Name: RNAscope für In situ Erkennung von transkriptionell aktiven Human Papillomavirus in Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Erfahren Sie die RNAscope-Technik zur In-situ-Detektion von HPV E6/E7 mRNA in Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinomen. Diese Methode ermöglicht die sensitive Visualisierung transkriptionell aktiver Viren in Gewebeproben.

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1. Sample, Ausrüstung und Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Cut Gewebeprobe in Blöcke von 3-4 mm Dicke, fix in frischem 10% neutral gepuffertem Formalin für 16 bis 32 Stunden bei Raumtemperatur (25 ° C) und in Paraffin eingebettet werden. Schneiden Sie FFPE in Abschnitte von 5 ± 1 um Dicke aus FFPE-Blöcke, auf Objektträger und der Luft trocknen. Hinweis: Die Folien können bei Raumtemperatur unter Trocknung für 3 Monate gelagert werden. Die montierten Gewebeschnitten in einem trockenen über bei 60 ° C für 1 h vor dem Assay RNAscope gebacken werden. </li><li> Bringen Hybridisierungsofen auf 40 ° C Legen Sie ein Befeuchten von Papier in das Fach Luftfeuchtigkeitskontrolle. 50 ml dH 2 O auf die Befeuchtung Papier, um es vollständig zu benetzen. Legen Sie die abgedeckt Tray in den Ofen, für mindestens 30 Minuten vor der Verwendung vorwärmen. </li><li> Stellen Sie 700 ml 1x vorbehandeln 2 Lösung (10 nl, pH 6 Citrat-Puffer) durch Verdünnen 10x Vorbehandlungslösung in dH 2 O. Erhitzen Sie das vorbehandeln 1x 2 Lösung zu sieden und maintain die Temperatur zwischen 100-104 ° C und verhindert Über-Kochen. </li><li> Machen Sie 3 L 1x Waschpuffer (0,1 x SSC) durch Verdünnen vorgewärmten 50x Waschpuffer in dH 2 O. </li><li> Bereiten Sie 2 x 200 ml Xylol und 2 x 200 ml 100% EtOH für Entparaffinierung unter einer Abzugshaube. </li><li> Bereiten Sie 50% Hämatoxylin Färbelösung und Bläuungsreagenz (0,01% Ammoniakwasser) für Post-Färbung unter einer Abzugshaube. </li><li> Planen 200 ml Xylol, 200 ml 70% und 2 x 200 ml 100% EtOH für die Dehydratisierung unter einem Abzug. </li><li> Vorwärmen Ziel Sonden bei 40 ° C für 10 Minuten und bringen RTU Detection Kit Reagenzien auf Raumtemperatur, einschließlich RTU Amp1, Amp2, Amp3, Amp4, Amp 5-Brown, und Amp6-Brown, außer DAB Chromogen Brown-A-und-B Braun . </li></ol> 2. RNAscope Assay Entparaffinierung und Dehydration Nach dem Backen entparaffinieren Gewebeschnitte in Xylol für 2 x 5 min mit häufigem Rühren und entwässernin 100% EtOH für 2 x 3 min mit häufigem Rühren. Luft für 5 Minuten und zeichnen Sie eine hydrophobe Barriere rund um den Gewebeschnitt mit einer hydrophoben Barrier Stift. Vorbehandlungen <ol><li> Inkubieren Gewebeschnitte mit vorbehandeln 1 für 10 min bei RT zum Abschrecken der endogenen Peroxidase-Aktivität, spülen in dH 2 O. </li><li> Inkubieren Gewebeschnitte mit vorbehandeln 2 bei einer Siedetemperatur für 15 min für die RNA-Abruf gehalten gründlich zweimal in dH 2 O. </li><li> Inkubieren Gewebeschnitte mit vorbehandeln 3 für 30 Minuten bei 40 ° C für die Proteinverdauung in HybEZ Ofen gründlich zweimal in dH 2 O. </li></ol> Zielsondenhybridisierung Ziel Sonden HPV-HR 7-Pool gehören: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 und 58 auf. In HPV-Sonden, Ubiquitin C (UBC) und bakterielle Gen dapB Sonden separat auf drei nebeneinander Gewebeschnitten. Hybridisierung bei 40 ° C im Ofen für 2hr, dann in 1x Waschpuffer spülen für 2 x 2 min bei RT. Signalverstärkung <ol><li> Inkubieren Gewebeschnitte mit Amp1 (Vorverstärker) 30 min bei 40 ° C, Amp2 (Hintergrund Minderer) für 15 min bei 40 ° C, Amp3 (Verstärker) 30 min bei 40 ° C und Amp4 (Markierungssonde) für 15 min bei 40 ° C im Ofen HybEZ. Nach jedem Hybridisierungsschritt gründlich in 1x Wash Puffer für 2 x 2 min bei RT. </li><li> Inkubieren Gewebeschnitte mit Amp5 für 30 min und Amp6 für 15 min bei RT. Nach jeder Inkubation Schritt gründlich in 1x Wash Puffer für 2 x 2 