening von hiv-reverse-transkriptase und integrase-inhibitoren

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Obwohl eine Reihe von Anti-HIV-Arzneimittel genehmigt wurden, gibt es immer noch Probleme mit der Toxizität und Medikamentenresistenz. Dies zeigt die Notwendigkeit, neue Verbindungen, die Infektion durch die gemeinsame arzneimittelresistenten HIV-1-Stämme mit minimaler Toxizität hemmen kann, zu identifizieren. Hier beschreiben wir ein effizientes Assay, der verwendet werden kann, um schnell zu bestimmen, die zelluläre Zytotoxizität und Wirksamkeit einer Verbindung gegen WT und Mutanten-Virusstämme. Die gewünschte Zielzelllinie wird in 96-Well-Platte ausgesät und nach 24 Stunden Inkubation werden seriell Verdünnungen der zu testenden Verbindungen zugegeben. Keine weitere Manipulationen sind für zelluläre Zytotoxizität-Tests erforderlich; für Anti-HIV-Tests eine vorbestimmte Menge von entweder einer WT oder arzneimittelresistenten HIV-1-Vektor, der Luciferase zu den Zellen gegeben drückt. Zytotoxizität wird unter Verwendung eines ATP-abhängige Lumineszenz-Assay und die Wirkung der Verbindungen auf die Infektiosität gemessen wird durch Bestimmen der Menge des gemessenen luciferase in Gegenwart oder Abwesenheit des mutmaßlichen Inhibitoren. Diese Screening-Test dauert 4 Tage dauern und mehrere Verbindungen parallel untersucht werden. Verbindungen werden dreifach durchmustert, und die Daten sind auf die Infektiosität / ATP-Spiegel in Abwesenheit von Zielverbindungen. Diese Technik ermöglicht eine schnelle und genaue Messung der Wirksamkeit und Toxizität von potentiellen Anti-HIV-Verbindungen.

