定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

この手順の全体的な目的は、単一細胞定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を用いて、個々のヒト胚性幹細胞の遺伝子発現レベルをプロファイリングすることです。まず、フローサイトメトリー（FACS）を用いて、細胞溶解バッファーを含む96ウェルプレートの各ウェルに個々の細胞を分取します。次のステップでは、単一細胞溶解物からRNAを逆転写し、cDNAを合成します。

次に、ポリメラーゼ連鎖反応によりcDNAを増幅させます。最終ステップとして、増幅されたcDNAに対して定量的なRT-PCRを行います。最終的に、このアッセイはヒト胚性幹細胞のような不均一な集団における遺伝子発現の研究に有用です。

本手法の既存の単一細胞定量的人工血管に対する主な利点は、この手法、EEG、およびより堅牢なPrior to fax精製にあります。OCT 4 EGFPヒト胚性幹細胞（hESC）を60 mmディッシュから回収します。すべての培地を除去し、1 mLのAccutaneを加えて37 °Cで20分間インキュベートします。

1 mLのヒトES培地でAccutaneを中和し、遠心分離して細胞をペレット化します。上清を廃棄した後、細胞を FACSバッファーで再懸濁し、濃度を1×10⁶ cells/mLに調整します。次に、細胞サンプルを35 µmのセルストレーナー付きチューブに通します。セルソーティングまで、チューブを氷上に保存してください。

まず、1 µLのsingle cell D Ns oneと9 µLのsingle cell lysis solutionを含むマスターミックスを調製します。96ウェルPCRプレートの各ウェルに、このミックス溶液を10 µLずつ分注します。FACS解析用に、セルソーターを用いて単一のEGFP陽性細胞を96ウェルPCRプレートの各ウェルに分取するようにプログラムします。セルソーティング後、細胞溶解のため、サンプルを室温で5分間インキュベートします。溶解反応を停止させるために、1 µLのstop solutionを加え、室温で2分間インキュベートします。

本手順を開始するために、まず96ウェルプレートの各ウェルに、20 µMのSMAT 15およびSMAAプライマーを含むEloqua液を0.5 µLずつ加えます。サンプルを80 °Cで5分間加熱します。その後、5xバッファーを4 µL、DTTを2 µL、逆転写酵素を1 µL、そしてdNTPsを1 µL加えます。

サーマルサイクラーを用いて、各ウェルで逆転写を行います。温度プログラムを42°Cで90分間、続いて85°Cで5分間に設定します。逆転写完了後、逆転写酵素を不活化するため、各cDNAサンプルに4 µLのexo reagentを加え、37°Cで15分間インキュベートして過剰なオリゴヌクレオチドガイドを消化し、続いて80°Cで15分間インキュベートします。

exo試薬を不活化するため、2 nMのSMAP 2プライマーを用いてPCR反応ミックスを調製します。各逆転写サンプルに、PCR反応ミックスを10 µL加えます。

変性、アニーリング、伸長反応の20サイクルによる増幅を行い、サンプルの増幅後、R-T-P-C-Rの結果を確認するために、2枚の独立したプレートで2セットの定量R-T-P-C-R反応を実施します。2枚の96ウェルプレートの各ウェルに、10 µLの2x SYBR Green PCR master mix、1 µLの増幅済みcDNA、2種類のプライマー、および7 µLの水を加えます。プログラムを、95 °Cで3秒間、続いて60 °Cで30秒間に設定します。

プライマーの誤差を低減するため、40サイクルのうちアニーリングステップを除去しました。本研究のアニーリングでは、Hessの全RNAをマイクログラム量からナノグラムおよびピコグラムレベルまで希釈し、テクニカルバリアビリティおよび低量の全RNAにおける差の検出を評価しました。10 ng/µLから0.1 pg/µLまで段階希釈した混合籾殻のmRNAを用いて、G-A-P-D-H遺伝子の定量R-T-P-C-Rを実施しました。各ドットは、段階希釈したmRNAおよび FACS でソートされた単一細胞mRNAのCT値を示しています。

各サンプルとQR TPCRの結果との間に相関が認められ、複数の単一細胞で同様のCT値が示されました。OCT four EGFPレポーターHESC株から、EEG FP陽性の強い細胞を分取・選択するためにFACSを用いました。その結果、逆転写および増幅反応の異なるバッチ間での一貫性を検証したところ、陰性集団に対して約60%のEGFP陽性集団が認められました。

Fax精製した単一細胞溶解液を2等分し、バッチ間の比較を行うためにそれぞれの半分にプロトコルを適用した。単一細胞溶解液の各半分におけるOCT fourのCT値の間には、有意な相関が認められた。単一ハスクの遺伝子発現をヒートマップで示したところ、OCT fourの発現レベルは一貫して強固であったが、別の幹細胞マーカー遺伝子であるNAN ogの発現レベルは変動していた。以上の結果を総合すると、本単一細胞遺伝子発現アッセイは、多能性幹細胞の集団の不均一性を研究するのに有用であることが示された。

このビデオを視聴することで、単一細胞トランスクリプトームのためのQITPを適切に実施する方法について、十分な理解を得ることができます。