min bei RT. </li></ol> Signalerkennung Inkubieren Gewebeschnitte mit 1:1 DAB Mischung durch Mischen gleicher Volumen von Brown und Brown-A-B für 10 min bei RT gründlich zweimal in dH 2 O. Gegenfärbung <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Stain Gewebeschnitte mit 50% Hämatoxylin-Lösung für 2 min bei RT, spülen mit dH 2 O bis Träger sind klar, während Gewebe lila bleiben. Dip rutscht in 0,01% Ammoniak in dH 2 O für 5x und folgte mit 5 taucht in dH 2 O. Slide Einbau Entwässern Gewebeschnitte in 70%, 100% und 100% EtOH für je 2 min, 5 min Xylol, montieren mit Xylol-basierten Montage Medien.

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Alle Autoren werden von eigenen Aktien und in Advanced Cell Diagnostics, Inc. beschäftigt

Der HPV-Test RNAscope erlaubt die direkte Visualisierung von E6/E7 mRNA in situ in HPV-assoziierte Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom. Die RNAscope Assay ist kompatibel mit routine festen Tumorgewebe und bewahrt Gewebemorphologie für histopathologische Korrelationen (Abbildung 2). Ein wesentlicher Vorteil des Assays über RNAscope CISH herkömmlichen Verfahren ist, dass er spezifisch verstärkt die Hybridisierungssignale (Fig. 2B und 2E) ohne Verstärkung des Hintergrundrauschens (2C und 2F). In der Praxis kann die RNAscope HPV-Testverfahren innerhalb von 8 Stunden abgeschlossen oder bequem über zwei Tage aufgeteilt werden. Der HPV-Test RNAscope wurde genutzt, um HPV-Status in Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom 12-16 bestimmen, was zeigt, 97% Sensitivität und 93% Spezifität mittels qRT-PCR als Referenzmethode 16. Konventionelle chromogenic ISH für HR-HPV-DNA ist hochspezifisch, sondern hat eine Empfindlichkeit von 12 ~ 80%. Immunhistochemischen (IHC) Färbung für die zelluläre Surrogatmarker p16 zeigt hervorragende Empfindlichkeit, aber können falsche positive Ergebnisse 15,18, vor allem in nonoropharyngeal Kopf-Hals-Tumoren 15 zu generieren. Die aktuelle &quot;Goldstandard&quot;-Methode der qRT-PCR für HPV E6/E7 mRNA-Nachweis erfordert frisch gefrorenem Gewebe für optimale Ergebnisse und ist technisch komplex, was seine Verwendung zu Forschungslabor begrenzt. Darüber hinaus erfordert es die RNA-Extraktion, die es unmöglich macht, HR-HPV E6/E7 mRNA-Expression mit Histopathologie korreliert ist. Es gibt mehrere kritische Faktoren für den Erfolg der RNAscope Assay. Erstens, um die besten Ergebnisse, Gewebe sind in frischen 10% neutral gepuffertem Formalin bei Raumtemperatur für 16-32 Stunden nach ASCO / CAP 19 Leitlinien festgelegt werden. Zweitens wird der Ofen HybEZ empfohlen, da es zu ermöglichens eine optimale Steuerung der Temperatur und Feuchtigkeit für Sondenhybridisierung und Signalverstärkungsschritten. Drittens ist es wichtig, um überschüssige Rest Puffer vor jedem Schritt zu entfernen, aber immer noch den Gewebeschnitt zu halten vor dem Austrocknen während einer dieser Schritte. Die hier beschriebene manuelle Verfahren RNAscope wurde vollständig auf einem kommerziellen Auto-Schieber-Färbung System 10 automatisiert. Dies sollte erheblich erleichtern Standardisierung der Testbedingungen und spart wertvolle Handarbeit in der klinischen Pathologie-Laboratorien. Darüber hinaus hat dedizierte Bildanalyse-Software entwickelt, um die Zellen 10 und Färbung Signale auf einer digitalisierten Rutsche, die helfen sollen, die Subjektivität eliminieren und die Reproduzierbarkeit verbessern in Scoring automatisch zu identifizieren. Zusammenfassend erkennt der HPV-Test RNAscope das Vorhandensein von HR-HPV E6/E7 mRNA-Transkripte in situ in FFPE-Gewebe. Es verfügt über einen Workflow, der vertraut klinischen Pathologie Labor istTories durch Genehmigung der Visualisierung direkt von diesen in Gewebeschnitten. Es bietet eine ideale Plattform für die Prüfung (FFPE) Gewebeproben und kann leicht durch diagnostische Pathologie-Laboratorien angenommen werden.

