RNAscope für

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den empfindlichen und spezifischen Nachweis von mRNA der Hochrisiko-HPV-Typen E6 und E7 in Tumorzellen bei Kopf-Hals-Krebs mittels einer neuartigen RNA-in-situ-Hybridisierungstechnik namens RNA scope zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem die Gewebeproben auf den Objektträgern zunächst mit Hitze und Protease vorbehandelt werden, um die Zellen für den Zugang der Sonden zu permeabilisieren. Im zweiten Schritt werden die Objektträger mit einem HPV-Sonden-Cocktail inkubiert, der auf sieben Hochrisiko-HPV-Typen abzielt und an die E6-E7-mRNA hybridisiert.

Als Nächstes verstärken Sie die Hybridisierungssignale, indem Sie nacheinander mit dem Präamplifikator und der mit HRP konjugierten Markersonde hybridisieren. Das Signal wird anschließend mit einem Chromogen detektiert und mittels Standard-Hellfeldmikroskopie sichtbar gemacht. Die Ergebnisse zeigen HPVE6-E7-mRNA-Signale als punktförmige braune Präzipitate in HPV-positiven Tumoren, jedoch nicht in HPV-negativen Tumoren. Der RRA-Scope-Assay verwendet eine neuartige und proprietäre Sonden-Design-Strategie für die Inselhybridisierung.

Es ermöglicht die Visualisierung einzelner Moleküle und die Quantifizierung von Zielstrukturen. Diese Technologie ebnet den Weg für Forscher im Bereich der Biomarkerforschung und der diagnostischen Säureentwicklung, beliebige durch Makro-Race- oder Next-Generation-Sequencing-Studien entdeckte RNA-Biomarker zu identifizieren und zu validieren. Die meisten Wissenschaftler mit vorheriger Erfahrung in IHC oder jeweils können diese Methode schnell erlernen.

Ich werde Ihnen nun eine Demonstration des gesamten Arbeitsablaufs geben, wobei ich die wichtigsten Schritte hervorhebe, um Ihnen zu helfen, die Technik zu beherrschen. Die Gewebeproben, die mit dieser RNA-in-situ-Hybridisierungstechnik untersucht werden sollen, sind formalinfixiert und paraffin-eingebettet. Auf Objektträgern aufgebrachte Schnitte mit einer Dicke von fünf plus oder minus einem Mikrometer werden eine Stunde vor dem Assay präpariert.

Backen Sie die Objektträger in einem Trockenofen bei 60 Grad Celsius, während die Objektträger backen. Bereiten Sie den Hybridisierungs-Ofen vor. Stellen Sie die Temperatur auf 40 Grad Celsius ein und legen Sie ein befeuchtendes Papier in das Feuchtigkeitskontrollfach.

Geben Sie 50 Milliliter destilliertes Wasser auf das Befeuchtungspapier, um es vollständig zu benetzen. Setzen Sie die abgedeckte Schale in den Ofen ein, um sie vorzuwärmen, und lassen Sie sie mindestens 30 Minuten vor Gebrauch darin. Bereiten Sie 700 Milliliter einer 1x-Vorbehandlungslösung 2 durch Verdünnung der 10x-Vorbehandlungslösung in destilliertem Wasser vor.

Erhitzen Sie die 1x Vorbehandlungslösung 2 auf Sieden und halten Sie die Temperatur zwischen 100 und 104 Grad Celsius, wobei Überkochen vermieden wird. Stellen Sie drei Liter 1x Waschpuffer her, indem Sie den vorgewärmten 50x Waschpuffer unter einem Abzug mit destilliertem Wasser verdünnen.

Bereiten Sie Xylol, 70 % Ethanol und 100 % Ethanol für die abschließende Entparaffinierung und Dehydratisierung vor. Bereiten Sie eine 50 %ige Hämatinglösung und 0,01 %ige Ammoniaklösung oder Blaufärbereagenz für die Nachfärbung vor. Erwärmen Sie die Zielproben 10 Minuten lang auf 40 Grad Celsius vor.

Bringen Sie alle Reagenzien des Fertigreagenz-Kits mit Ausnahme des DAB-Chromogens Braun A und Braun B auf Raumtemperatur. Um diesen Assay zu beginnen, deparaffinieren Sie die eingebetteten Gewebeschnitte zweimal für jeweils fünf Minuten in Xylol unter häufigem Schütteln. Danach zweimal für jeweils drei Minuten in 100 % Ethanol unter häufigem Schütteln dehydratisieren.

Für fünf Minuten lufttrocknen lassen und dann mit einem hydrophoben Barrierestift eine hydrophobe Barriere um den Gewebeschnitt ziehen. Beginnen Sie die Vorbehandlung der Gewebeschnitte, indem Sie diese 10 Minuten bei Raumtemperatur mit der Vorbehandlungslösung eins inkubieren. Dadurch wird die endogene Peroxidase-Aktivität unterdrückt.

