Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Menge an naszierender RNA, die unter Behandlungsbedingungen produziert wird, mit Hilfe quantitativer bildgebender Analysen fluoreszierend zu markieren und zu quantifizieren. Kultivierte Zellen, die auf Deckglas plattiert sind, werden mit der alkein modifizierten Basis behandelt. Fünf Etaluridin, im Folgenden als fünf EU bezeichnet, wurden unter hypoxischen Bedingungen inkubiert.

Während der Inkubation werden fünf EU während der RNA-Synthese eingebaut, ohne die zelluläre Transkriptionsmaschinerie zu unterbrechen. Als nächstes werden die eingebauten fünf EU fluoreszenzmarkiert, indem eine kupferkatalysierte Azid-Ain-Cyclo-Edition oder Click-Reaktion durchgeführt wird. Die fluoreszenzmarkierte naszierende RNA wird dann durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet und die resultierenden Bilder werden analysiert, um die Menge an RNA zu vergleichen, die unter Behandlungs- und Kontrollbedingungen erzeugt wurde.

Die statistische Analyse der resultierenden Daten zeigt die Veränderungen in der naszierenden RNA-Generation als Reaktion auf Hypoxie durch Quantifizierung von fünf EU-Inkorporation und Nachweis durch Fluoreszenzmikroskopie. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der quantitativen BCR besteht darin, dass sie eine direkte Visualisierung der RNA-Produktion in Zellen auf Einzelzellebene ermöglicht. Obwohl wir diese Methode hier verwenden, um zu untersuchen, wie Zellen auf wenig Sauerstoff reagieren, kann sie auch verwendet werden, um Reaktionen auf Chemotherapeutika zu untersuchen.

Unsere Antworten auf zusätzliche Stressreaktionen, die ein Verfahren demonstrieren, sind John Leston, ein Doktorand aus meinem Labor mit Hilfe von ish Kova, ebenfalls ein Doktorand, und Humana Druker, eine Postdoktorandin. Zum Schluss demonstriert Gus Ferguson den Einsatz von Bildvisualisierungssoftware. Beginnen Sie dieses Experiment, indem Sie mehrere Deckgläser in 70%iges Ethanol tauchen, um sie zu sterilisieren.

Legen Sie die Deckgläser auf den Rand einer Platte in der Gewebekulturhaube und lassen Sie sie unter laminarer Strömung an der Luft trocknen. Sobald die Deckgläser trocken sind, legen Sie je eine in die sechs 3,5 Zentimeter großen Schalen. Geben Sie zwei Milliliter warmes komplettes DMEM in jedes Gericht.

Drücken Sie mit einer Pinzette nach unten, um sicherzustellen, dass jeder Deckglas am Boden der Vertiefung haftet. Anschließend die U2 OS-Zellen aus der Gewebekulturschale lösen: Einmal mit drei Millilitern PBS waschen. Tragen Sie dann vier Milliliter warmes 0,05 % Trypsin, 1 % EDTA auf und inkubieren Sie sieben Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Nachdem die Resus-Phase sieben Minuten bestanden hat, suspendieren Sie die Zellen in sechs Millilitern warmem, vollständigem DMEM, um das Trypsin-EDTA zu inaktivieren. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer-Seed für jede der 3,5 Zentimeter großen Schalen mit Deckgläsern mit zweimal 10 bis zu den fünften Zellen. Schütteln Sie die Schale vorsichtig, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu gewährleisten. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius, 21 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid, damit die Zellen haften können.

Nehmen Sie am nächsten Tag fünf der Schalen aus dem Inkubator. Lassen Sie die restliche Schüssel ungestört. Es wird als normoxische Positivkontrolle verwendet.

Stellen Sie vier der Schalen in den Hypoxie-Arbeitsplatz. Setzen Sie die Zellen 75 Minuten, 90 Minuten, zwei Stunden und 24 Stunden lang hypoxischen Bedingungen aus. Zum anderen Gericht.

