Name: Lineage-Umprogrammierung der Perizyten-abgeleiteten Zellen des erwachsenen menschlichen Gehirn in Neuronen induziert (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T21:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Erfahren Sie die direkte Umwandlung von Perizyten in Neuronen im erwachsenen menschlichen Gehirn mittels retroviraler Vektoren. Diese Methode ermöglicht innovative Ansätze zur neuronalen Regeneration.

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Wir danken Dr. Magdalena Götz für ihre Eingabe während der Entwicklung dieses Protokolls. Wir danken Dr. Marius Wernig (Stanford University) für die großzügige Bereitstellung von uns mit der Sox2 kodierenden Sequenz. Wir sind auch sehr dankbar, dass Dr. Alexandra Lepier für die Virusproduktion. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) und dem BMBF (01GN1009A) an BB, und dem Bayerischen Staatsministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst zu MK und BBCS erhielt Mittel aus dem binationalen SYSTHER unterstützten INREMOS Virtuelle Institute (Deutsch und Slowenisch Bundesministerien für Bildung und Forschung) und der DFG (SFB 824).

1. Isolierung und Kultivierung von adulten menschlichen Gehirn-Zellen Experimente mit menschlichem Gewebe sollte in Übereinstimmung mit allen relevanten staatlichen und institutionellen Regelungen bezüglich der Verwendung von Menschenmaterial zu Forschungszwecken durchgeführt werden. Die vorliegende Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der Genehmigung durch die Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der LMU München und eine schriftliche Einverständniserklärung von allen Patienten entwickelt. Dieses Protokoll der Vorbereitung Kulturen der erwachsenen Menschen Hirnrinde wurde mit Proben von Patienten beider Geschlechter leidet Temporallappen-Epilepsie oder andere tiefsitzende nicht-traumatische, nicht-malignen Läsionen etabliert. Das aus dem Operationssaal ausschließlich der Zugangskanal zum Gehirn Läsion umfasste erhalten und damit Gewebe gilt als gesund. Die Altersspanne der Patienten betrug 19 bis 70 Jahren. <ol><li> Vorbereitung Wachstumsmedium durch Zugabe hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum(FCS) zu DMEM mit hohem Glucose Glutamax, um eine Endkonzentration von 20% FCS zu erhalten. 5 ml Penicillin / Streptomycin, auf insgesamt 500 ml Wachstumsmedium. Führen Sie diese und alle folgenden Schritte erfordern sterile Kulturbedingungen in einem geeigneten Steril. </li><li> Halten erwachsenen menschlichen Gehirn-Biopsie aus dem Operationsraum in Hanks &#39;ausgeglichener Salzlösung mit CaCl 2 und MgCl 2 (HBSS) Medium mit HEPES (10 mM Endkonzentration) auf Eis bis zur Verarbeitung erhalten. Startet die Bearbeitung so schnell wie möglich. </li><li> Um die Dissoziation in Einzelzellen beginnen, das Gewebe übertragen in eine 65 mm Petrischale und Hackfleisch in kleine Stücke mit Hilfe von zwei sterilen Einweg-Skalpelle. Für die enzymatische Verdauung verwendet TrypLE 3-6 ml in einem 15 ml konischen Röhrchen und Inkubation für 15-30 Minuten bei 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> 1 Volumen der vorgewärmten Nährmedium, um die Dissoziation zu ermöglichen und sanft verreiben der Lösung, die Gewebestücke auf und ab, indem zuerst5 ml Einwegpipette, gefolgt durch die Verwendung einer Glaspasteurpipette bis zur Homogenisierung der Zellsuspension. Typischerweise einige restliche Gewebestücke, die