Name: Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus Drosophila Tücher für Genexpressionsanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-25T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Lernen Sie die Affinitätsbasierte Isolierung markierter Kerne aus Drosophila-Geweben für Genexpressionsanalysen. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen spezifischer Zelltypen.

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Wir danken Janice Fischer für die Bereitstellung des UAS-EGFP::Msp-300KASH Plasmids. Der mAB24B10-Antikörper wurde von der Developmental Studies Hybridoma Bank gewonnen, die unter der Schirmherrschaft des NICHD entwickelt und von der University of Iowa, Department of Biology, gepflegt wird. Die Repo-GAL4-Aktie (BL7415) wurde vom Bloomington Stock Center an der Indiana University bezogen. Wir danken der Unterstützung durch den American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG #58-006-53) für das Purdue University Center for Cancer Research. Jingqun Ma wird von einer Assistentin für landwirtschaftliche Forschung an der Purdue University in Lebensmitteln und Landwirtschaft unterstützt.

1. Erzeugung und Charakterisierung von EGFP :: Drosophila KASH <ol><li> Kreuz Gal4-Treiber fliegt UAS-EGFP :: Msp-300-KASH fliegt. Alternativ können rekombinante Fliegen, die sowohl die Gal4-Treiber und den UAS-EGFP :: Msp-300-KASH Transgen tragen mit Standard-genetische Techniken erzeugt werden. Dieser zweite Ansatz ist vorteilhaft, wenn eine große Zahl von Nachkommen erforderlich sind. </li><li> Charakterisierung der Expression des EGFP :: KASH Marker mit Standard-Mikroskopie-Techniken. Hinweis: EGFP-Expression kann durch Standardtechniken in der Mikroskopie präpariert, fixiert Drosophila Geweben beobachtet werden, ganz oder Larven, und die Verwendung eines Antikörpers nicht erforderlich. <ol><li> Bestimmen Sie die Expressionsmuster der EGFP :: KASH Marker im gesamten Organismus unter einem Fluoreszenzmikroskop seziert (siehe Materialien PDF). Hinweis: Viele Gal4 Treiber, darunter auch der in Abbildung 1 dargestellt Repo-GAL4-Treiber, Ausstellungs nonspecific Expressionsmuster in anderen Larvengewebe wie der Speicheldrüse (siehe Ergebnisse). </li><li> Analysieren Sie den EGFP :: KASH Expressionsmuster in der sezierten Gewebe von Interesse mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. <ol><li> Fix das Gewebe von Interesse unter Verwendung von Formaldehyd in einer Endkonzentration von 4%, und DNA mit DAPI-Färbung in einer Endkonzentration von 0,1 ug / ml, um die Lokalisation des EGFP :: KASH Tag bezogen auf DNA sichtbar. </li><li> Erwerben Sie Bilder entweder mit einem 40X / 1,30 Ölimmersionsobjektiv oder ein 20X / 0,75 Ölimmersionsobjektiv, abhängig von der Größe des Gewebes von Interesse. Die folgenden Anregung / Emissionsbedingungen können für die Bildaufnahme verwendet werden: 408 nm/425-475 nm (DAPI), 488 nm / 525 bis 550 nm (GFP). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Isolieren Kerne von Drosophila Larven Gewebe <ol><li> Bereiten Ausrüstung für die Larven Gewebedissektion Kerne und anschließende Isolation. Beachten Sie, dassganze dechorionated Embryonen können auch als Ausgangsmaterial verwendet werden, falls gewünscht. Es wird empfohlen, teilweise zerlegt Larven Gewebe statt ganzer Larven verwenden, wenn der Zelltyp von Interesse in einem spezifischen Gewebe, wie Imaginalscheibe vorliegt. Dies reduziert die unspezifische Bindung und beseitigt Probleme, die durch die Expression von Gal4 Treiber in einigen Nicht-Zielzellen verursacht werden können auch. <ol><li> Bereiten Sie zwei Paar scharfe Zange (siehe Materialien PDF), eine silikonisierte 9-Loch-Glasplatte (siehe Materialien PDF) und PBT (1x PBS, pH 7,4, 0,1% Tween-20). </li><li> Vorausbindung der GFP-Antikörper an die magnetischen Kügelchen. Dieser Schritt vor Beginn der Präparation begonnen werden. Werden 10 ul der magnetischen Beads (Invitrogen, siehe Materialien PDF) und 2 ug des GFP-Antikörper (Roche, siehe Materialien PDF) zu 400 &amp;mgr; l Waschpuffer (1 × PBS, pH 7,4, 2,5 mM MgCl 2) in einem 1,5-ml-Röhrchen . Die Menge an Perlen und Antikörper verwendet werden, können gegebenenfalls auf der Grundlage der Menge an Target in der sam optimiertPLE und die Bindungsaffinität des Antikörpers an die Beads. </li><li> Inkubieren der Kügelchen und der Antikörper mit einer Drehung von mindestens 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit den Perlen und Antikörper in der Magnetstange (siehe Materialien PDF) und lassen Sie die Perlen auf die Magnet für ca. 1-2 min zu binden. Entfernen Sie den Überstand, der