Hochrisiko-humanen Papillomviren (HR-HPV) macht etwa 5% aller Krebserkrankungen weltweit ein. Die Häufigkeit von HPV-assoziierten oropharyngealen Krebs hat sich in den letzten Jahrzehnten vor allem bei Männern erhöht. HPV-positive Mund-Rachen-Plattenepithelkarzinom (OPSCC) wird wahrscheinlich bilden eine Mehrheit aller Kopf-und Halskrebs in den USA in den nächsten 20 Jahren 2. Oropharyngeale Plattenepithelkarzinome, die durch HPV verursacht werden, mit günstigen Überleben und Tumor HPV-Status ist ein starker und unabhängiger prognostischer Faktor für das Überleben 3. Beweise für die transkriptionelle Aktivierung der viralen Onkogene E6 und E7 wird als Goldstandard für die Anwesenheit von klinisch relevanten HPV 4 betrachtet. Allerdings ist der Nachweis E6/E7-mRNA aus frischem Tumorgewebe mittels RT-PCR-Technik nicht praktisch in der klinischen Routine und hat zu den Forschungslabors beschränkt. Vor kurzem haben wir have eine neuartige Technologie namens RNA-ISH RNAscope, die Multiplex-Nachweis mit RNA-Einzelmolekülempfindlichkeit in Formalin fixiert Paraffin eingebettete Gewebeproben (FFPE) 5-10 können in einzelnen Zellen. Wir stellten drei Beweislinien für Einzelmoleküldetektion 5. Erstens erlaubt die RNAscope Sondendesign und Signalverstärkungssystem Detektion von einzelnen Kopie HER2 genomischen DNA-Ziele in HeLa-und SK-BR-3-Zelllinien. Zweitens, wenn genomische DNA mit HER2 Signalen verglichen, die Verteilung der Fluoreszenzintensitäten von HER2-mRNA Signal Punkte in HeLa-Zellen war konsistent mit einem Molekül pro Punkt. Drittens, die Anzahl der HER2-mRNA-Signal Punkte pro Zelle eng aufeinander abgestimmt die durch eine lösungsbasierte Quantifizierung Assay geschätzt HER2-mRNA-Kopienzahl, weitere Stützeinzelmoleküldetektion. Außerdem Gegenfärbung der Zellkerne mit DAPI in der Fluoreszenzmikroskopie oder mit Hämatoxylin in Hellfeld-Mikroskopie ermöglicht die Visualisierung der einzelnen Kerne, whICH wiederum ermöglicht den Nachweis und die Quantifizierung von RNA-Zielen auf einer Einzelzellgrundlage 10. Die Fähigkeit, die Genexpression in situ in der klinischen Routineproben analysieren RNAscope macht eine vielversprechende Plattform für diagnostische Pathologie, vor allem diejenigen, FFPE-Gewebeschnitt-basierte Assays 10,11. Wir haben eine RNAscope basierten Assay zum Nachweis HPV E6/E7 mRNA von sieben Hochrisiko-HPV-Genotypen (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 und 58) mit einem Pool von Genotyp-spezifische Sonden entwickelt. Unsere bisherigen Untersuchungen haben gezeigt, dass OPSCC die RNAscope HPV Assay ist hochempfindlich und spezifisch bei der Bestimmung HPV-Status auf FFPE-Geweben 12-17 und informiert auch Prognose OPSCC 12,16. Das Prinzip der RNAscope Technik bereits beschrieben worden 5. Hier beschreiben wir die komplette RNAscope Testprotokoll und zeigen ihre Verwendung in der Detektion von HR-HPV in FFPE-Tumorgewebeschnitten.