meist aus der weißen Substanz, in Suspension bleiben. </li><li> Spin-down bei 157 × g für 5 min und das Pellet in der entsprechenden Menge an Wachstumsmedium (10 ml pro unbeschichtete T75-Kulturkolben). Verwenden Sie eine T75 Kulturflasche für eine Biopsie von 5-10 mm Durchmesser in Größe und extrapolieren diese bei größeren Proben. </li><li> Platzieren Zellen in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 und 5% O 2. </li><li> Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums alle 3-4 Tage, bis die Zellen Konfluenz erreicht haben. Dies dauert in der Regel bis zu zwei Wochen (als Durchgang 0 [P0] bezeichnet). </li></ol> 2. In-vitro-Expansion und Charakterisierung von Adult Human Brain Cells <ol><li> In-vitro-Expansion: <ol><li> Absaugen Kulturmedium und Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), gehalten bei Raum temperatur, vor Zugabe von 3 ml TrypLE. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 5-10 min, bis die meisten Zellen abgelöst. Klopfen Sie die Flaschen, um das Anheben der Zellen zu erleichtern; nach Zugabe von 3 Volumen Wachstumsmedium, übertragen Sie die Zellen in eine 15 ml konischen Röhrchen und Spin bei 157 xg für 5 min nach unten und die Zellen resuspendieren in der entsprechenden Menge des Wachstumsmediums. </li><li> Passage der Zellen in einem Verhältnis von 1:3 für optimale Ausbeute zu neuen T75-Zellkulturflaschen. Hinweis: Wir haben diese Zellen bis P5 agiert, ohne irgendwelche Anzeichen von reduzierten Umprogrammierung Effizienz. Während an P0 die Kultur enthält einen erheblichen Anteil der Endothelzellen (wie von CD34-Expression zu beurteilen), in den nachfolgenden Passagen ihre Zahl vernachlässigbar. </li></ol></li><li> Charakterisierung von adulten menschlichen Gehirn Kulturen: <ol><li> Immunocytochemistry: <ol><li> Zur Charakterisierung der Zellen, Samen ~ 60.000 Zellen auf Poly-D-Lysin beschichteten Glasdeckgläschen in 500 ul frisches Wachstums medium in 24-Well-Gewebekulturplatten, und bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 5% O 2. </li><li> Für immunzytochemische Analyse der kultivierten menschlichen Gehirnzellen entfernen Sie das Medium und waschen 3x mit 1 ml PBS. </li><li> Fix Zellen durch Zugabe von 500 ul 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Übertragen der Glasdeckgläschen in eine geeignete Färbung befeuchteten Kammer und der Block mit 80 ul PBS, enthaltend 3% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5% Triton X-100 für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Hinzufügen Primärantikörper in derselben Lösung verdünnt (Verdünnungsfaktoren siehe Tabelle spezifischer Reagenzien und Ausrüstung) und Inkubation über Nacht bei 4 ° C oder 1 h bei Raumtemperatur. Hinweis: Ein wesentlicher aber unterschiedlichem Anteil der Zellen in diesem Stadium der Kultivierung sind immunreaktiv für Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptor β (PDGFRβ) cluster of differentiation 146 (CD146), NG2 Chondroitinsulfat Proteoglycan und Glattmuskelaktin (SMA), dh charakteristische Marker der Mikrogefäß-assoziierten Perizyten. Nur eine Minderheit (&lt;1%) drücken die Astroglia-Marker saure Gliafaserprotein (GFAP) und S100β. Außerdem in dieser Phase die Kultur sollte frei von jeglichen Zellen, die den neuronalen Marker βIII-Tubulin exprimieren. Verwenden Sie mehrere primäre Antikörper-Kombinationen für die Co-Kennzeichnung von verschiedenen Markern. Eine weitere Bestätigung der