nicht gebundenen Antikörper und Waschpuffer mit einer 1 ml Pipette. Die Perlen bleiben an der Wand des 1,5 ml-Röhrchen auf der Seite benachbart zu dem Magneten gebunden. </li><li> Zweimal spülen Sie die Beads mit 1 ml Waschpuffer jedes Mal, wie in Abschnitt 2.1.4 beschrieben. Entfernen Sie den 1,5-ml-Röhrchen aus der Magnetstange und kurz umzukehren, um die Perlen zu mischen und Waschpuffer bei jedem Waschschritt. </li><li> Bewahren Sie die Antikörper-gebundenen Perlen in Waschpuffer, bis bereit, mit Schritt 2.7 fort. Die Kügelchen sollten nicht in jeder Phase des Protokolls austrocknen. </li></ol></li><li> Dissect Larvengewebe in PBT und übertragen seziert Gewebeeine Vertiefung der 9-Loch-Schale. Typischerweise Dissektion der optischen Loben und Augen Imaginalscheibe 100 dritte Larvenstadium bietet genügend Material für Downstream-Genexpressionsanalyse folgende Kerne Isolation. </li><li> Spülen des isolierten Gewebes in Kernextraktionspuffer (10 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 2,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl) in einem 1,5-ml-Röhrchen. Übertragen isoliert Larvengewebe zu einer 1 ml Dounce Homogenisator (siehe Materialien PDF) auf Eis, 1 ml frisches Kernextraktionspuffer enthält. Inkubieren auf Eis für 5 min. Es ist nicht notwendig, um die Proteaseinhibitoren zuzusetzen, wenn RNA wird zu folgenden Kerne Isolierung gewonnen werden. </li><li> Stören das Gewebe durch 20 Schläge mit dem losen Stampfe und dann inkubieren Sie die Probe auf Eis für 10 Minuten, damit die Zellen zu schwellen. Extrahieren Sie die Kerne aus den Zellen mit 15 Schläge mit der engen Stößel. Die Anzahl der Schläge mit der locker und fest stampfen muss für die verschiedenen Geweben und Zelltypen optimiert werden, überschüssige Homogenisierung kann dazu führen,geschert Kerne, während unzureichende Homogenisierung werden alle Atomkerne aus dem Gewebe nicht extrahieren. </li><li> Filtern Sie die Homogenat, die die Kerne und Zelltrümmer enthält, durch ein 40 um Porengröße Sieb (siehe Materialien PDF), die mit der Kern Homogenisationspuffer vorgespült wurde. Sammeln Sie die gefilterten Homogenat in ein frisches Röhrchen. </li><li> Sammeln Sie vor Isolation Proben für die spätere Analyse, um Kerne Ertrag, Kerne Integrität zu bestimmen und Transkript Ebenen von Zielgenen vor der Isolierung Kerne zu bestimmen. <ol><li> Über 50 ul des gefilterten Homogenat in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen mit einer Pipette. Dies ist die Pre-Isolation Probe. In 500 ul Trizol-Reagenz (siehe Materialien PDF, VORSICHT), Invertzucker zu mischen, und bei -20 ° C für spätere RNA-Isolierung (Schritt 3.1). </li><li> Über 20 ul des gefilterten Homogenat in ein frisches 1,5-ml-Tube. <ol><li> Hinzufügen DAPI in einer Endkonzentration von 0,1 ug / ml, und incUbate Probe auf Eis für 10 min. </li><li> Übertragen DAPI-gefärbten Zellkernen an eine Poly-Lysin beschichtete Deckglas, und legen auf einen Objektträger. Deckglas mit klarem Nagellack. </li><li> Überprüfen Sie die Kerne Integrität und Gegenwart von GFP-markierten Kerne von Interesse unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskop. Hinweis: Es ist nicht notwendig, um die Kerne zu beheben, oder für GFP Fleck, wenn diese Folien sind recht schnell nach der Herstellung (innerhalb 24 Stunden) analysiert. </li></ol></li><li> Über 10 ul des gefilterten Homogenat in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 90 ul Waschpuffer (1x PBS, pH 7,4, 2,5 mM MgCl 2). Hinzufügen DAPI in einer Endkonzentration von 0,1 ug / ml und Inkubation auf Eis für 10 min. Bestimmen Sie die Kerne Ausbeute in der Pre-Isolation Probe mit einer Zählkammer die DAPI-positiven Kerne rechnen mit Epi-Fluoreszenz unter einem 10X Luft Ziel. </li></ol></li><li> Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit den Antikörper-gebundenen Kügelchen (in Abschnitt 2.1.6) hergestellt in einem magnetischen Träger,und lassen sich die magnetischen Beads an der Magnet für mindestens 2 min zu binden, wie in Abschnitt 2.1.4 beschrieben. Entfernen Sie den Waschpuffer aus den Antikörper-gebundenen Perlen mit einer 1 ml-Pipette, und fügen Sie die gefilterten Homogenat aus Schritt 2,5 bis 1,5-ml-Röhrchen mit einer 1 ml Pipette. </li><li> Invertieren Sie das Röhrchen vorsichtig mehrmals zu mischen, und Inkubation bei 4 ° C für 30 min mit end-over-end Aufregung. Vermeiden Sie Luftblasen in die Röhre, wenn möglich, da diese in Verklumpung der Kerne führen. </li><li> Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit den Antikörper-gebundenen Perlen und Homogenat in einem Magnetständer, und lassen sich die