Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in Xenopus Egg Extract

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, das zellfreie biochemische Xenopus-Ei-Extrakt-System zu verwenden, um Beta-Catine im Umsatz zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mutmaßliche Effektoren zu aktiviertem xip-Ei-Extrakt hinzugefügt und/oder depletiert werden, um Modulatoren des Beta-Catenin-Umsatzes zu identifizieren. In einem zweiten Schritt wird in vitro exogenes, transkribiertes und translatiertes Beta-Catenin, entweder mit S 35 radioaktiv markiert oder mit Luciferase fusioniert, an den XUS-Ei-Extrakt gegeben, der unter nativen Bedingungen aktiv abgebaut wird. Sammeln Sie als Nächstes Zeitpunkte, um Veränderungen des Beta-Katin- und Proteinspiegels im Laufe der Zeit zu bewerten.

Es werden Ergebnisse erhalten, die zeigen, ob eine bestimmte Modulation von Xenopus-Ei-Extrakt die Raten von Beta-Catine und den Abbau auf der Grundlage der Autoradiographie und/oder Lumineszenzdetektion erhöht oder verringert. Der Vorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden, wie z. B. Puls-Chase- oder Cycl-Heide-Chase-Experimenten in kultivierten Zellen, besteht darin, dass der Xenopus-Ei-Extrakt ein zellfreies biochemisches System bietet, in dem man die Proteinregulation auf Proteinebene analysieren kann, und dass ihm die zusätzliche Komplexität der aktiven Transkription fehlt. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen im Bereich der Signaltransduktion zu beantworten, indem sie Regulatoren von wichtigen Signalproteinen wie Beta-Catina identifiziert.

Die Arbeit mit Xenopus-Extrakt ermöglicht es dem Benutzer, Komponenten eines Signalwegs leicht zu erschöpfen und eine definierte Menge eines Proteins wieder hinzuzufügen. Um die dosisabhängige Wirkung zu bestimmen, verwenden Sie frisch zubereiteten XUS-Ei-Extrakt oder tauen Sie ihn schnell auf, gefrorener Extrakt und legen Sie ihn auf Eis. Führen Sie alle Manipulationen in der Kälte durch, bereiten Sie pelletierte Antikörper- oder Affinitätskügelchen mit einem Zehntel des Volumens des Extrakts vor, um die Verdünnung des Extrakts zu minimieren, und ziehen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich aus den Kügelchen heraus, bevor Sie den Extrakt hinzufügen.

Mit Gel-Ladespitzen mit langen, sich verjüngenden Enden wird hier der Extrakt zu GST-Bindeharz gegeben. Drehen Sie die Extraktperlenmischung eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Schleudern Sie dann die Extraktperlenmischung bei 12.600 g in einer Mikrofuge bei vier Grad Celsius für 30 Sekunden.

Achten Sie darauf, dass keine Kügelchen mit dem Extrakt übertragen werden. Den erschöpften Extrakt in ein frisches Mikrofurchenröhrchen auf Eis geben. Bestätigung der Wirksamkeit der Depletion durch Immunoblotting, sowohl von abgereichertem Extrakt als auch von Kügelchen.

Da T und der Abbau energieabhängig sind, werden die endogenen A TP-Speicher schnell erschöpft. Um eine robuste T-Degradation aufrechtzuerhalten, müssen Sie daher eine Energieregenerationsmischung verwenden. Bereiten Sie eine 20-fache Energierückgewinnung oder ER-Mischung vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Tauen Sie den Opus-Ei-Extrakt schnell auf, indem Sie die gefrorene Tube zwischen den Händen reiben. Lege das Röhrchen auf Eis, kurz bevor der gesamte Extrakt geschmolzen ist. Fügen Sie 10 Mikroliter Energierückgewinnung hinzu.

In ein Aliquot aus Xenopus-Ei-Extrakt mischen. Gründlich mischen, indem Sie die Tube und den Pulswirbel schnell schnippen und sofort auf Eis legen. Die entsprechenden Volumina für den Abbauassay werden in vorgekühlte Mikrofuge-Röhrchen auf Eis aliquotiert.

Zur Vorbereitung auf radiomarkierte Beta-Katin- und Abbautests entnehmen Sie zwei bis fünf Mikroliter Extrakt für jeden Zeitpunkt, um den radioaktiv markierten Beta-Catenin-Abbautest in XUS-Eiextrakt durchzuführen. Bereiten Sie zunächst das mit Beta-Catenin gekennzeichnete Radio vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie dann ein bis drei Mikroliter in vitro übersetztes Beta-Catenin zu 20 Mikrolitern xip Reaktionsmischung auf Eis, mischen Sie sie gründlich durch ein schnelles Schnippen des Röhrchens und einen kurzen Impuls des Vortexens.