Expression von Gliazellen, neuronale, Endothelzellen und Perizyten Marker können durch reverse Transkription und quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (in diesem Protokoll beschrieben) erhalten werden. </li><li> Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper, wasche dreimal mit 1 ml PBS hinzugefügt und die entsprechenden Sekundärantikörper (in den geeigneten Verdünnungen) in die Farblösung und Inkubation 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS. Falls erforderlich, vor der Montage umfassen Färbung mit DAPI für 5 min bei RaumTemperatur. </li><li> Verwenden Antifading Montagemedium und analysieren die Deckgläser mit einem Epifluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Mikroskop. </li></ol></li><li> Durchflusszytometrie: <ol><li> Für die Analyse der Oberflächenmarker-Expression mittels Durchflusszytometrie, wachsen Zellen bis zur Konfluenz in T25-oder T75 unbeschichteten Zellkulturflaschen. </li><li> Trennen von Zellen mithilfe TrypLE wie vorher und resuspendieren in Farblösung, bestehend aus PBS + 0,5% BSA beschrieben. Per Farbreaktion, resuspendieren 100.000-200.000 Zellen in 100 ul Farblösung. Bereiten Einzel Färbereaktionen pro Antikörper verwendet (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, Isotypenkontrolle jeweiligen Antikörper). </li><li> Hinzufügen Fluorochrom-konjugierten Antikörper zu jeder Färbelösung (siehe Tabelle für Verdünnungen spezifischer Reagenzien und Ausrüstung) direkt in der Zellsuspension und Inkubieren bei 4 ° C für 30 min im Dunkeln. </li><li> Mit 500 ul PBS Waschen Sie die Zellen dreimal und Spin-down zwischen den einzelnenWaschschritt bei 157 × g für 5 min. </li><li> Zellpellet in 0,5-1 ml Färbelösung und Übertragungszellen über einen Zellenfilter (70 um) FACS-Röhrchen. Schützen Sie die Probe vor Lichteinwirkung. </li><li> Vortex Proben vor, indem sie in der FACS-Gerät. </li><li> Um die lebenden Zellen zu analysieren und verstehen Schutt und Zellaggregate, Tor für FSC und SSC-A-A. Handy Duolen sind speziell von FSC-A-und FSC-W verknüpft. Um die richtigen Gating-Bedingungen für die Zelloberflächenmarker setzen Sie die Tore mit Isotyp-Antikörper-Kontrolle an die jeweilige Fluorochrom konjugiert zu bestimmen. Dann bestimmen den Anteil der Antikörper-gebundenen Zellen. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Bereicherung Perizyten abgeleiteten Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung <ol><li> Reinige den pericyte Zellpopulation (in Wachstumsmedium resuspendiert) vor Übertragung durch FACS-Sortierung mit einer 70 um Düse. Verwenden CD34-APC in Kombination mit CD140b-PE und CD146-FITC für Perizyten auswählen. Sortieren für CD34-negative, CD140b-und CD146-positiven Zellen. </li><li> Sammeln der sortierten Zellen in Wachstumsmedium und der Platte auf Poly-D-Lysin-beschichtete Glasdeckgläschen in 24-Well-Gewebekulturplatten, und bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 5% O 2. </li><li> 48 h nach der Sortierung ersetzen das Medium mit frischem Wachstumsmedium und führen Übertragung in Protokoll 4 beschrieben. </li></ol> 4. Retrovirale Transduktion von Perizyten-abgeleiteten Zellen und Reprogrammierung in induzierte Neurone Hinweis: Lesen Sie lokale Richtlinien der biologischen Sicherheit beim Umgang mit retroviralen Partikeln. In Deutschland ist die Verwendung der hier verwendeten Retroviren benötigen Biosicherheitsstufe 2. Für die Produktion von retroviralen