magnetischen Beads an der Magnet für mindestens 2 min zu binden, wie in Abschnitt 2.1.4 beschrieben. Entfernen Sie das Homogenat mit der ungebundenen Fraktion Kerne mit einer 1 ml Pipette. </li><li> Waschen der Probe 3x mit 1 ml Waschpuffer jedes Mal. Entfernen Sie den 1,5-ml-Röhrchen mit den Perlen, gebunden Kernen und Waschpuffer aus dem Rack und invertieren mehrmals zu mischen, dann das Rohr in der magnetischen Rack wie beschriebenin Schritt 2.9 und den Überstand mit einer 1 ml Pipette. </li><li> Mit 150 ul Waschpuffer zu den Kügelchen, die den Targetkerne gebunden sein sollte. Dies ist die post-Isolierung Probe. Bereiten Proben für die Mikroskopie-Analyse und anschließende RNA-Extraktion. <ol><li> Über 20 ul der Post-Isolierung Probe in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen und Fleck mit DAPI und zu analysieren, wie in Abschnitt 2.6.2 beschrieben. Zählen Sie die GFP + / DAPI + und + GFP-/DAPI Kerne durch magnetische Kügelchen eingefangen, um die Reinheit der angereicherten GFP +-Kerne in der Post-Isolierung Probe zu bestimmen. </li><li> 1 ml Trizol-Reagenz, um den Rest des Post-Isolierung Probe, kehren zu mischen, und bei -20 ° C für die anschließende RNA-Isolierung (Schritt 3.1). Anmerkung: Die Proben in Trizol kann mehrere Wochen falls bei -20 ° C gelagert werden Es ist nicht notwendig, um die Kerne von den magnetischen Kügelchen vor RNA-Extraktion mit Trizol-Reagenz zu eluieren, because die Perlen nicht mit der nachfolgenden RNA-Isolierung stören. </li></ol></li></ol> 3. Bestimmen Transcript Levels in Nuclei Isoliert von Larven Gewebe <ol><li> Isolieren von RNA aus der Pre-und Post-Isolierung Isolierung Proben in den Abschnitten 2.6.1 und 2.11.2 unter Verwendung des für Trizol-basierte RNA-Extraktion beschriebenen Standardprotokoll (siehe Materialien PDF) mit den folgenden Modifikationen hergestellt: <ol><li> Nach Fällung der RNA-Pellet, fügen 19,2 ul RNase-freies Wasser und 0,8 ul RNASecure Reagenz (siehe Materialien PDF) zum Pellet und Inkubation bei 60 ° C für 20 min auf RNAsen zu inaktivieren. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit einem fluoreszierenden Farbstoff-RNA-Bindung wie der Qubit-RNA-Assay-Kit (siehe Materialien PDF) mit dem QubitR 2.0 Fluorometer nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Synthese von cDNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase Verstärkung wie der EpiScript Reverse Transkriptase-Kit und oligodT Primer nach Herstellerangaben. Anmerkung: In der Regel werden 50 bis 100 ng RNA erzeugt ausreichend cDNA durchzuführen multiplen Genexpression analysiert. Äquivalente Mengen von Pre-und Post-Isolation RNA-Isolation verwendet, um cDNA zu erzeugen. </li><li> In 180 ul Nuklease-freies Wasser auf die 20 ul cDNA-Probe, um diese 10-fach vor der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR) Analyse zu verdünnen. Diese Verdünnung ist ein wichtiger Schritt, denn unverdünnten cDNA-Proben können die qPCR hemmen. </li><li> Bereiten Sie eine qPCR Master Mix mit Polymerase und dNTPs, jeweils von Vorwärts-und Rückwärts-4 pmol Primer, gebildet mit sterilem Wasser auf die endgültige Reaktionsvolumen von 20 ul. <ol><li> Gestalten Sie qPCR-Primer, um Gene, die voraussichtlich in der Zelltyp von Interesse ausgedrückt werden gezielt und in der Entwicklungsphase, bei der das Gewebe gesammelt. Design-Primer eine Intron überspannen, wenn möglich, so daß genomische undcDNA-PCR-Produkten unterschieden werden. Hinweis: Wenn das Genexpressionsprofil der Zielzelltyp nicht bekannt ist, gegen eGFP Primern, die spezifisch in dem markierten Keimpopulation exprimiert werden soll, kann verwendet werden, um das Protokoll für einen bestimmten Zelltyp und Gewebe (Tabelle 1) zu optimieren. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die relativen Transkript-Gehalte von jedem Gen von Interesse in der Pre-und Post-Isolierung Isolierung Proben durch Vergleich mit einer Verdünnungsreihe von cDNA aus dem gesamten Gewebe hergestellt. Transcript Ebenen von Zielgenen sollte zu einem Referenzgens wie Rpl32 (oder besser mehrere Referenzgene) normalisiert werden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um spezifisch markierte Zellkerne aus gemischten Zellpopulationen in embryonalen oder Larvengeweben von Drosophila zu isolieren oder hochgradig anzureichern. Mit diesem Protokoll können Zellkerne aus präpariertem Gewebe in etwa 1 Stunde isoliert werden. Die Reinheit und Ausbeute der isolierten Zellkerne muss für jeden Zelltyp experimentell bestimmt werden. Aufgrund der in der Probe vorhandenen Kügelchen kann es schwierig sein, die beadgebundenen Kerne in der Postisolations...

