Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Menge an neu synthetisierter RNA unter Behandlungsbedingungen mithilfe einer quantitativen Bildanalyse fluoreszenzmarkiert darzustellen und zu quantifizieren. Kultivierte Zellen, die auf Deckgläsern ausgesät wurden, werden mit der alkinmodifizierten Base behandelt. Fünf Etal-Uridin, im Folgenden als fünf EU bezeichnet, und unter hypoxischen Bedingungen inkubiert.

Während der Inkubation wird fünf EU bei der RNA-Synthese eingebaut, ohne die zelluläre Transkriptionsmaschinerie zu stören. Anschließend wird das eingebaute fünf EU durch eine kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition, auch Click-Reaktion genannt, fluoreszenzmarkiert. Die so fluoreszenzmarkierte neu synthetisierte RNA wird dann mittels Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, und die entstandenen Bilder werden analysiert, um die Menge an RNA unter Behandlungs- und Kontrollbedingungen zu vergleichen.

Die statistische Analyse der resultierenden Daten zeigt die Veränderungen in der neu gebildeten RNA-Produktion als Reaktion auf Hypoxie durch Quantifizierung der fünf EU-Inkorporierungen und deren Nachweis mittels Fluoreszenzmikroskopie. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der quantitativen BCR besteht darin, dass sie eine direkte Visualisierung der RNA-Produktion in Zellen auf Einzelzell-Ebene ermöglicht. Obwohl wir diese Methode hier verwenden, um zu untersuchen, wie Zellen auf niedrigen Sauerstoffgehalt reagieren, kann sie auch zur Untersuchung von Reaktionen auf chemotherapeutische Wirkstoffe eingesetzt werden.

Unsere Reaktionen auf zusätzliche Stressreaktionen, die ein Verfahren demonstrieren, werden John Leston, ein Doktorand aus meinem Labor, unterstützt von Ish Kova, ebenfalls ein Doktorand, und Humana Druker, eine Postdoktorandin, durchführen. Schließlich wird Gus Ferguson die Verwendung von Bildvisualisierungssoftware demonstrieren. Beginnen Sie dieses Experiment, indem Sie mehrere Deckgläser zur Sterilisation in 70 % Ethanol eintauchen.

Legen Sie die Deckgläser auf den Rand einer Platte im Zellkulturwerkbank und lassen Sie sie unter laminarer Luftströmung trocknen. Sobald die Deckgläser trocken sind, geben Sie jeweils eines in sechs 3,5-Zentimeter-Dishs. Fügen Sie zwei Milliliter warmes komplettes DMEM zu jedem Dish hinzu.

Drücken Sie mit der Pinzette nach unten, um sicherzustellen, dass jede Deckglasplatte am Boden der Vertiefung haftet. Um die U2-OS-Zellen von der Zellkulturschale zu lösen, waschen Sie einmal mit drei Milliliter PBS. Geben Sie anschließend vier Milliliter warme 0,05 %ige Trypsin, 1 %ige EDTA-Lösung hinzu und inkubieren Sie sieben Minuten bei 37 Grad Celsius.

Nachdem sieben Minuten vergangen sind, resuspendieren Sie die Zellen in sechs Milliliter warmem, vollständigem DMEM, um die Trypsin-EDTA-Behandlung zu stoppen. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers und säen Sie auf jede der 3,5-Zentimeter-Dishs, die Deckgläser enthalten, jeweils zwei mal 10 hoch 5 Zellen aus. Schwenken Sie das Dish vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen sicherzustellen, und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius, 21 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid, damit die Zellen anheften können.

Am nächsten Tag entnehmen Sie fünf der Schalen aus dem Inkubator. Die verbleibende Schale bleibt unberührt. Sie dient als normoxische positive Kontrolle.

Platzieren Sie vier der Schalen in die Hypoxie-Arbeitsstation. Exponieren Sie die Zellen 75 Minuten, 90 Minuten, zwei Stunden und 24 Stunden lang gegenüber hypoxischen Bedingungen. Zur anderen Schale.