<table><tbody><tr><td>SuperFrost Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ Ofen-, Tablett- und Rost</td><td>für die erweiterte Zelldiagnostik</td><td>310011, 310012, 310014</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 FFPE-Reagenzienkit - Brown</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310035</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope HPV-HR7 Sonde für HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 und 58, E6/E7 mRNA</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>312351</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophober Barrierestift</td><td>Vektorlabor</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>ALREAGAL</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Gill's Hämatoxylin I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>HXGHE1LT</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniakhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320145-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-F</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-300-49SHP</td><td></td></tr><tr><td>Trockenschrank</td><td></td><td></td><td>Kann eine Temperatur von 60&plusmn halten; 1 &Grad; C</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td></td><td></td><td>Kann die Temperatur bei 40 ° plus halten; 1 &Grad; C</td></tr></tbody></table>

rnascope für<em&gt; in situ</em&gt; erkennung von transkriptionell aktiven human papillomavirus in kopf-hals-plattenepithelkarzinom

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Der &quot;Goldstandard&quot; für die onkogenen HPV-Nachweis ist die Demonstration von transkriptionell aktiven Hochrisiko-HPV im Tumorgewebe. , Erkennung von E6/E7 mRNA durch quantitative Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) erfordert jedoch die RNA-Extraktion, die das Tumorgewebe Kontext entscheidend für morphologische Korrelation zerstört und war schwierig, in der klinischen Routine verabschiedet werden. Unsere neu entwickelte RNA in situ Hybridisierung Technologie RNAscope, ermöglicht die direkte Visualisierung von RNA in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebe mit Einzelmolekülempfindlichkeit und Einzelzellauflösung, die hochsensitive und spezifische in situ-Analyse der RNA Biomarker ermöglicht in der klinischen Routineproben. Die RNAscope HPV-Test wurde entwickelt, um die E6/E7 mRNA von sieben Hochrisiko-HPV-Genotypen (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 und 58) mit einem Pool von Genotyp-spezifischen Sonden zu detektieren. Es hat eine ausgezeichnete Empfindlichkeit nachgewiesenund Spezifität gegen den Strom &quot;Goldstandard&quot; Verfahren zum Nachweis E6/E7-mRNA durch qRT-PCR. HPV-Status von RNAscope bestimmt ist stark prognos den klinischen Verlauf von Mundrachenkrebs-Patienten.

RNAscope HPV-Test-Workflow Die RNAscope Assay hat eine hoch optimierten Workflow, die ähnlich IHC ist (Abbildung 1). Es besteht aus vier Hauptschritten: Vorbehandlungen, Hybridisierung Signalverstärkungen und Detektion. Es setzt eine einzigartige Sonde Design-Strategie, die High-Fidelity-Signalverstärkung 5 gewährleistet. Im RNAscope HPV Assay werden die sieben HR-HPV-Sondensätze vereinigt, die alle von der gleichen Signalverstärkungssystem mit Meerrettichperoxidase (HRP) verknüpft erkannt. Spezifische Hybridisierungssignale werden erkannt als braune Niederschläge durch HRP gebildet katalysierte Farbreaktion mit DAB als Substrat, die leicht durch Standard-Hellfeldmikroskopie sichtbar gemacht werden kann. Repräsentative Färbung für HPV-Nachweis Abbildung 2 zeigt beispielsweise Bilder von Bunt FFPE Abschnitte des Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom. Bei