Drosophila-Gewebe, wie dem zentralen Nervensystem enthalten ein komplexes Gemisch von Zelltypen. Somit zellspezifische Genexpressionsprofile von Drosophila Gewebe zu analysieren, ist es zunächst notwendig, eine homogene Population von spezifischen Zellen in ausreichenden Mengen zu isolieren, um Downstream-Anwendungen zu ermöglichen. Verfahren, um Zellen von intakten Geweben zu isolieren, umfassen Laser Mikrodissektion und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) von ganzen Zellen. Während FACS wurde verwendet, um Zellen und Zellkerne von Drosophila-Embryonen und aus Caenorhabditis elegans zur Genexpression und Chromatin Profilierung 1-3 isolieren kann FACS und Laser Mikrodissektion schwierig sein, in Geweben, die stark vermischten Zelltypen oder enthalten, dass die Zellen mit enthalten, erfolgreich durchführen unregelmäßige Morphologie, wie Neuronen. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, können Kerne anstatt Zellen aus spezifischen Zelltypen isoliert und für die nachfolgende Generation verwendet werden,e Expression Profiling. Wichtig ist, Microarray-basierte mRNA-Expressionsanalyse, die Kern RNA-Proben zeigt allgemein vergleichbare Ergebnisse bei der Verwendung von Gesamt-RNA, 4, 5 durchgeführt. Darüber hinaus hat die Genexpressionsanalyse mit Kern-RNA wurde erfolgreich eingesetzt, um die Genexpression in mehreren Organismen einschließlich C. studieren elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila und Menschen 4, 5 2, 3. Mehrere Ansätze wurden kürzlich für die Isolierung von spezifischen Populationen von markierten Kerne aus Drosophila Gewebe, geeignet für Genexpressionsanalyse und / oder Chromatinimmunpräzipitation sind beschrieben worden. Die Batch-Isolierung von Gewebe-spezifische Chromatin für die Immunpräzipitation (BiTS-Chip-) Verfahren nutzt FACS festen Kerne auf der Basis von Zelltyp-spezifische Expression von Kern lokalisierte GFP 2 isolieren. Dieser Ansatz war successfully verwendet, um die Verteilung von Histon-Modifikationen und Transkriptionsfaktoren unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation von isolierten Kernen aus dem Mesoderm von Drosophila-Embryonen 2 analysieren. Jedoch kann FACS-basierte Ansätze zur Isolierung markierten Kerne, die nur einen geringen Anteil an einer gemischten Population aufgrund der erhöhten Zeitaufwand für die Art geeignet Nummern für Downstream-Anwendungen zu erhalten, machen weniger geeignet sein. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden mehrere Gruppen Affinitäts-Isolationstechniken genutzt werden, um Kerne, die mit einem bestimmten Epitop in einem bestimmten Zelltyp gekennzeichnet sind, zu reinigen. Die Isolierung von Zellkernen in spezifischen Zelltypen (intakt) Verfahren zur Verwendung in Arabidopsis thaliana 6, 7 entwickelt markiert wurde kürzlich für die Verwendung in Drosophila 8 angepasst. Bei diesem Verfahren ist eine Kernhülle Fusionsprotein, das ein Substrat für die in vivo-Biotinylierung coexpressed mit dem Escherichia coli Biotinligase BirA in bestimmten Zelltypen. Biotin-markierte Kerne kann anschließend von Mischpopulationen unter Verwendung von Streptavidin-basierte Affinitätsisolierung gereinigt werden. Unter Verwendung dieses Ansatzes wurden Kerne erfolgreich markiert und aus dem Mesoderm von Drosophila-Embryonen, in dem eine Kernhülle-Fusionsprotein unter der Kontrolle eines Mesoderm-spezifischen Enhancer exprimiert 8 isoliert. Die Autoren erzeugten Kernhüllenfusionsproteine, die in jedem Zelltyp unter der Kontrolle des Gal4 regulatorische Sequenz, UAS 9 ausgedrückt werden kann. Dieser Ansatz ist in der Lage, schnell zu isolieren Teilmengen von markierten Kerne von Mischpopulationen, erfordert aber drei separate transgene Konstrukte und kann daher