Fügen Sie Actinomycin D dem Medium in einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter hinzu und stellen Sie es für vier Stunden in den 37-Grad-Inkubator unter normalen Sauerstoffbedingungen zurück. Diese Petrischale dient als normoxische Negativkontrolle. Während die Zellen inkubieren, bereiten Sie die folgenden Reagenzien für den Click-It-Assay vor und sammeln Sie diese.

Das Click-it-Assay-Kit PBS mit einem pH-Wert von 7,2 bis 7,6, 3,7 % Paraformaldehyd in PBS, 1 % Triton X-100 in PBS, deionisiertes Wasser, Dimethylsulfoxid, 10 molare Natronlauge, 37 % Salzsäure und pH-Indikatorstreifen. Planen Sie, bereit zu sein, mit der Markierung eines Assays unter unbehandelten Bedingungen zu beginnen. Eine Stunde vor dem Ende der Hypoxiebehandlung bereiten Sie zur Zellmarkierung eine 2×-Arbeitslösung von EU aus dem 100 Millimolar-Standard in vorgewärmtem komplettem Medium vor.

Fügen Sie anschließend ein gleiches Volumen von zwei XEU zum Medium in der Schale mit den mit Actinomycin D behandelten Zellen hinzu, wodurch das EU auf die Arbeitskonzentration verdünnt wird. Danach geben Sie im Hypoxiekammer das EU-Standardpräparat zu den unter Hypoxie behandelten Zellen hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde lang unter den Zellkultur-Behandlungsbedingungen nach der Hypoxiebehandlung bzw. vier Stunden lang für die Kontrollen.

Waschen Sie jede Platte einmal mit PBS und geben Sie ein Milliliter der 3,7 %igen Paraformaldehyd-Stammlösung unter den Behandlungsbedingungen hinzu. Inkubieren Sie 15 Minuten unter den Behandlungsbedingungen. Entfernen Sie nach der Fixierung die Zellen aus der Hypoxiekammer und stellen Sie sie in die Abzugshaube. Gießen Sie das Fixativ vorsichtig ab und entsorgen Sie das Paraformaldehyd-Abfallmaterial umweltgerecht.

Waschen Sie die Zellen anschließend einmal mit PBS. Führen Sie die folgenden Schritte bei Raumtemperatur durch, wobei alle Lösungen auf Eis bei zwei bis sechs Grad Celsius gehalten werden. Um die Zellen zu permeabilisieren, entfernen Sie die Waschlösung und geben je Weilchen ein Milliliter 1 % Triton X-100 in PBS hinzu und inkubieren 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie den Permeationspuffer und waschen Sie jede Vertiefung einmal mit PBS. Entfernen Sie die Waschlösung von den Zellen und geben Sie 500 µL frisch zubereitete Reaktionsmischung aus dem RNA-Nachweiskit zu jeder Probe hinzu. Schützen Sie die Zellen vor Licht und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach der Inkubation entfernen Sie die Reaktion des RNA-Bildgebungssatzes sowie die Cocktail- und Waschschritte. Einmal mit einem Milliliter Reaktion des RNA-Bildgebungssatzes spülen; Puffer, zusätzliche Antikörpermarkierungen sollten zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden. Zum Färben der DNA waschen Sie die Proben mit PBS und verdünnen anschließend Herst 3,3,3,4,2 im Verhältnis 1 zu 1000.

In PBS geben Sie je einen Milliliter der verdünnten HERC-Lösung hinzu. Gut vor Licht schützen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation die HERC-Lösung entfernen und die Zellen zweimal mit PBS waschen, um die Deckgläser aufzubringen.

Geben Sie 10 Mikroliter Eindeckmedium in die Mitte eines standardmäßigen Mikroskops. Plazieren Sie den Deckgläser mit der Zellseite nach unten auf dem Tropfen Eindeckmedium. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen, da diese die anschließende Bildaufnahme beeinträchtigen würden.

Tragen Sie klaren Nagellack am Rand des Deckgläschens auf, um es auf dem Objektträger zu befestigen. Lassen Sie den Nagellack fünf Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Lichtgeschützt können die Proben bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Nach dem Eindecken gewinnen Sie Bilder mithilfe eines Weitfeldmikroskops, das zur Fluoreszenzerkennung fähig ist. Führen Sie die Bildaufnahme mit einem 40-V-Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,30 durch und erfassen Sie die Bilder mit einer gekühlten CCD-Kamera. Mindestens 30 Zellen nach der Bildaufnahme.