Geben Sie Acton Mycin D bis zu einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter in das Medium und stellen Sie es wieder für vier Stunden unter normalen Sauerstoffbedingungen in den 37-Grad-Inkubator. Diese Schale fungiert als normoxische Negativkontrolle. Während die Zellen inkubieren, bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor und sammeln Sie sie zur Vorbereitung auf den Click-it-Assay.

Das Click it Assay-Kit: PBS bei einem pH-Wert von 7,2 bis 7,6, 3,7 % Paraformaldehyd in PBS, 1 % Triton X 100 in PBS, deionisiertes Wasser, Dimethylsulfoxid, 10 molare Natriumhydroxide, 37 % Salzsäure und pH-Indikatorstreifen. Sie sollten planen, bereit zu sein, mit einer markierten und assay-unterbehandelten Erkrankung zu beginnen. Eine Stunde vor Beendigung der Hypoxie-Behandlung: Um die Zellen zu markieren, bereiten Sie eine zweifache Arbeitslösung von EU aus dem 100-Millimolar-Stamm in einem vorgewärmten vollständigen Medium vor.

Als nächstes wird dem Medium in der Schale, die die mit Acton Mycin D behandelten Zellen enthält, ein gleiches Volumen von zwei XEU zugegeben, wodurch das EU auf die Arbeitskonzentration verdünnt wird. Geben Sie dann in der Hypoxiekammer den EU-Bestand zu den mit Hypoxie behandelten Zellen. Inkubieren Sie eine Stunde lang unter Behandlungszellkulturbedingungen nach der Hypoxiebehandlung oder nach vier Stunden für die Kontrollen.

Waschen Sie jedes Geschirr einmal mit PBS und fügen Sie unter Behandlungsbedingungen einen Milliliter des 3,7%igen Paraformaldehydstocks hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang unter Behandlungsbedingungen. Entfernen Sie nach der Fixierung die Zellen aus der Hypoxiekammer und legen Sie sie in den Abzug. Gießen Sie das Fixiermittel ab und achten Sie darauf, die para-Formaldehyd-Abfälle verantwortungsbewusst zu entsorgen.

Waschen Sie dann die Zellen einmal mit PBS. Führen Sie die nächsten Schritte bei Raumtemperatur durch und halten Sie alle Lösungen auf Eis bei zwei bis sechs Grad Celsius. Neben dem Permeieren der Zellen die Waschlösung entfernen und jeweils einen Milliliter 1%tritton X 100 in PBS hinzufügen, 15 Minuten bei Raumtemperatur gut inkubieren.

Entfernen Sie den Permeationspuffer und waschen Sie jede Vertiefung einmal mit PBS. Entfernen Sie die Waschlösung aus den Zellen und fügen Sie jeder Probe 500 Mikroliter des frisch zubereiteten RNA-Bildgebungskit-Reaktionscocktails hinzu. Schützen Sie die Zellen vor Licht und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie nach der Inkubation die RNA-Bildgebungskit-Reaktion, den Cocktail und waschen Sie sie. Einmal mit einem Milliliter RNA-Bildgebungskit Reaktion, Spülung, Puffer und jede zusätzliche Antikörpermarkierung sollte zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden. Um die DNA zu färben, waschen Sie die Proben mit PBS und verdünnen Sie dann die Proben 3, 3, 3, 4, 2 auf eins bis 1000.

In PBS fügen Sie jeweils einen Milliliter der verdünnten HERC-Lösung hinzu. Gut vor Licht schützen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation die HERC-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, um die Deckgläser zu montieren.

Legen Sie 10 Mikroliter Eindeckmedium auf die Mitte eines Standardmikroskops. Schieben Sie die Abdeckung mit der Zellenseite nach unten auf den Tropfen des Eindeckmediums. Vermeiden Sie die Erzeugung von Blasen, da dies die spätere Bildaufnahme verdeckt.

Tragen Sie Klarlack auf den Umfang des Deckglases auf, um es auf dem Objektträger zu fixieren. Lassen Sie den Lack fünf Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Geschützt vor Licht können Proben bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Nach der Montage können Sie Bilder mit einem Weitfeldmikroskop aufnehmen, das Fluoreszenzdetektion ermöglicht. Führen Sie die Bildgebung mit einem 40-V-Ölimmersionsobjektiv mit 1,30 NA durch und nehmen Sie Bilder mit einem gekühlten CCD-Kamerabild auf. Mindestens 30 Zellen nach der Bildaufnahme.