Wenn der Test (Fig. 1, Schritte 1 und 2) wurde erfolgreich durchgeführt, dann sollte die Luciferase-Werte, die in Tabelle 2 präsentierten Daten ähneln Scannen über den Konzentrationsbereich. eine potenziell starke Verbindung wird zeigen zunehmende Luciferase-Aktivität von links nach rechts, und die Steuerung sollte die höchste Luciferase-Aktivität zu haben. Wenn die Luciferase-Aktivität hat 0,1 Relative Luciferase-Einheiten (RLE) über den Konzentrationsbereich nicht überschreiten, dies in der Regel an, dass die Verbindung der Zellen getötet. Wenn die Luciferase Daten größer als oder gleich 2,0 RLU für alle Serienverdünnungen, dann wurden die Verbindungen nicht in der Lage, HIV-1-Infektionen bei den getesteten Konzentrationen zu inhibieren. Auftragen der Konzentration der Verbindungen im Vergleich zu der prozentualen Inhibition der Luciferase-Aktivität in Kaleidagraph (Tabelle 3, Teil A), nach dem Durchführen einer linearen Regressionsanalyse, werden ähnliche Ergebnisse zu produzieren t<html> Schlauch in Tabelle 3, Teil B gezeigt <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Vorbereitung der HIV-1-Virus-Stocks und dem Aufbau der zelluläre Zytotoxizität und Single-Runde Infektiosität Assays. In Schritt 1 293T-Zellen mit pNL4.3ΔEnv.LUC und VSV-G transfiziert und für 48 Stunden inkubiert, um die Virus-34 produzieren . Das Virus wird geerntet und gelagert (bei -80 ° C in Aliquots eingefroren), bis er in die Infektiosität-Assays verwendet wird. Für Schritt 2 werden HOS-Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät und 24 h lang inkubiert. Die Zellen werden dann mit seriellen Verdünnungen der für 3 Stunden getestet werden Verbindungen vorinkubiert und dann mit Virus (entweder WT oder resistenten) infiziert. Nach einer 48-stündigen Inkubation wird die Luciferase-Aktivität gemessen. le1.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Tabelle 1. Drug Screening Verdünnungs Prototype. Eine strengere Screening beinhaltet 11 Verdünnungsreihen, die in der Regel beginnen bei 10 uM und endet um 0,0005 uM. Die serielle Verdünnungen vorbereitet 10x; es gibt 100 ul Zellen und 100 &amp;mgr; l Virus pro Vertiefung). In diesem Volumen und nach diesen Berechnungen werden die seriellen Verdünnungen genug für 3 Zeilen eines gesamten 96-Well-Platte sein. Die Zytotoxizität-Tests werden auf ähnliche Weise hergestellt; aber die 11 serielle Verdünnungen beginnen bei 250 uM und am Ende bei 0,05 uM. Nur 11 ul der Verdünnungen werden in die Vertiefungen in der Platte, die 100 ul Zellen enthalten aufgenommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Tabelle 2. Luciferase-Signal Datenauslesung und Bestimmung der prozentualen Inhibition der Luciferase-Aktivität. Die Datentabelle zeigt einen typischen Satz von Luciferase-Daten für eine erfolgreiche Verbindung. Die Tabelle zeigt auch die weiteren Berechnungen erforderlich, um die prozentuale Hemmung der Luciferase-Aktivität und die CC-50 und IC 50-Werte zu bestimmen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Tabelle 3. Lineare Regressionsanalyse Datentabelle. Teil A. Grafische Darstellung der Konzentrationsbereich gegenüber der prozentuale Hemmung der Luciferase-Aktivität in Kaleidagraph verwendet wird die entsprechenden Hemmkurven zu produzieren. Teil B, Die Hemmung Kurven durch die parametrische 3 definiertsigmoidale Funktion und Passform auf den Daten, die von linearen Regressionsanalysen 18. Diese Daten-Tabelle wird dann in Verbindung mit Microsoft Excel verwendet, um die Wirkstoffkonzentrationen erforderlich, um Virus-Integration und zelluläre Zytotoxizität von 50%, zB IC 50 und CC 50 hemmen berechnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Hier beschreiben wir zelluläre Zytotoxizität und einzigen Runde Infektiosität Assays, die für die schnelle und genaue Überprüfung von Verbindungen zu erlauben, ihre zelluläre Zytotoxizität (CC 50) zu ermitteln und IC 50-Werte gegen WT-und arzneimittelresistente HIV-1.