Partikeln siehe Protokoll 6. Für retroviralen Konstrukte zur Umprogrammierung benutzt, um Karow et al verweisen. (2012). Retroviren waren pseudotypisierte mit VSV-G (VSV-GlycoProtein) 5. Für die Produktion entnehmen Sie bitte Gavrilescu et al 6 verweisen. <ol><li> 24 Stunden vor der retroviralen Transduktion Samen ~ 60.000 Zellen auf Poly-D-Lysin beschichteten Glasdeckgläschen in 500 ul frischem Wachstumsmedium in 24-Well-Gewebekulturplatten, und bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 5% O 2 . </li><li> Am nächsten Tag, ersetzen Sie das Wachstumsmedium mit 500 ul frisch, vorgewärmten Wachstumsmedium und fügen 1 ul der jeweiligen Überstände konzentriert retrovirale Partikel (für Steuer pCAG-IRES-DsRed, besonders während der Erstellung des Protokolls im Labor), pCAG-ASCL1 enthalten -IRES-DsRed pCAG-Sox2-IRES-GFP. </li><li> Einen Tag später, entfernen Sie das Medium mit der Viruspartikel aus den Zellen und 1 ml frisches, vorgewärmtes B27-Differenzierungsmedium, von 49 ml DMEM mit hohem Glucose Glutamax und 1 ml Serum-B27 kostenlose Beilage zusammen. Aufrechterhaltung der Zellen in der Kultur bei 37 ° C in 5% CO 2 und 5% O 2 für 4-8 Wochen, ohne dass das Medium als Medium ändert sich wiederholende schädlich wie iNs reifen. </li></ol> 5. Charakterisierung der induzierten Neuronen durch Immunzytochemie <ol><li> Um die zelluläre Identität der transduzierten Zellen zu bestimmen, insbesondere um den Erwerb eines neuronalen Phänotyp zeigen, führen Immunzytochemie gegen neuronale Antigene wie bIII-Tubulin, MAP2 und NeuN (für Antikörper und deren Verdünnungen, siehe Tabelle von spezifischen Reagenzien und Ausrüstung, folgen dem gleichen Verfahren wie in 2.2.1 angegeben). </li><li> Zur Verbesserung der Reifung von PdiNs, Co-Kultur dieser Zellen mit Nervenzellen aus der Maus E14 Hirnrinden abgeleitet. Zu diesem Zweck sezieren die Großhirnrinde und distanzieren sich ausdrücklich das Gewebe mechanisch mit einer feuerpolierten Pasteur-Glaspipette. In 10.000-50.000 murinen Neuronen zu Kulturen von pericyte-abgeleiteten Zellen 2-3 Wochen nach Transduktion mit Sox2-und ASCL1 re-encodingtroviruses und weiter Kultivierung. Transduzierte Zellen aus Maus-Neuronen durch ihre Reporter (GFP und dsRed) Ausdruck entweder durch Live-Epi-Fluoreszenz oder nach Immunzytochemie für GFP und dsRed unterschieden werden. </li><li> Um die Bildung von Synapsen auf PdiNs von murinen Neuronen zu beurteilen, führen Immunzytochemie gegen vesikulären Neurotransmitter-Rezeptoren, wie vesikulären Glutamattransporter 1 (VGLUT1). </li><li> Sonde transduzierten Zellen auf ihre elektrischen Eigenschaften (dh die Fähigkeit zur Erzeugung von Aktionspotentialen) und die Einrichtung von funktionellen Synapsen durch Patch-Clamp-Elektrophysiologie. Einzelheiten des Verfahrens siehe Heinrich et al. (2011). </li></ol>

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</ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das vorliegende Protokoll beschreibt die in-vitro-Erweiterung und Bereicherung des pericyte-abgeleiteten Zellen nach der Isolierung von adulten menschlichen Großhirnrinde und die anschließende Umwandlung in Ins, die von Retrovirus-vermittelte Expression von Transkriptionsfaktoren der neurogenen Sox2 und ASCL1. Solche Protokoll bietet eine experimentelle in vitro-System, die Linie-Umwandlung von Gehirn-residente Zellen in Neuronen und Glia potenziell auch zu untersuchen, mit dem Ziel vor Augen, um schli...

