Einzel-Wellenlänge Schatten von Imaging

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die vertikale Bahn­geschwindigkeit sowie die Kräfte zu messen und zu bewerten, die von einem frei schwimmenden Fadenwurm unter Verwendung kohärenter monochromatischer Strahlung ausgeübt werden. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Schatten­experiment mit kohärenter monochromatischer Strahlung für frei schwimmende Sea Elegance aufgebaut wird. Anschließend wird ein einzelner erwachsener Sea Elegance in die Beobachtungskammer des Schattenexperiments gebracht, die ein Vet ist.

Der Schatten des Wurms, während er durch den Laserstrahl sinkt, wird als Video aufgezeichnet, und dieses Video wird zur Analyse der Bewegung des Tieres verwendet. Auf diese Weise werden der Weg eines frei schwimmenden Nematoden und die damit verbundenen erzeugten Kräfte bestimmt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der traditionellen Mikroskopie in einer horizontalen Ebene, besteht darin, dass die Bewegung frei schwimmender Mikroorganismen mithilfe eines breiten Spektrums monochromatischen Lichts kostengünstig untersucht werden kann.

Diese Methode kann wichtige Fragen zu Kräften beantworten, die von Nematoden in einer Flüssigumgebung erzeugt oder auf die sie reagieren. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir erstmals die Vorstellung einer vertikalen Bewegung für mikroskopische Arten erforschten. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Verfahrensschritte schwer zu erlernen sind, weil es etwas Übung erfordert, die Laserjustierung korrekt vorzunehmen.

Außerdem ist etwas Zeit im Biolabor erforderlich, um zu lernen, wie man die Würmer präpariert, und den experimentellen Aufbau zur Erzeugung von Schattenbildern zusammenstellt. Leiten Sie den Helium-Neon-Laser mithilfe von zwei oder mehr Spiegeln in den Galileischen Strahlexpander, wo er auf 12 Millimeter anwachsen sollte. Platzieren Sie ein oder zwei Nadellöcher im Strahlengang, um die Ausrichtung des Strahls vom Expander zu gewährleisten.

Leiten Sie den Strahl zu einer montierten Quarz-Q-Zelle. Nachdem der Strahl durchgelaufen ist, vergrößert die Q-Zelle ihn mithilfe einer plankonvexen Linse mit einer positiven Brennweite von 75 Millimetern. Positionieren Sie anschließend einen Schirm in einem Abstand von etwa 120 Zentimetern von der Linse, was der optimalen Auflösungsentfernung entspricht.

Platzieren Sie eine Hochgeschwindigkeitskamera so, dass sie den Bildschirm aufnehmen kann, beispielsweise neben dem Q-Vet. Ein Stereomikroskop zum Auswählen der Würmer sollte ebenfalls in der Nähe des QVE stehen. Befestigen Sie vorübergehend ein transparentes Lineal mit Millimetereinteilung in der Mitte des QVAD-Halters auf dem Bildschirm nahe dem Rand des Sichtfelds der Kamera.

Verwenden Sie die Linien des Lineals, um den Skalenabstand für einen Millimeter zu markieren. Tun Sie dies für jede verwendete Wellenlänge, da die Brechung aufgrund chromatischer Aberrationen im QV und Änderungen der Vergrößerung, wie zuvor beschrieben, variieren wird. Halten Sie in JoVE junge adulte Nematoden für das qve bereit.

Bereiten Sie außerdem Nematoden vor, die durch Chloroformexposition gestorben sind. Füllen Sie zunächst den Q Vet mit destilliertem Wasser bis auf einen Millimeter unter den Rand. Beginnen Sie eine Aufnahme, während die Raumbeleuchtung eingeschaltet ist, sodass die Linie auf dem Bildschirm zunächst sichtbar ist, und schalten Sie dann das Licht im Raum aus.

Sammeln Sie dann einen Fadenwurm mit einem Platindraht. Es ist wichtig, die Würmer durch leichtes Berühren der Wasseroberfläche mit dem Draht in das Veto-Präparat zu überführen, ohne das Medium zu bewegen. Das projizierte Bild des Wurms und der Wassersäule ist invertiert.

Würmer, die mit der Schwerkraft abwärts wandern, erscheinen auf dem Bildschirm nach oben zu kriechen. Nehmen Sie für jeden Wurm etwa 20 Sekunden auf und zeichnen Sie etwa 50 Würmer pro Bedingung auf. Importieren Sie zunächst das Video in das Videoanalyseprogramm.

Stellen Sie den Maßstab mithilfe der Längenmarkierungen im Video ein, um den Vergrößerungsfaktor zu bestimmen. Beginnen Sie dann mit der Verfolgung der linearen Verschiebung des Kopfes des schattierten Nematoden. Wählen Sie mindestens 10 Datenpunkte entlang des zurückgelegten Weges aus, etwa alle 0,3 Sekunden einen.