Dies ist ein wichtiger Schritt. Ein XUS-Ei-Extrakt ist sehr viskos und eine unvollständige Mischung beeinträchtigt die Konsistenz der Ergebnisse beim Pulsieren, Schleudern und Auflegen auf Eis. Starten Sie die Beta-Catenin-Abbaureaktion, indem Sie die Röhren zum angegebenen Zeitpunkt auf Raumtemperatur bringen.

Entfernen Sie ein bis fünf Mikroliter der Probe und mischen Sie sie sofort mit einem fünffachen Volumen SDS-Probenpuffer, um die Reaktion zu stoppen und sicherzustellen, dass die Abbaureaktion vollständig beendet wird. Schnippen Sie mehrmals an der Tube und wirbeln Sie kräftig vortexen, um die SDS-Seite auszuführen. Die Autoradiographie führt eine Mikroliter-Äquivalenz des Extrakts für jeden Zeitpunkt und jede Spur durch.

Die Ergebnisse können mit image, J image quant oder einer anderen bevorzugten Bildgebungssoftware quantifiziert werden. Der Abbau von Beta-Catenin im xap-Ei-Extrakt sollte durch die zeitabhängige Abnahme der Intensität des radioaktiv markierten Beta-Kains in der Bande nachgewiesen werden. Zur Herstellung von Beta-Catenin-Luciferase synthetisieren nicht radioaktiv markierte Luciferase-markierte Beta-Catenin.

Unter Verwendung des gekoppelten Systems der Transkriptionstranslation mit vollständiger Aminosäuremischung. Bestätigen Sie die Produktion des mit Luziferase markierten Beta-Catenins, indem Sie die Luziferaseaktivität von 0,5 bis einem Mikroliter der Reaktion messen. Beurteilen Sie die Hintergrundlumineszenz, indem Sie die Lumineszenz aus einem nicht translatierten Reaktionsgemisch messen, um den Beta-Catin-Luciferase-Abbauassay durchzuführen. Tauen Sie zuerst auf und bereiten Sie Xenopus-Ei-Extrakt wie zuvor vor.

Fügen Sie dann die in vitro translatierte Beta-Catin- und Luciferase-Fusion in die vorbereitete xip-Reaktion hinzu. Auf Eis mischen und gut mischen. Stellen Sie den Extrakt wie zuvor auf Raumtemperatur ein, um die Abbaureaktion zu starten.

Ein Aliquot der Reaktion zum angegebenen Zeitpunkt wird entfernt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Entnahme von dreifachen Proben zur Analyse zu jedem Zeitpunkt. Gefrorener Extrakt kann bis zur Analyse bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Tauen Sie die Proben auf Eis auf und geben Sie die Proben vor der Verarbeitung auf weiße 96-Well-Standardplatten auf Eis. Für die Luciferase-Aktivität kann der GS GSK 3-abhängige Abbau von Beta-Catenin mit XUS-Ei-Extrakt auf verschiedene Weise nachgewiesen werden. Der Abbau von S 35 radiomarkiertem Beta-Catenin im XUS-Extrakt wird durch Zugabe des Proteasom-Inhibitors MG 1 32 gehemmt.

Die Beta-Catenin-Mutante ist im XUS-Ei-Extrakt im Vergleich zu Wildtyp-Betain stabilisiert und Proteininhibitoren von GSK drei hemmen in ähnlicher Weise den Abbau von Beta-Catenin. Schließlich kann die Depletion von GSK drei aus Xip-Ei-Extrakt den Abbau von Beta-Catenin-Abbau durch Zugabe von exogenem GSK drei retten. Der Beta-Catenin-Luziferase-Abbauassay in Xip-Ei-Extrakt wurde verwendet, um den Abbau von Beta-Katin und Luciferase zu beurteilen.

Die Abbaurate von Beta-Katin und Luciferase ist ähnlich wie bei dem nicht markierten Beta-Catenin-Protein. Die Regulation des Abbaus für die Beta-Katin- und Luciferase-Fusion ist im Wesentlichen identisch mit der des Nicht-Fusionsproteins. Da die Zugabe von Lithiumchlorid zu einer Hemmung des Beta-Catin- und Luciferase-Umsatzes führte, veränderte sich das radioaktive Signal der Beta-Catina.

Das Luciferase-Protein verläuft parallel zu den Veränderungen der enzymatischen Aktivität der Luciferase im Laufe der Zeit Beim Versuch dieses Verfahrens. Es ist wichtig, alle Reagenzien auf Eis zu legen und die Reaktionen gründlich zu mischen, bevor Sie diesen Assay versuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Regulatoren identifizieren und Beta-Catine und Umsatz mit dem zellfreien Xenopus-Ei-Extrakt-System analysieren können.