Um eine Anpassung an somatischen Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS), die wiederum mit einer Vielzahl von Differenzierungspotentiale gegen ausgestattet zielt direkte Anpassung für gerade Umwandlung eines spezifischen Zelltyp in einen anderen. Mit Bezug auf ihre Anwendung im Rahmen der Seuchenmodellierung und potenzielle zellbasierte Therapien, haben beide Ansätze Umprogrammierung spezifischen Vor-und Nachteile. Umprogrammieren in iPS-Zellen (i) bietet eine nahezu unendliche Quelle von Zellen; (Ii) können für die Gentechnik; (Iii) verleiht mit einer nahezu unbegrenzten Differenzierungspotenzial. , Hauptnachteile iPSCs bringen jedoch die Gefahr der Tumorigenität von undifferenzierten Zellen (Teratombildung in vivo) und die Notwendigkeit für die ex vivo Kultivierung und nachfolgende Transplantation, wenn diese Zellen bei Zelltherapien verwendet werden. Umgekehrt wird eine direkte Abstammungslinie Umprogrammierung durch die geringere Ausbeute an den gewünschten Zellen beschränktdie direkt korreliert mit der Anzahl der Zielzellen von der Ausgangspopulation, besitzt den Vorteil, dass linien umgewandelten Zellen scheinen keine tumorerzeugende Risiko bei Transplantation 1,2 aufweisen, aber; Weiterhin direkte Anpassung kann auch in situ, dh innerhalb des Organs, wo würden diese Zellen benötigt werden, wodurch die Notwendigkeit der Transplantation erreicht werden. In diesem Sinne, unser Labor hat die Möglichkeit der Umprogrammierung-Linie Gehirn-residente Zellen in iNs als neuartiges Konzept für zellbasierte Therapien von neurodegenerativen Erkrankungen verfolgt. Brain-residenten Zellen, die potenziell als zelluläre Ziele für linien Umprogrammierung angesehen werden können, umfassen verschiedene Arten von Makroglia (Astrozyten, Oligodendrozyten und NG2 Zellen), Mikroglia und Mikrogefäß-assoziierten Zellen (Endothelzellen und Perizyten). Wir haben ausführlich die in vitro-Umprogrammierung Potenzial der Astroglia der Hirnrinde untersuchttex der frühen postnatalen Mäusen 3-5. Auf der Suche nach ähnlich geeigneten Zellquellen für die direkte Abstammungslinie Umprogrammierung im erwachsenen menschlichen Gehirn, stießen wir auf eine Zellpopulation, die erfolgreich in Ins und Ausstellungs Markenzeichen der Perizyten neu programmiert werden kann. Hier wir ein Protokoll, wie diese Zellen aus erwachsenen menschlichen Gehirn Biopsien geerntet, zu erweitern und zu bereichern, diese Zellen in vitro und schließlich erfolgreich einen wesentlichen Anteil dieser in vitro expandierten Zellen (im Bereich von 25-30%) in umprogrammieren beschreiben Ins. Umprogrammierung durch gleichzeitige Retrovirus-vermittelte Co-Expression von zwei Transkriptionsfaktoren, Sox2 und ASCL1 erreicht werden. Diese PdiNs wurden gefunden, um die Fähigkeit von sich wiederholenden Aktionspotential Brand zu erwerben und als Ziele für die synaptische anderen Neuronen Angabe ihrer Fähigkeit, die Integration in neuronalen Netzwerken dienen. Unser Protokoll stellt eine einfache Methode zur Isolierung und Abstammung Umwandlung von erwachsenen menschlichen Gehirn Perizyten in Ins. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>Anti-CD140b-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558821</td><td>Verwendung von 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD146-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA2141FT</td><td>Verwendung von 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD13-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td></td><td>MVA1270A488T Verwendung von 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD34-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>560940</td><td>Verwendung von 1:100</td></tr><tr><td>Anti-PDGFR&beta;</td><td>Cell Signaling</td><td>3169S</td><td>verwendet 1:200</td></tr><tr><td>anti-CD146</td><td>Abcam</td><td>Ab75769</td><td>verwendet 1:400</td></tr><tr><td>anti-NG2</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td>verwendet 1:400</td></tr><tr><td>anti-SMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2547</td><td>verwendet 1:400</td></tr><tr><td>anti-&beta; III-Tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8660</td><td>verwendet 1:400</td></tr><tr><td>Anti-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4403</td><td>verwendet 1:200</td></tr><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3893</td><td>verwendet 1:600</td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP 10-20</td><td>verwendet 1:1.000</td></tr><tr><td>Anti-RFP</td><td>Chromotek</td><td>5F8</td><td>verwendet 1:500</td></tr><tr><td>Anti-S100&beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td>verwendet 1:300</td></tr><tr><td>anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td>verwendet 1:200</td></tr><tr><td>anti-GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2052</td><td>verwendet 