Verwenden Sie Bildverarbeitungssoftware, um die Bilder zu verarbeiten. Dadurch wird eine Korrektur optischer Verzerrungen durch Anwendung einer softwarebasierten mathematischen Formel auf die aufgenommenen Bilder erreicht. Das Ergebnis ist ein schärferes Bild, das sicherstellt, dass die anschließende Analyse nur auf die abgebildeten Zellen beschränkt bleibt.

Importieren Sie als Nächstes die Bilder in den Omer-O-Client. Miniaturansichten aller aufgenommenen Bilder werden angezeigt, um die Darstellungseinstellungen für alle Bilder desselben Experiments zu normalisieren. Wenden Sie die Darstellungseinstellungen von kontrollierten normoxischen Zellen auf alle anderen Bedingungen mithilfe des Werkzeugs für den interessierenden Bereich (ROI) in der Analyse-Software an.

Wählen Sie Kerne aus jedem Bild in der Software aus. Aktivieren Sie die Option zur Intensitätsanalyse und ermitteln Sie die mittleren Intensitäten für jede ROI für 30 bis 50 Zellen. Speichern Sie die Daten und berechnen Sie anschließend den Mittelwert und die Standardabweichung für jede Bedingung.

Schließlich werden mithilfe von Datenvisualisierungs-Software Streudiagramme aller individuellen mittleren Intensitätswerte erstellt, um die Variabilität zwischen Zellen unter jeder Bedingung widerzuspiegeln. Die Auftragung der Intensitätsdaten in dieser Weise ist nützlich, da sie einen schnellen Vergleich der Behandlungsergebnisse ermöglicht und deutlich signifikante Heterogenität innerhalb einer Behandlungs-Zellpopulation aufzeigt, die bei Verwendung standardmäßiger Datenrepräsentation andernfalls verborgen bliebe. Alternativ können Balkendiagramme erstellt werden, um die durchschnittliche mittlere Intensität zuzüglich der Standardabweichung der neu synthetisierten RNA darzustellen, um die gesamte RNA-Synthese quantitativ zu bestimmen. U2-OS-Zellen, die mit Hypoxie behandelt und in Gegenwart von 5-ethynyluridin oder EU kultiviert wurden, wurden anschließend aufgearbeitet und analysiert.

Wie in diesem Video gezeigt, wurden die Fluoreszenzintensitäten aller Zellen innerhalb jeder Behandlungsgruppe gemittelt und dargestellt. In diesem Balkendiagramm wurde ein Student-t-Test verwendet, um die statistische Signifikanz des Unterschieds jeder Behandlungsgruppe gegenüber der Kontrolle zu berechnen. Interessanterweise zeigen diese Daten einen statistisch signifikanten Anstieg der globalen RNA-Synthese über die Zeit hinweg.

Wenn U2-OS-Zellen länger als anderthalb Stunden wie erwartet Hypoxie ausgesetzt werden, beseitigt die Behandlung mit Actinomycin D die Fluoreszenzintensität vollständig. Diese Daten legen nahe, dass die Zelle nach längeren Phasen der Hypoxie-Behandlung ihre Aktivitäten auf die Produktion von RNA konzentriert, selbst in dieser ungünstigen hypoxischen Umgebung. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man neu synthetisierte RNA auf Einzelzell-Ebene unter Hypoxie und Normoxie markieren und quantifizieren kann. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von zwei Stunden nach dieser Anleitung durchgeführt werden.

Andere Methoden wie eine gleichzeitige Färbung mit Antikörpern gegen die RNA-Polymerase und HIF können durchgeführt werden, um festzustellen, ob sich die Konzentrationen der RNA-Polymerase verändern und ob HIF aktiviert ist. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Formaldehyd bei Durchführung dieses Verfahrens äußerst gefährlich sein kann. Tragen Sie stets Handschuhe und arbeiten Sie im Abzug.