für bestimmte genetische Anwendungen ungeeignet sein. Vor kurzem wurde ein Ansatz beschrieben, bei dem so (S ad1 und UN-C-84)-Domäne enthalten Proteine, die an der inneren Membran der Kernhülle zu lokalisieren, wurden mit dem Stichwortfluoreszierende Proteine ​​und unter der Steuerung des Systems 10 GAL4/UAS ausgedrückt. Kerne wurden in Gegenwart von nichtionischen Detergens isoliert, um die äußere Membran von der Kernhülle zu entfernen, und affinitätsgereinigt unter Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Anti-GFP-Antikörper gekoppelt. Dieser Ansatz wurde erfolgreich eingesetzt, um kleine Populationen von markierten Kerne von spezifischen neuronalen Subtypen im erwachsenen Gehirn von Drosophila 10 zu isolieren. Hier wird ein Protokoll für die Isolierung der markierten Kerne aus einer gemischten Population von Zellen von Drosophila-Larven Gewebe beschrieben. Diese Methode wurde entwickelt, unabhängig, aber ist ähnlich dem von Henry et al. 10 zuerst beschriebenen Ansatz wurden Kerne mit einer fluoreszierenden Markierung, die nur in bestimmten Zelltypen in Drosophila exprimiert wird, um die anschließende Trennung von markierten Kerne aus gemischten Populationen erleichtern markierten mit einer Affinität-basierten Ansatz. Um Keime zu kennzeichnen,die KASH (K larsicht / A nc-1 / S yn h omology)-Domäne wurde eingesetzt. Die KASH Domäne eine Transmembrandomäne, die an die äußere Membran der Kernhülle, teilweise durch Wechselwirkung mit SUN-Domäne enthaltenden Proteinen innerhalb der perinukleären Raum 11 lokalisiert. Die C-terminale Domäne von KASH Proteine ​​wie Drosophila Msp-300 und Klarsicht verankert diese Proteine ​​an der äußeren Kernmembran, während die N-terminalen Domänen interagieren mit Cytoskelett-Proteine ​​wie Aktin oder Mikrotubuli im Zytoplasma 12-14. Konstrukte wurden erzeugt, in dem die KASH Domäne von Drosophila Msp-300 wurde unter der Kontrolle des Gal4 regulatorische Sequenz, UAS in der pUAST attB-Vektor 15, 16 an den C-Terminus von EGFP fusioniert. Mit phiC31 ortsspezifische Integration wurden transgene Fliegen erzeugt, in dem die UAS-EGFP :: Msp-300-KASH Transgen wurde in der attP2 Loci auf Chromosom eingefügt3L 17. Die FH-EGFP :: Msp-300-KASH fliegt mit Fliegen, die das Gal4-Treiber zum Ausdruck in einem bestimmten Zelltyp, was die gezielte Expression von EGFP auf der äußeren Kernmembran in den Zelltyp von Interesse überquert werden. Markierte Kerne können dann aus gemischten Zellpopulationen mit Antikörpern gegen GFP an magnetische Kügelchen gekoppelt gereinigt werden. In diesem Ansatz wird die Verwendung von nichtionischen Detergens nicht erforderlich, da das EGFP-Tag an der zytoplasmatischen Seite der äußeren Kernmembran lokalisiert, und ist daher für Antikörper zugänglich. Die unten beschriebene Protokoll kann zur Isolierung / bereichern EGFP-markierten Kerne von bestimmten Zelltypen in Drosophila Larvengewebe, um die Reinheit und Ausbeute der isolierten Zellkernen zu quantifizieren und Kern-RNA zu extrahieren geeignet für quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT werden -PCR) Genexpressionsanalyse. Die Isolierung und Reinigung von Affinität-Kerne (ohne tissuPräparation E) kann in weniger als einer Stunde durchgeführt werden. Ergebnisse dargestellt, die die Gliazellen Kerne erfolgreich vom Larvenoptischen Keule und Augen Imaginalscheibe isoliert werden und für nachfolgende Genexpressionsanalyse verwendet. Es ist zu erwarten, dass dieser Ansatz nützlich für die Isolierung / Anreicherung der markierten Kerne aus embryonalen und larvalen Geweben, in denen die Zielzellen weniger als 5% der Gesamtpopulation darstellen können. Alle Drosophila Aktien und Plasmide in dieser klinischen Studie sind von den Autoren auf Anfrage erhältlich.