den HPV-positiven Fall (Abb.Abbildung 2A), erfasst die HR-HPV-Sonden starke punktförmige Signale spezifisch in den Tumorzellen. Die UBC-Sonde nachgewiesen zahlreiche punktförmige zytoplasmatische Signale in beiden Tumorzellen und Stromazellen (2B). Das bakterielle Gen dapB Sonde zeigten einen sauberen Hintergrund (Abbildung 2C). In der HPV-negativen Fall sowohl die HR-HPV-Sonde und der Sonde nachgewiesen dapB keine Signale (Abb. 2D und 2F), während starke Signale wurden unter Verwendung des UBC-Sonde (2E) nachgewiesen. In diesem Test UBC dient als Positivkontrolle, um Gewebe RNA-Qualität und dapB als Negativkontrolle für die Hintergrundsignale zu beurteilen. Die Wertung für HPV-Status Bestimmung erfordert die Prüfung alle drei Rutschen für jeden Fall. Die Färbungspegel auf der negativen Steuerschieber (dapB) Schieber als Grenz verwendet: HPV-Häufigkeit wird durch die Anwesenheit von punktförmigen cytoplasmatischen und / oder Kernfärbung, die über das Signal auf der dabpB Schlitten definiert. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Flussdiagramm RNAscope-Assay. Illustration von RNAscope Test-Workflow. Die RNAscope Test 4 Hauptschritte, Vorbehandlungen, Zielsondenhybridisierung, Signalverstärkung und Signalerkennung. Das gesamte Testverfahren kann in 8 Stunden abgeschlossen sein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2.jpg" /> 2. Beispiel Bilder von RNAscope-gefärbten Folien. FFPE Abschnitte mit Sonden gebeizt für HR-HPV, UBC (Positivkontrolle) und dapB (Negativkontrolle)von zwei Fällen HNSCC. AC. HPV-positiven Fall. Ein HR-HPV E6/E7 mRNA-Expression in Tumorzellen. Inset, 40-facher Vergrößerung kann punktförmige Signale zeigen. B und C) benachbarten Gewebeschnitten zeigt positive UBC-Färbung (B) und negativ für dapB (C) sind. DF) HPV-negativen Fall. D) keine Färbung für HPV E6/E7 mRNA , ähnlich dem dapB Negativkontrolle (F). E) UBC positive Färbung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a>

Das Vorhandensein von Hochrisiko-HPV im Kopf-und Halstumorgewebe ist mit den positiven Ergebnissen assoziiert. Die neu entwickelte RNA in situ Hybridisierung Technik namens RNAscope ermöglicht die direkte Visualisierung von HPV E6/E7 mRNA in FFPE-Gewebeschnitten.

RNAscope für<em&gt; In situ</em&gt; Erkennung von transkriptionell aktiven Human Papillomavirus in Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den empfindlichen und spezifischen Nachweis von mRNA der Hochrisiko-HPV-Typen E6 und E7 in Tumorzellen bei Kopf-Hals-Krebs mittels einer neuartigen RNA-in-situ-Hybridisierungstechnik namens RNA scope zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem die Gewebeproben auf den Objektträgern zunächst mit Hitze und Protease vorbehandelt werden, um die Zellen für den Zugang der Sonden zu permeabilisieren. Im zweiten Schritt werden die Objektträger mit einem HPV-Sonden-Cocktail inkubiert, der auf sieben Hochrisiko-HPV-Typen abzielt und an die E6-E7-mRNA hybridisiert.Als Nächstes verstärken Sie die Hybridisierungssignale, indem Sie nacheinander mit dem Präamplifikator und der mit HRP konjugierten Markersonde hybridisieren. Das Signal wird anschließend mit einem Chromogen detektiert und mittels Standard-Hellfeldmikroskopie sichtbar gemacht. Die Ergebnisse zeigen HPVE6-E7-mRNA-Signale als punktförmige braune Präzipitate in HPV-positiven Tumoren, jedoch nicht in HPV-negativen Tumoren. Der RRA-Scope-Assay verwendet eine neuartige und proprietäre Sonden-Design-Strategie für die Inselhybridisierung.Es ermöglicht die Visualisierung einzelner Moleküle und die Quantifizierung von Zielstrukturen. Diese Technologie ebnet den Weg für Forscher im