1:500</td></tr><tr><td>anti-Calretinin</td><td>Millipore</td><td>AB5054</td><td>verwendet 1:500</td></tr><tr><td>anti-vGluT1</td><td>SYnaptic SYstems</td><td>135511</td><td>verwendet 1:1.000</td></tr><tr><td>Ratte IgG1 Isotypkontrolle FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>11-4301-81</td><td>1:100 Ratte</td></tr><tr><td>IgG1 Isotypkontrolle PE</td><td>AbD Serotec</td><td>12-4301-81</td><td>1:100 Ratte</td></tr><tr><td>IgG1 Isotypkontrolle APC</td><td>AbD Serotec</td><td>17-4301-81</td><td>1:100</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965</td><td></td></tr><tr><td>B27 serumfreies Supplement</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>fötales Kälberserum</td><td>Invitrogen</td><td>10106-169</td><td>führt eine Hitzeinaktivierung durch Inkubation bei 56 μg durch; C für 30 min</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)</td><td>Invitrogen</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS ohne CaCl2 und MgCl2 (D-PBS, 1x)</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysin Hydrobromid (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>PFA (Paraformaldehyd)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-Diamidin-2-phenylindole)-dilaktat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>042M4005</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Poly/ Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen-Rohre mit rundem Boden&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden und Zellsiebkappe;</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten</td><td>Orange Scientific</td><td>5530305</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Kulturflaschen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 Kulturflaschen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>Einwegpipetten 10 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Glas Pasteur Pipetten (150 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB50251</td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckgläser 12 mm Durchmesser</td><td>Menzel</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Einwegskalpelle&nbsp;</td><td>B. Braun</td><td>5518083</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturschalen&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>Konische Röhrchen 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Haube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge und Ausschwingrotor mit Adaptern für 15 ml und 50 ml Röhrchen</td><td>Hettich Lab Technology</td><td>1406</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometrie-Zellsortierer: FACSAria l mit FACSDiva Software&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humifizierter Zellkultur-Inkubator</td><td>Eppendorf Galaxy 170R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad bei 37 > C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSFlow Mantelflüssigkeit&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Epifluoreszenzmikroskop BX61</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lineage-umprogrammierung der perizyten-abgeleiteten zellen des erwachsenen menschlichen gehirn in neuronen induziert

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direkte Linie-Reprogrammierung von nicht-neuronalen Zellen in Neuronen induziert (INS) kann Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Neurogenese bieten und ermöglichen neue Strategien für In-vitro-Modellierung oder die Reparatur des kranken Gehirns. Identifizieren Gehirn-Resident nicht-neuronalen Zelltypen zugänglich direkte Umwandlung in iNs könnte für die Einführung eines solchen Ansatzes in situ, dh innerhalb des geschädigten Hirngewebe zu ermöglichen. Hier beschreiben wir eine in dem Versuch der Identifikation von Zellen aus erwachsenen menschlichen Gehirn, die diese Prämisse zu erfüllen abgeleitet entwickeltes Protokoll. Dieses Protokoll umfasst: (1) die Kultivierung von menschlichen Zellen aus der Hirnrinde von erwachsenen menschlichen Gehirn Biopsien erhalten; (2) die in vitro-Vermehrung (etwa 2-4 Wochen erforderlich) und die Charakterisierung der Kultur durch Immunzytochemie und Durchflusszytometrie; (3) die Anreicherung durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) unter Verwendung von Anti-PDGF-β-Rezeptor-und Anti-CD146-Antikörper;(4) die Retrovirus-vermittelte Transduktion mit dem neurogene Transkriptionsfaktoren Sox2 und ASCL1; (5) und schließlich die Charakterisierung der resultierenden pericyte abgeleiteten induzierten Neuronen (PdiNs) durch Immunzytochemie (14 Tage bis 8 Wochen nach retroviraler Transduktion). In diesem Stadium kann ins für ihre elektrischen Eigenschaften von Patch-Clamp-Aufnahme untersucht werden. Dieses Protokoll stellt eine hoch reproduzierbares Verfahren für die in vitro-Umwandlung der Linie Gehirnfremden Perizyten in funktionelle menschliche INS.