<table><tbody><tr><td>Anti-Chaoptin-Antikörper (Maus, monoklonal)</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>mAB24B10</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP-Antikörper (Maus, monoklonal)</td><td></td><td>Roche 11814460001</td><td>Für dieses Protokoll wird dieser spezifische Antikörper empfohlen. Es könnten aber auch alternative Antikörper verwendet werden.</td></tr><tr><td>2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix mit ROX</td><td>MidSci</td><td>BEQPCR-R</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochloridsalz)</td><td>Biotium</td><td>40011</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Homogenisator (1 ml)</td><td>VWR</td><td>62400-595</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette, 11 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G für die Immunpräzipitation</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>Für dieses Protokoll wird diese spezielle Marke von magnetischen Beads empfohlen.</td></tr><tr><td>EpiScript Reverse Transkriptase</td><td>Epizentrum</td><td>ERT12910K</td><td><a href="http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf">http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf</a></td></tr><tr><td>Falkenzellsiebe, 40 &mu; m Porengröße</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>Je nach Größe der Zielzellkerne können alternative Porengrößen verwendet werden.</td></tr><tr><td>Magnetischer Ständer (8 x 1,5 ml Tuben)</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Röhren-Rotator</td><td>Genemate</td><td>H-6700</td><td></td></tr><tr><td>Qubit-Starterkit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32871</td><td>Ähnliche fluoreszenzbasierte Methoden zur Quantifizierung der RNA-Ausbeute könnten verwendet werden. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ</a></td></tr><tr><td>RNAsecure (Ambion)</td><td>Life Technologies</td><td>AM7010</td><td>Die Verwendung dieses Reagenzes zur Inaktivierung von RNAsen ist optional.</td></tr><tr><td>RT-PCR-Gerät Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>CFX Connect Thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>Silikonisierte 9-Well-Glasplatte</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-134</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop Fluoreszenzadapter (Königsblau (440-460 nm) Anregung + gelbe Barriere</td><td>Nightsea</td><td></td><td>Dieser Adapter ermöglicht die Untersuchung der GFP-Fluoreszenz mit einem typischen Präpariermikroskop (z. B. Nikon)</td></tr><tr><td>StereoZoom Mikroskop 83604 Set mit 10X Weitfeld-Okularen und Universal-Galgenstativ</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>VORSICHT; Alternative RNA-Extraktionsmethoden können verwendet werden. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf</a></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