Die vertikale Geschwindigkeit wird anschließend aus dem Quotienten der Ableitung und dem Vergrößerungsfaktor berechnet. Es ist entscheidend, separate Kurven für die horizontale und die vertikale Verschiebung zu erstellen, da die Schwerkraft nur in vertikaler Richtung wirkt.

Wenn die Datenpunkte eine im Allgemeinen gerade Linie bilden, ist der Pfad linear. Geringfügige Abweichungen durch Kopfbewegungen können ignoriert werden. Erstellen Sie anschließend über das Analysemenü eine lineare Regressionsgerade, indem Sie eine Gerade an die Daten anpassen.

Die Steigung der Geraden entspricht der vertikalen Geschwindigkeit des Wurms. Wenn sich ein Wurm nichtlinear bewegt, wählen Sie im Analysemenü die Kurvenanpassung aus. Passen Sie die Kurve dann an eine Funktion zweiter oder dritter Ordnung an.

Polynom für jede Kurve im Pfad, um eine Kurve an die Daten anzupassen. Durch Verschieben der Klammern auf jeder Seite des Graphen wird der mathematische Ausdruck der Kurve angezeigt. Ein relativer Fehler von bis zu 15 % ist hier akzeptabel.

Fügen Sie nach Bedarf zusätzliche Kurven hinzu, um die Datenpunkte abzudecken, und versuchen Sie, die Funktionen zu splinen. Die Kurvenanpassungen sollten an den Überlappungsbereichen die gleiche Steigung aufweisen. Die erste und zweite Ableitung der Kurve liefert die Geschwindigkeit bzw. die Beschleunigung.

Der Schub wird unter Verwendung von drei Mikrogramm als Masse des Wurms beim Driften berechnet; es gab keinen erkennbaren Unterschied in den Abstiegsraten von lebenden und toten See-Elegance. Die Abwärtsdriftrate betrug für beide 1,5 Millimeter pro Sekunde. Lebende Nematoden hingegen können die Richtung ändern und gegen die Schwerkraft schwimmen. Kurven werden an die vertikale Verschiebung des Nematoden angepasst, und die Beschleunigung wird aus deren zweiten Ableitungen berechnet.

Die Kräfte, die auf den Wurm wirken, bis dieser den Umkehrpunkt erreicht, sind Schwerkraft, Widerstandskraft, Auftrieb und Vortrieb. Die resultierende Kraft entspricht ihrer vektoriellen Summe. Betrachten Sie die vertikalen Kraftkomponenten.

Die Gravitationskraft ist betragsmäßig gleich der Auftriebskraft, unter der Annahme, dass der Wurm etwa die Dichte von Wasser besitzt, sodass die Gleichung bis zum Umkehrpunkt vereinfacht werden kann. Der Widerstand plus der Schub sind konstant. Zunächst ist der Widerstand größer, nimmt jedoch allmählich auf null ab, während der Schub am Umkehrpunkt zunimmt; während des Wurms wirkt kein vertikaler Widerstand, da der Schub nach oben gerichtet ist.

Der vertikale Aufstiegserfahrungswiderstand nimmt in abwärts gerichteter Richtung zu, daher muss die Schubkraft größer sein als Widerstand plus Gewichtskraft. Der nichtlineare Pfad dieses Wurms wurde analysiert. Er wechselte die Richtung.

Betrachtet man die Verschiebung, so verlangsamte es sich und begann bei 68 Sekunden, umzukehren. Die nach oben gerichtete Beschleunigung nahm jedoch kontinuierlich ab, bis die resultierende Beschleunigung bei 68,5 Sekunden null erreichte. Danach begann es, in negative Richtung zu beschleunigen und erneut abzusteigen.

Daher hatte der Wurm bei einer Geschwindigkeit von null einen signifikanten Auftrieb, der auf 1,32 Pikonewton berechnet wurde. Sobald man die Methode beherrscht, können die Daten innerhalb von 10 Minuten aufgenommen werden, sofern die Würmer bereit sind, vom Förderband abgeholt zu werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Kameraaufzeichnungsrate für alle aufgenommenen Daten konstant zu halten, da wir die Bildfrequenz im Videoanalyseprogramm nach diesem Verfahren anpassen müssen. Mit dieser Vorgehensweise können weitere Untersuchungen durchgeführt werden, beispielsweise Einzelwellenlängenstudien, um Fragen zu beantworten wie, welche Kräfte in verschiedenen Richtungen – vertikal und horizontal – ausgeübt werden.

Beispielsweise könnte diese optische Technik von anderen Biologen, die an den Bewegungseigenschaften kleiner Organismen wie Proti oder anderen aquatischen Una interessiert sind, verwendet werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine ziemlich gute Vorstellung davon haben, wie man die Bewegung frei schwimmender Mikroorganismen mithilfe der Vergrößerung von Schattenbildern und anschließend eines Videoanalyseprogramms analysiert.