Bereich der Biomarkerforschung und der diagnostischen Säureentwicklung, beliebige durch Makro-Race- oder Next-Generation-Sequencing-Studien entdeckte RNA-Biomarker zu identifizieren und zu validieren. Die meisten Wissenschaftler mit vorheriger Erfahrung in IHC oder jeweils können diese Methode schnell erlernen.Ich werde Ihnen nun eine Demonstration des gesamten Arbeitsablaufs geben, wobei ich die wichtigsten Schritte hervorhebe, um Ihnen zu helfen, die Technik zu beherrschen. Die Gewebeproben, die mit dieser RNA-in-situ-Hybridisierungstechnik untersucht werden sollen, sind formalinfixiert und paraffin-eingebettet. Auf Objektträgern aufgebrachte Schnitte mit einer Dicke von fünf plus oder minus einem Mikrometer werden eine Stunde vor dem Assay präpariert.Backen Sie die Objektträger in einem Trockenofen bei 60 Grad Celsius, während die Objektträger backen. Bereiten Sie den Hybridisierungs-Ofen vor. Stellen Sie die Temperatur auf 40 Grad Celsius ein und legen Sie ein befeuchtendes Papier in das Feuchtigkeitskontrollfach.Geben Sie 50 Milliliter destilliertes Wasser auf das Befeuchtungspapier, um es vollständig zu benetzen. Setzen Sie die abgedeckte Schale in den Ofen ein, um sie vorzuwärmen, und lassen Sie sie mindestens 30 Minuten vor Gebrauch darin. Bereiten Sie 700 Milliliter einer 1x-Vorbehandlungslösung 2 durch Verdünnung der 10x-Vorbehandlungslösung in destilliertem Wasser vor.Erhitzen Sie die 1x Vorbehandlungslösung 2 auf Sieden und halten Sie die Temperatur zwischen 100 und 104 Grad Celsius, wobei Überkochen vermieden wird. Stellen Sie drei Liter 1x Waschpuffer her, indem Sie den vorgewärmten 50x Waschpuffer unter einem Abzug mit destilliertem Wasser verdünnen.Bereiten Sie Xylol, 70 % Ethanol und 100 % Ethanol für die abschließende Entparaffinierung und Dehydratisierung vor. Bereiten Sie eine 50 %ige Hämatinglösung und 0,01 %ige Ammoniaklösung oder Blaufärbereagenz für die Nachfärbung vor. Erwärmen Sie die Zielproben 10 Minuten lang auf 40 Grad Celsius vor.Bringen Sie alle Reagenzien des Fertigreagenz-Kits mit Ausnahme des DAB-Chromogens Braun A und Braun B auf Raumtemperatur. Um diesen Assay zu beginnen, deparaffinieren Sie die eingebetteten Gewebeschnitte zweimal für jeweils fünf Minuten in Xylol unter häufigem Schütteln. Danach zweimal für jeweils drei Minuten in 100 % Ethanol unter häufigem Schütteln dehydratisieren.Für fünf Minuten lufttrocknen lassen und dann mit einem hydrophoben Barrierestift eine hydrophobe Barriere um den Gewebeschnitt ziehen. Beginnen Sie die Vorbehandlung der Gewebeschnitte, indem Sie diese 10 Minuten bei Raumtemperatur mit der Vorbehandlungslösung eins inkubieren. Dadurch wird die endogene Peroxidase-Aktivität unterdrückt.Mit destilliertem Wasser spülen. Anschließend die RNA gewinnen, indem die Gewebeschnitte 15 Minuten lang mit der Vorbehandlungslösung zwei bei siedender Temperatur inkubiert werden; nach 15 Minuten zweimal mit destilliertem Wasser spülen, um die Proteine zu verdauen. Die Gewebeschnitte mit der Vorbehandlungslösung drei behandeln und 30 Minuten lang im Hybridisierungsofen bei 40 Grad Celsius inkubieren.Nach der 30-minütigen Inkubation die Gewebeschnitte zweimal mit destilliertem Wasser spülen. Der nächste Schritt ist die Target-Probe-Hybridisierung unter Verwendung eines Pools von Sonden, die die E6-E7-mRNA von sieben Hochrisiko-HPV-Genotypen nachweisen: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 und 58. Die HPV-Sonden, die Ubiquitin-C-Sonde und die Sonden für das bakterielle Gen DAPB getrennt auf drei benachbarte Gewebeschnitte auftragen.Hybridisieren Sie zwei Stunden lang bei 40 Grad Celsius im Ofen am Ende der zweistündigen