Verwenden Sie eine Bildverarbeitungssoftware, um die Bilder zu dezentralisieren. Dadurch wird die optische Verzerrung korrigiert, indem eine softwarebasierte mathematische Formel auf die aufgenommenen Bilder angewendet wird. Das Ergebnis ist ein klareres Bild, das sicherstellt, dass die nachfolgende Analyse nur auf die abgebildeten Zellen beschränkt ist.

Importieren Sie anschließend die Bilder in den Omer O-Client. Daneben werden Miniaturansichten aller erhaltenen Bilder angezeigt, um die Rendering-Einstellungen für alle Bilder im selben Experiment zu normalisieren. Wenden Sie die Rendering-Einstellungen aus normoxischen Kontrollzellen auf alle anderen Bedingungen an, indem Sie das ROI-Werkzeug für den Interessenbereich in der Analysesoftware verwenden.

Wählen Sie Kerne aus jedem Bild in der Software aus. Wählen Sie die Option "Intensitätsanalyse" und erhalten Sie die mittleren Intensitäten für jeden ROI für 30 bis 50 Zellen. Speichern Sie die Daten, und berechnen Sie dann den Durchschnitt und den Standard für jede Bedingung.

Schließlich werden mit Hilfe von Datengrafiksoftware Streudiagramme aller einzelnen mittleren Intensitätswerte erstellt, um die Variabilität zwischen den Zellen unter jeder Bedingung widerzuspiegeln. Die Darstellung von Intensitätsdaten auf diese Weise ist nützlich, da sie einen schnellen Vergleich der Behandlungsergebnisse ermöglicht und deutlich eine signifikante Heterogenität innerhalb einer Behandlungszellpopulation zeigt, die sonst durch die Standarddatendarstellung verdeckt wird. Alternativ können Balkendiagramme erstellt werden, um die durchschnittliche mittlere Intensität plus die Standardabweichung der naszierenden RNA darzustellen, um die Gesamt-RNA-Synthese U2 OS-Zellen quantitativ zu bestimmen, die mit Hypoxie behandelt und in Gegenwart von fünf Aluridin oder EU kultiviert wurden, wurden dann verarbeitet und analysiert.

Wie in diesem Video gezeigt, wurden die Fluoreszenzintensitäten aller Zellen innerhalb jeder Behandlungspopulation gemittelt und aufgetragen. In diesem Balkendiagramm wurde der T-Test eines Studenten verwendet, um die statistische Wahrscheinlichkeit zu berechnen, dass sich jede Behandlungsgruppe signifikant von der Kontrolle unterscheidet. Interessanterweise zeigen diese Daten, dass es im Laufe der Zeit einen statistisch signifikanten Anstieg der globalen RNA-Synthese gibt.

Wenn U2-OS-Zellen wie erwartet länger als anderthalb Stunden mit Hypoxie behandelt werden, hebt die Behandlung mit ACTO Mycin D die Fluoreszenzintensität vollständig auf. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Zelle nach längerer Hypoxie-Behandlung ihre Bemühungen auf die Produktion von RNA konzentriert, selbst in dieser feindlichen hypoxischen Umgebung. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man naszierende RNA auf Einzelzellebene bei Hypoxie und Normoxie markiert und quantifiziert. Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie in zwei Stunden nach diesem Verfahren durchgeführt werden.

Andere Methoden, wie z.B. die Co-Färbung mit Antikörpern für RNA-Polymerase und HIF, können durchgeführt werden, um festzustellen, ob die RNA-Polymerase-Spiegel verändert sind und ob HIF aktiviert ist. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Formaldehyd bei der Durchführung dieses Verfahrens äußerst gefährlich sein kann. Achten Sie immer darauf, Handschuhe zu tragen und in einem Abzug zu arbeiten.