Mit destilliertem Wasser spülen. Anschließend die RNA gewinnen, indem die Gewebeschnitte 15 Minuten lang mit der Vorbehandlungslösung zwei bei siedender Temperatur inkubiert werden; nach 15 Minuten zweimal mit destilliertem Wasser spülen, um die Proteine zu verdauen. Die Gewebeschnitte mit der Vorbehandlungslösung drei behandeln und 30 Minuten lang im Hybridisierungsofen bei 40 Grad Celsius inkubieren.

Nach der 30-minütigen Inkubation die Gewebeschnitte zweimal mit destilliertem Wasser spülen. Der nächste Schritt ist die Target-Probe-Hybridisierung unter Verwendung eines Pools von Sonden, die die E6-E7-mRNA von sieben Hochrisiko-HPV-Genotypen nachweisen: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 und 58. Die HPV-Sonden, die Ubiquitin-C-Sonde und die Sonden für das bakterielle Gen DAPB getrennt auf drei benachbarte Gewebeschnitte auftragen.

Hybridisieren Sie zwei Stunden lang bei 40 Grad Celsius im Ofen am Ende der zweistündigen Inkubation. Spülen Sie die Gewebeschnitte zweimal je zwei Minuten bei Raumtemperatur mit Waschpuffer, um die Signalverstärkung zu erreichen. Beginnen Sie damit, die Gewebeschnitte 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius im Hybridisierungsofen mit dem AMP-one-Präamplifikator zu inkubieren.

Zweimal mit Waschpuffer je zwei Minuten bei Raumtemperatur waschen. Die nachfolgenden Schritte zur Signalverstärkung umfassen die Inkubation der Gewebeschnitte mit den folgenden Reagenzien bei 40 Grad Celsius für die angegebene Zeitdauer sowie zwei Waschschritte mit Waschpuffer bei Raumtemperatur. Nach jeder Inkubation AMP two Hintergrundreduzierer für 15 Minuten anwenden.

AMP drei Verstärker 30 Minuten lang und AMP vier markierte Sonde 15 Minuten lang. Anschließend die Gewebeschnitte nach zwei Spülgängen in Waschpuffer mit Amp fünf 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann mit Amp sechs 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, gefolgt von zwei weiteren Spülgängen in Waschpuffer. Zur Signaldetektion eine 1:1-DAB-Mischung herstellen, indem gleiche Volumina von Braun A und Braun B gemischt werden. Die Lösung auf die Objektträger geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Zweimal mit destilliertem Wasser spülen. Die Gewebeschnitte mit einer 50 %igen Hämatoxylin-Lösung zwei Minuten bei Raumtemperatur kontrastfärben und anschließend so lange mit destilliertem Wasser spülen, bis die Objektträger klar sind, während die Gewebestellen erhalten bleiben. Die Objektträger fünfmal in 0,01 %iger Ammoniaklösung eintauchen, gefolgt von fünfmaligem Eintauchen in destilliertes Wasser. Die Gewebeschnitte durch zweimaliges zweiminütiges Inkubieren in 70 %igem Ethanol, 100 %igem Ethanol und erneut 100 %igem Ethanol entwässern, gefolgt von einer Fünf-Minuten-Inkubation in Xylol.

Schließlich werden die Objektträger mit xylolbasierten Eindeckmedien aufgebracht, wie hier gezeigt. Hier sind Beispielbilder von gefärbten, formalinfixierten und paraffineingebetteten Schnitten von Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinomen. Im HPV-positiven Fall detektierten die HR-HPV-Sonden starke punktförmige Signale spezifisch in den Tumorzellen. Dies ist im Einzelbild bei 40×-Vergrößerung deutlich sichtbar.

Die positiven Kontrollsonde UBC wies zahlreiche punktförmige zytoplasmatische Signale in Tumorzellen sowie in stromalen Zellen nach. Während die negative Kontrollsonde DAP B im HPV-negativen Fall einen sauberen Hintergrund zeigte, detektierten sowohl die HR-HPV-Sonde als auch die DAP-B-Sonde keine Signale, während die UBC-Sonde starke Signale nachwies. Die Bewertung zur Bestimmung des HPV-Status umfasst die Untersuchung aller drei Objektträger für jeden Fall.

Die Färbungsintensität auf der negativen Kontroll-DAP-B-Slide dient als Grenzwert; HPV-Positivität wird definiert durch das Vorhandensein punktförmiger, zytoplasmatischer und/oder nukleärer Färbung über dem Signal auf der DAP-B-Slide. Der RNA-scope-Assay kann innerhalb von acht Stunden abgeschlossen werden, sofern er korrekt durchgeführt wird. Es ist entscheidend, bei jedem Schritt eine ausreichende Menge an Lösung hinzuzufügen, um den gesamten Gewebebereich vollständig zu bedecken.

Es ist außerdem wichtig, zwischen den Schritten Pufferreste durch vorsichtiges Antippen der Objektträger zu entfernen, wobei die Objektträger weiß bleiben sollen. Die Rescope-Technologie kann zur Detektion praktisch beliebiger RNA-Biomarker in jeder Zelle oder Gewebe jeder Art angewendet werden.