Inkubation. Spülen Sie die Gewebeschnitte zweimal je zwei Minuten bei Raumtemperatur mit Waschpuffer, um die Signalverstärkung zu erreichen. Beginnen Sie damit, die Gewebeschnitte 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius im Hybridisierungsofen mit dem AMP-one-Präamplifikator zu inkubieren.Zweimal mit Waschpuffer je zwei Minuten bei Raumtemperatur waschen. Die nachfolgenden Schritte zur Signalverstärkung umfassen die Inkubation der Gewebeschnitte mit den folgenden Reagenzien bei 40 Grad Celsius für die angegebene Zeitdauer sowie zwei Waschschritte mit Waschpuffer bei Raumtemperatur. Nach jeder Inkubation AMP two Hintergrundreduzierer für 15 Minuten anwenden.AMP drei Verstärker 30 Minuten lang und AMP vier markierte Sonde 15 Minuten lang. Anschließend die Gewebeschnitte nach zwei Spülgängen in Waschpuffer mit Amp fünf 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann mit Amp sechs 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, gefolgt von zwei weiteren Spülgängen in Waschpuffer. Zur Signaldetektion eine 1:1-DAB-Mischung herstellen, indem gleiche Volumina von Braun A und Braun B gemischt werden. Die Lösung auf die Objektträger geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Zweimal mit destilliertem Wasser spülen. Die Gewebeschnitte mit einer 50 %igen Hämatoxylin-Lösung zwei Minuten bei Raumtemperatur kontrastfärben und anschließend so lange mit destilliertem Wasser spülen, bis die Objektträger klar sind, während die Gewebestellen erhalten bleiben. Die Objektträger fünfmal in 0,01 %iger Ammoniaklösung eintauchen, gefolgt von fünfmaligem Eintauchen in destilliertes Wasser. Die Gewebeschnitte durch zweimaliges zweiminütiges Inkubieren in 70 %igem Ethanol, 100 %igem Ethanol und erneut 100 %igem Ethanol entwässern, gefolgt von einer Fünf-Minuten-Inkubation in Xylol.Schlie&szlig;lich werden die Objekttr&auml;ger mit xylolbasierten Eindeckmedien aufgebracht, wie hier gezeigt. Hier sind Beispielbilder von gef&auml;rbten, formalinfixierten und paraffineingebetteten Schnitten von Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinomen. Im HPV-positiven Fall detektierten die HR-HPV-Sonden starke punktf&ouml;rmige Signale spezifisch in den Tumorzellen. Dies ist im Einzelbild bei 40&times;-Vergr&ouml;&szlig;erung deutlich sichtbar.Die positiven Kontrollsonde UBC wies zahlreiche punktförmige zytoplasmatische Signale in Tumorzellen sowie in stromalen Zellen nach. Während die negative Kontrollsonde DAP B im HPV-negativen Fall einen sauberen Hintergrund zeigte, detektierten sowohl die HR-HPV-Sonde als auch die DAP-B-Sonde keine Signale, während die UBC-Sonde starke Signale nachwies. Die Bewertung zur Bestimmung des HPV-Status umfasst die Untersuchung aller drei Objektträger für jeden Fall. Die Färbungsintensität auf der negativen Kontroll-DAP-B-Slide dient als Grenzwert; HPV-Positivität wird definiert durch das Vorhandensein punktförmiger, zytoplasmatischer und/oder nukleärer Färbung über dem Signal auf der DAP-B-Slide. Der RNA-scope-Assay kann innerhalb von acht Stunden abgeschlossen werden, sofern er korrekt durchgeführt wird. Es ist entscheidend, bei jedem Schritt eine ausreichende Menge an Lösung hinzuzufügen, um den gesamten Gewebebereich vollständig zu bedecken.Es ist außerdem wichtig, zwischen den Schritten Pufferreste durch vorsichtiges Antippen der Objektträger zu entfernen, wobei die Objektträger weiß bleiben sollen. Die Rescope-Technologie kann zur Detektion praktisch beliebiger RNA-Biomarker in jeder Zelle oder Gewebe jeder Art angewendet werden.

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Forschung

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