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Verbindungen von Interesse daraufhin zu untersuchen, ob sie zelluläre Zytotoxizität aufweisen und die Fähigkeit besitzen, den Wildtyp oder resistente Formen von HIV-1 in einem Einzelinfektions-Assay zu hemmen. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst den Verbindungen zur Aufnahme ausgesetzt und anschließend die behandelten Zellen mit luciferaseexprimierendem HIV-1-Wildtyp oder resistenter HIV-1-Variante inkubiert werden. Die Luciferase-Aktivität des Virus kann dann gemessen werden.Schließlich kann das Luciferase-Messsignal verwendet werden, um die Hemmung der Replikation des HIV-Virus-Vektor Typ 1 durch die Verbindungen zu quantifizieren. Diese Technik hat therapeutische Implikationen, da sie zur Untersuchung neuer Verbindungen eingesetzt werden kann, die eine bessere Wirksamkeit gegen HIV mit Arzneimittelresistenz aufweisen. Solche Verbindungen könnten potenziell in der antiretroviralen Therapie von HIV-1-Patienten eingesetzt werden. Am Tag vor der Transfektion 2,93-Zellen in 100-Millimeter-Dishs mit einer Dichte von 1.500.000 Zellen pro Dish ansäen.Transfizieren Sie die Zellen am nächsten Tag mit 16 Mikrogramm Wildtyp- oder mutiertem HIV und vier Mikrogramm VSV unter Verwendung der Calciumphosphat-Methode. Sechs Stunden später waschen Sie die 2 93-Zellen zweimal mit PBS und inkubieren sie anschließend 48 Stunden mit frischem Medium. Zwei Tage später gewinnen Sie die virushaltigen S-Überstände von den Petrischalen mit 100 Millimeter Durchmesser und klären die Überstände durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit für 10 Minuten bei 1.620 ×g bei Raumtemperatur.Als Nächstes filtrieren Sie die Überstände durch einen Spritzenfilter mit einer Porengröße von 45 Mikrometer und behandeln die Virus-Suspensionen mit Turbo-DNase. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur verdünnen Sie das Virus mit frischem Medium und lagern es bei minus 80 Grad Celsius. Um die Substanzen am Tag vor dem Experiment in einem Infektivitätsassay zu testen, säen Sie 4.000 Zellen der gewünschten Art pro Loch in eine 96er-Platte aus.Platte in 100 Mikroliter Medium ein und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid. Verdünnen Sie die Substanz 24 Stunden später seriell aus der Stammlösung in frisches Medium. Die gewählten Endkonzentrationen hängen von einem empirisch bestimmten Konzentrationsbereich ab, wie in der Tabelle dargestellt.Fügen Sie anschließend die serielle Verdünnung der Verbindungen in dreifacher Ausführung zu den Vertiefungen hinzu. Unter Zugabe eines Zehntels des Volumens der Endkonzentration inkubieren Sie die geeignete Verdünnung der Verbindungen mit den Zellen für mindestens drei Stunden. Nach der Inkubation geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter verdünntes Virus in jede der Vertiefungen.Negative Kontrollbrunnen akzeptieren. Anschließend die Platten weitere 48 Stunden inkubieren. Nach der Inkubation das Medium aus den Brunnen mit einer Glaspipette, die mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ausgestattet ist, abziehen, wobei man an der Oberseite des Mediums beginnt und langsam in die untere Ecke des Brunnens vordringt.Fügen Sie sofort 100 Mikroliter PBS, ergänzt mit 0,5 Millimolar Magnesiumchlorid, zu jedem Brunnen hinzu. Um dann die Luciferase-Aktivität zu messen, geben Sie 10 Mikroliter des Substratpuffers aus dem Lumineszenz-Reportergen-Assay in jedes Gefäß mit dem beigefügten lyophilisierten Reagenz. Anschließend fügen Sie 100 Mikroliter des rekonstituierten Reagenzes zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren die Platte 20 Minuten bei Raumtemperatur, um die Signalentwicklung zu ermöglichen. Abschließend lesen Sie die 96-Loch-Platte mit einem Mikroplatten-Luminometer ab.Die Luciferase-Werte aus einem erfolgreichen Verbindungsscreening-Verfahren sind in der Tabelle dargestellt. Beachten Sie, dass potenziell wirksame Verbindungen eine zunehmende Luciferase-Aktivität zeigen, wobei die Kontrolle in diesem repräsentativen Kaleido-Transplantat das höchste Signal aufweist. Die Konzentration der Verbindung wurde gegen die prozentuale Hemmung der Luciferase-Aktivität aufgetragen, um zu bestimmen, ob die Verbindung wirksam die Replikation des Wildtyps oder des HIV mit Arzneimittelresistenz hemmt.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine einheitliche Menge an Zellen und Virus gleichmäßig auf alle Vertiefungen der Platten zu verteilen, und sicherzustellen, dass die richtige Konzentration der Verbindungen in jede Vertiefung gegeben wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

In-vitro-Assays zur Messung der Virusreplikation wurde durch die Entwicklung von rekombinanten RNA-Viren Luciferase oder andere Enzyme, die Biolumineszenz exprimieren verbessert. Hier werden wir ausführlich ein Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die solche rekombinante Stämme von Masern-und Chikungunya-Viren, um Breitspektrum antiviralen Medikamenten aus chemischen Bibliotheken zu isolieren verbindet.

