Профилирования Индивидуальный человеческих эмбриональных стволовых клеток путем количественного RT-PCR

Общая цель данной процедуры заключается в профилировании уровней экспрессии генов отдельных эмбриональных стволовых клеток человека с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в одной клетке, или RT-PCR. Это достигается путем первоначального использования сортинга клеток с флуоресцентной активацией для распределения отдельных клеток по каждой лунке 96-луночного планшета, содержащего буфер для лизиса клеток. Вторым этапом является обратная транскрипция РНК для получения кДНК из лизатов единичных клеток.

Затем кДНК амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции. Заключительным этапом является проведение количественной ОТ-ПЦР амплифицированной кДНК. В конечном счете, данный анализ полезен для изучения экспрессии генов в гетерогенных популяциях, таких как эмбриональные стволовые клетки человека.

Основное преимущество данной методики по сравнению с существующими количественными искусственными сосудами для анализа единичных клеток заключается в том, что этот метод, ЭЭГ и более надежная очистка предшествуют факс-очистке. Для OCT four EGFP человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESC) клетки отделяют от чашки диаметром 60 мм. Удалите всю среду, добавьте 1 mL Accutane и инкубируйте при 37 °C в течение 20 минут.

Нейтрализуйте Accutane, добавив один миллилитр среды для культивирования человеческих ES-клеток, затем центрифугируйте образец для осаждения клеток. После удаления супернатанта ресуспендируйте клетки в FACS-буфере и доведите их концентрацию до 1 × 10⁶ клеток на миллилитр. Затем пропустите образец клеток через сеточный фильтр с размером пор 35 мкм в пробирку. Храните пробирку на льду до проведения сортинга клеток.

Начните выполнение данной процедуры с приготовления основной смеси (мастер-микса), содержащей 1 µL single cell D Ns one и 9 µL раствора для лизиса единичных клеток. Перенесите по 10 µL полученного раствора в каждую лунку 96-луночного ПЦР-планшета для последующего анализа. Запрограммируйте клеточный сортер на сортировку единичных EGFP-положительных клеток в лунки 96-луночного ПЦР-планшета. После сортировки клеток инкубируйте образцы в течение пяти минут при комнатной температуре для лизиса клеток. Чтобы остановить реакцию лизиса, добавьте 1 µL стоп-раствора и инкубируйте при комнатной температуре в течение двух минут.

Для начала данной процедуры в каждую лунку 96-луночного планшета добавьте по 0.5 µL Eloqua, содержащего праймеры SMAT 15 и SMAA в концентрации 20 µM. Нагрейте образцы при 80 °C в течение пяти минут. Затем добавьте 4 µL 5x буфера, 2 µL DTT, 1 µL обратной транскриптазы и 1 µL dNTPs.

В каждой лунке проведите обратную транскрипцию в термоциклере. Установите программу термоциклирования: 42 °C в течение 90 минут, затем 85 °C в течение пяти минут. Для инактивации обратной транскриптазы по завершении обратной транскрипции добавьте четыре µL exo-реагента в каждый образец кДНК, инкубируйте при 37 °C в течение 15 минут для переваривания избытка олигонуклеотидных праймеров, а затем при 80 °C в течение 15 минут.

Для инактивации exo-реагента приготовьте ПЦР-смесь с использованием 2 nM праймера SMAP 2. Добавьте 10 µL ПЦР-смеси в каждый образец с продуктом обратной транскрипции.

Проведите амплификацию, состоящую из 20 циклов денатурации, отжига и элонгации. После амплификации образцов проведите два набора реакций количественной ОТ-ПЦР в отдельных планшетах для подтверждения результатов ОТ-ПЦР. В каждую лунку двух 96-луночных планшетов добавьте 10 µL 2х мастер-микса ПЦР с SYBR Green, 1 µL амплифицированной кДНК, два праймера и 7 µL воды. Установите программу: 95 °C в течение 3 секунд, затем 60 °C в течение 30 секунд.

Для 40 циклов была удалена стадия «плато» (kneeling step) с целью снижения погрешности праймера. В данном исследовании микрограммовые количества тотальной РНК Hess разбавляли до нано- и пикограммовых уровней для оценки технической вариабельности и выявления различий при низком содержании тотальной РНК; количественная R-T-P-C-R гена G-A-P-D-H проводилась с использованием мРНК объединенных оболочек, последовательно разведенных от 10 nanograms per microliter до 0.1 picograms per microliter. Каждая точка отображает значение CT для последовательно разведенной мРНК и мРНК одной клетки, отсортированной методом FACS.

Была обнаружена корреляция между каждым образцом и результатами QR TPCR, при этом в нескольких единичных клетках наблюдались схожие значения CT. Для сортировки и отбора клеток с сильной экспрессией EGFP из линии HESC с репортером OCT four EGFP использовали FACS. Результаты показывают, что доля EGFP-положительной популяции составила примерно 60% по сравнению с отрицательной популяцией, что подтверждает согласованность результатов между различными партиями реакций обратной транскрипции и амплификации.

Очищенные лизаты отдельных клеток, полученные методом FACS, разделили пополам, и к каждой половине применили данный протокол для сравнения партий. Была отмечена значимая корреляция значений Ct для OCT four в каждой из двух половин лизатов отдельных клеток. Тепловая карта экспрессии генов в одной клетке демонстрирует стабильный и высокий уровень экспрессии OCT four, но варьирующийся уровень другого гена-маркера стволовых клеток, NAN og. В совокупности наши результаты показывают, что данный метод анализа экспрессии генов в отдельных клетках полезен для изучения популяционной гетерогенности плюрипотентных стволовых клеток.

После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как правильно проводить QITP для транскриптома единичных клеток.