affinity-basierte isolierung von tagged kerne aus<em&gt; drosophila</em&gt; tücher für genexpressionsanalyse

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster und embryonalen Geweben der Larven enthalten oft ein sehr heterogenes Gemisch von Zelltypen, die die Analyse der Genexpression in diesen Geweben erschweren kann. Somit zellspezifische Genexpressionsprofile von Drosophila Gewebe zu analysieren, kann es notwendig sein, bestimmte Zelltypen mit hoher Reinheit und in Ausbeuten ausreichend für nachfolgende Anwendungen wie Transkriptionsprofiling und Chromatin-Immunopräzipitation isoliert. Jedoch kann die unregelmäßige Zellmorphologie in Geweben wie dem zentralen Nervensystem, verbunden mit der seltenen Population von spezifischen Zelltypen in diesen Geweben, Herausforderungen für herkömmliche Methoden der Zellisolierung wie Laser Mikrodissektion und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung darstellen (FACS) . Hier wird ein alternativer Ansatz zur Charakterisierung zellspezifische Genexpressionsprofilen unter Verwendung von Affinitäts-basierte Isolierung von markierten Kerne, anstatt ganzer Zellen, beschrieben. Kerne in der spezifischen cell Art von Interesse sind genetisch mit einer Kernhülle lokalisierte EGFP-Tag mit der GAL4/UAS binären Expressionssystem gekennzeichnet. Diese EGFP-markierte Kerne können mit Antikörpern gegen GFP, die an magnetische Kügelchen gekoppelt sind, isoliert werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen Ansatz ermöglicht eine konstante Trennung der Kerne von spezifischen Zelltypen in Drosophila Larven des zentralen Nervensystems bei hoher Reinheit und in ausreichenden Mengen für die Expressionsanalyse, auch wenn diese Zelltypen enthalten weniger als 2% der Gesamtzellpopulation in der Gewebe. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um Kerne aus einer Vielzahl von embryonalen und larvalen Drosophila Zelltypen mit spezifischen Gal4 Treiber zu isolieren, und kann zur Isolierung von Kernen von Zelltypen, die nicht geeignet für die FACS oder Laser Mikrodissektion werden können.