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

Arzneimittelresistenz Tests für HIV-1-infizierten Personen in Ermangelung einer antiretroviralen Therapie (ART) können zukünftige Therapien führen und die Behandlungsergebnisse zu verbessern. Optimierung der individuellen und der Gesundheit der Bevölkerung Ergebnisse in hoher HIV-Prävalenz, aber mit beschränkten Ressourcen wird letztlich erfordern erschwinglich und zugänglich Resistenzen Genotypisierung und Interpretationsmethoden.

Eine erschwingliche HIV-1 Drug Resistance Überwachungsmethode für Ressourcen Begrenzte Einstellungen

Dieser Bericht beschreibt einen in vitro Assay zur Messung der mit dem humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) präintegrierten Komplex (PIC) assoziierten Integrationsaktivität in den zytoplasmatischen Extrakten akut infizierter Zellen. Die Integration von PIC-assoziierter HIV-1-DNA in heterologe Ziel-DNA wird mit Hilfe einer verschachtelten Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsstrategie quantifiziert.

Messung von In Vitro Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe

Dieses Manuskript beschreibt die experimentelle Prozedur und Softwareanalyse für einen bidirektionalen Integrationsort-Assay, der gleichzeitig stromaufwärts und nachgeschaltete Vektor-Host-Junction-DNA analysieren kann. Bidirektionale PCR-Produkte können für jede nachgeschaltete Sequenzplattform eingesetzt werden. Die resultierenden Daten sind nützlich für einen hochdurchsatzreichen, quantitativen Vergleich von integrierten DNA-Targets.

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Rekombinante Retroviren Integrase und DNA-Oligomere imitiert virale DNA enden können einen enzymatisch aktiven Komplex bekannt als ein Intasome bilden. Intasomes können für biochemische, strukturellen und kinetischen Studien verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt, wie zu montieren und zu reinigen Prototyp schaumig Virus Intasomes.

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Ein High-Throughput Cre-Lox aktiviert virale Membran Fusion Assay Ermittlung Inhibitoren der HIV-1 Virus Membranfusion

Hier präsentieren wir einen Tiefe Sequenzierung Ansatz, der eine objektive Bestimmung der im Entstehen begriffenen 3'-Termini sowie mutagenen Profile der einzelsträngigen DNA-Moleküle enthält. Die Hauptanwendung ist die Charakterisierung der im Entstehen begriffenen retrovirale ergänzende DNAs (cDNAs), die Zwischenprodukte, die während des Prozesses der retroviralen reversen Transkription generiert.

Bestimmende 3'-Termini und Sequenzen der im Entstehen begriffenen einsträngige virale DNA-Moleküle während HIV-1 Reverse Transkription in infizierten Zellen

Ein hoher Durchsatz-Protokoll für funktionale Bewertung von HIV effiziente Reaktivierung und Clearance von latenten Proviruses ist beschrieben und durch die Auswirkungen von Interventionen auf die Transkription von HIV-Tests und Spleißen angewendet. Repräsentative Ergebnisse des Effekts der Latenz Umkehrung Agenten auf LTR-driven Transkription und Spleißen stehen zur Verfügung.

Hoher Durchsatz In Vitro Bewertung der Latenz Umkehrung Agenten auf HIV Transkription und Spleißen

In dieser Arbeit beschreiben wir die Protokolle, die in replikonbasierten und viralen enzymbasierten Assays verwendet werden, um in einem Hochdurchsatz-Screening-Format nach Inhibitoren der Zika-Virusreplikation zu suchen.

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Erfahren Sie die schnelle Screening-Methode für HIV-1-Inhibitoren mittels Luciferase-Assay. Diese Technik ermöglicht die Bewertung zellulärer Zytotoxizität und antiviraler Wirksamkeit gegen Wildtyp- und resistenzbildende HIV-1-Stämme.

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