Der Repo-GAL4-Treiber (Bloomington Bestandsnummer 7415) ist speziell in Gliazellen im Nervensystem Drosophila an mehreren Entwicklungsstufen 18 ausgedrückt. Die Fliegen wurden erzeugt, stabil exprimieren UAS-EGFP :: Msp-300-KASH unter der Kontrolle des Repo-GAL4-Treiber mit Standard-genetische Techniken. Um das Expressionsmuster des Transgens EGFP :: KASH in dieser entfernt zu charakterisieren, wurde das Muster der GFP-Expression in den eingeschnittenen Lappens u...

Drosophila-Gewebe enthalten häufig eine heterogene Mischung von Zelltypen. Um die Genexpression in spezifischen Zelltypen aus einem bestimmten Gewebe zu untersuchen, können Keime genetisch markiert und anschließend mit einer Affinität-basierten Ansatz isoliert. Isolierte Kerne für nachgelagerte Anwendungen wie Genexpressionsanalyse und Chromatinimmunpräzipitation verwendet werden.

Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Tücher für Genexpressionsanalyse

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

affinity-based-isolation-tagged-nuclei-from-drosophila-tissues-for

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Das Ziel dieser Publikation ist es, sichtbar zu machen und zu diskutieren, die operativen Schritte einer Enhanced Northern Blot-Protokoll auf RNA aus Drosophila melanogaster Embryonen entnommen, Zellen und Geweben. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für eine effiziente Erkennung von kleinen RNA-Spezies.

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in Drosophila melanogaster

Wir beschreiben eine Multi-Target-chromogenen ganze-mount in situ Hybridisierung (MC-WISH) Verfahren in intakten Drosophila-Embryos eine gleichzeitige und spezifischen Nachweis von drei verschiedenen mRNA-Verteilungsmuster durch Kontrastfarbe Niederschläge.

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung zum Vergleich Genexpression Domains in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

Die beschriebenen RNA in Situ Hybridisierung Protokoll ermöglicht die Erkennung von RNA in ganze Drosophila Embryos oder seziert Gewebe. Mit 96-Well-Mikrotiterplatten und Tyramide Signalverstärkung, können Protokolle mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Durchsatz und bei relativ geringen Kosten erkannt werden.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Heterochromatin-Aggregate in Drosophila-Polyten-Zellen zu visualisieren.

Immunfluoreszierende Färbung zur Visualisierung von Heterochromatin-assoziierten Proteinen in Drosophila Speicheldrüsen

Hier stellen wir ein vereinfachtes endogenes Gen-Tagging-Protokoll für Drosophila vor, das eine PCR-basierte Technik zur markerfreien Identifizierung erfolgreicher genetischer Veränderungen verwendet und die Entwicklung stabiler Knock-in-Linien erleichtert.

Einstufige CRISPR-basierte Strategie zur endogenen Genmarkierung in Drosophila melanogaster

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Präparation von Zellkernen beschreibt. Nach Mikrodissektion und enzymatischer Dissoziation von Herzgewebe in Einzelzellen wurden die Vorläuferzellen eingefroren, gefolgt von der Isolierung von reinen lebensfähigen Zellen, die für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung und den Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalysen verwendet wurden.

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Expansion-Assisted Itercence In Situ Hybridization (EASI-FISH) ist eine robuste Technik, die Expansionsmikroskopie mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kombiniert, um die Expression mehrerer Gene in dickem Gewebe nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt die jüngsten Fortschritte in der Methode und ihre Anpassung an die Markierung des intakten Drosophila-Zentralnervensystems.

Multiplex-Detektion der Genexpression im intakten Drosophila-Gehirn mittels expansionsunterstützter iterativer Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Das Protokoll beschreibt die SNP-FISH-Methode (Single Nucleotide Polymorphisms) zur Unterscheidung ribosomaler RNA-Transkripte, die vom ribosomalen DNA-Locus des X- oder Y-Chromosoms in Drosophila melanogaster abgeleitet sind.

Einzelnukleotid-Polymorphismus-sensitiver FISH-Nachweis der lokusspezifischen ribosomalen RNA-Transkription in Drosophila melanogaster

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die erforderlich sind, um die Hybridisierungskettenreaktion mit fluoreszierender In-situ-Hybridisierung (HCR-FISH) in den optischen Lappen der Drosophila melanogaster-Larve durchzuführen. Verfahren für Sondendesign, Hybridisierung, Amplifikation und Gewebemontage werden detailliert beschrieben, um die Visualisierung des sich entwickelnden Optikuslappens zu erleichtern.

Hybridisierungskettenreaktion FISH im sich entwickelnden Drosophila-Optikuslappen

Lernen Sie die Affinitätsbasierte Isolierung markierter Kerne aus Drosophila-Geweben für Genexpressionsanalysen. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen spezifischer Zelltypen.

Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus

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