Das erste Ergebnis dieses Protokoll nach dem erfolgreichen Aufbau einer Kultur aus einer Probe des erwachsenen Menschen Hirnrinde besteht in der Identifizierung der zellulären Zusammensetzung des Kultur. Immunzytochemie für die Zelltyp-spezifische Proteine ​​offenbart eine beträchtliche Heterogenität zwischen den Kulturen Probe verschiedener Patienten (1A) abgeleitet ist. Wie durch die Strömungs Durchflusszytometrie quantifiziert gibt es immer eine wesentliche Fraktion von Zellen, PDGFRβ exprimieren (du...

Gehirn-Targeting-residente Zellen für die direkte Abstammungslinie Neuprogrammierung bietet neue Perspektiven für die Gehirn-Reparatur. Hier beschreiben wir ein Protokoll, wie die Kulturen für Gehirn-Resident Perizyten aus erwachsenen menschlichen Gehirnrinde angereichert vorzubereiten und wandeln diese in induzierten Neuronen durch Retrovirus-vermittelte Expression der Transkriptionsfaktoren und Sox2 ASCL1.

Lineage-Umprogrammierung der Perizyten-abgeleiteten Zellen des erwachsenen menschlichen Gehirn in Neuronen induziert

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Zellen, die aus menschlichen Gehirnparasiten stammen, in induzierte Neuronen umzuwandeln. Dies wird erreicht, indem parasitäre Zellen aus chirurgischen Gehirnproben isoliert und kultiviert werden. Anschließend werden die Zellen nach der Vermehrung in vitro mit Antikörpern gegen parasitäre Marker markiert, was deren Charakterisierung und eine eventuelle weitere Anreicherung ermöglicht.Anschließend werden parasitenstammige Zellen mit retroviralen Vektoren, die neuronale Zellschicksalsdeterminanten kodieren, transduziert, um sie direkt in induzierte Neuronen umzuwandeln. Es werden Ergebnisse erzielt, die induzierte Neuronen zeigen, die aus linienreprogrammierten, parasitenstammigen Zellen gewonnen wurden, basierend auf Immunfärbungen für den neuronalen Marker Beta-Tubulin III. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes gegenüber bestehenden Methoden wie der Reprogrammierung von Fibroblasten oder der Differenzierung embryonaler Stammzellen in Neuronen besteht darin, dass wir Zellen ansprechen, die dem Gehirn endogen sind, was letztlich den Weg für eine direkte Linienumwandlung innerhalb des Gehirns ebnen könnte, ohne dass eine Transplantation der Zellen erforderlich ist.Das folgende Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der Genehmigung durch den Ethikausschuss der Medizinischen Fakultät der LMU München und der schriftlichen informierten Einwilligung aller Patienten entwickelt, ausgehend von einer frischen humanen Gehirnbiopsie. Halten Sie das Gewebe auf Eis in HBSS und dissoziieren Sie es in Einzelzellen, indem Sie es in eine 65 Millimeter große Petrischale überführen und mit zwei sterilen Einweg-Skalpellklingen in kleine Stücke zerkleinern. Überführen Sie das Gewebe in ein 15 Milliliter konisches Reagenzglas und geben Sie drei bis sechs Milliliter Trip le zu, inkubieren Sie 15 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad.Nach der Verdauungsreaktion eine Volume vorgewärmtes Wachstumsmedium hinzufügen, um die Assoziation zu erleichtern, und eine fünf Milliliter Einwegpipette sowie anschließend eine Glas-Pasteur-Pipette verwenden, um die Zellsuspension vorsichtig zu tritieren. Die Lösung bei 157 ×g fünf Minuten lang zentrifugieren. Den Pellet in Wachstumsmedium resuspendieren und die Kultur in einen T-75-Flakon überführen.Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 5 % Sauerstoff. Ersetzen Sie alle drei bis vier Tage die Hälfte des Mediums, bis die Zellen konfluent sind. Wenn die Zellen konfluent sind, aspirations das Kulturmedium und waschen Sie mit PBS bei Raumtemperatur, bevor Sie drei Milliliter Trip le hinzufügen.Nach einer Inkubation von fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad Celsius vorsichtig das Kolbenfläschchen antippen, um die Zellen zu lösen. Anschließend nach dem Zentrifugieren der Suspension drei Volumina Wachstumsmedium hinzufügen und die Zellen in Wachstumsmedium resuspendieren; sie im Verhältnis 1:3 in neue T-75-Kulturkolben überführen, um eine optimale Ausbeute zu erzielen.Die Zellen wurden bis zu fünfmal passagiert, ohne dass Anzeichen einer verminderten Reprogrammierung auftraten, und die Anzahl der endothelialen Zellen wird mit jeder Passage vernachlässigbar gering. Für die Immunzytochemie säen Sie etwa 60.000 Zellen auf poly-D-Lysin-beschichtete Glasdeckgläser in 500 µL frischem Wachstumsmedium in 24-Loch-Zellkulturplatten und kultivieren diese.Die Zellen 24 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 5 % Sauerstoff inkubieren. Zum immunchemischen Nachweis der kultivierten menschlichen Hirnzellen das Medium entfernen und dreimal mit je einem Milliliter PBS waschen. 500 Mikroliter 4 % Parafomaldehyd in PBS zugeben und 15 Minuten lang inkubieren.Bei Raumtemperatur. Überführen Sie die Glasdeckgläser in eine geeignete befeuchtete Färbe-Kammer und geben Sie 80 Mikroliter PBS-BSA-Triton X-100-Blocklösung hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur, bevor Sie die in derselben Lösung verdünnten primären Antikörper hinzufügen und eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, bevor Sie die sekundären Antikörper hinzufügen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.Nach dreimaligem Waschen Anti-Fading-Medium auftragen und die Deckgläser auflegen. Die Proben mittels Epifluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie analysieren. Bei der Handhabung von Retroviruspartikeln 24 Stunden vor der retroviralen Transduktion etwa 60.000 Zellen aufsäen und die örtlichen Biosicherheitsrichtlinien beachten.Glas-Deckgläser mit Poly-Lysin-Beschichtung in 500 µL frischem Wachstumsmedium in 24-Loch-Gewebekulturplatten geben und am nächsten Tag bei 37 °C inkubieren.Ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch 500 Mikroliter frisches, vorgewärmtes Wachstumsmedium und geben Sie einen Mikroliter der jeweiligen konzentrierten Überstände, die Retroviruspartikel enthalten, hinzu. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Viruspartikel in der Vertiefung sicherzustellen. Einen Tag später entfernen Sie das Medium mit den Viruspartikeln von den Zellen und geben ein Milliliter frisches, vorgewärmtes Medium hinzu.Differenzieren Sie die Zellen in B 27 Differenzierungsmedium, wie im Textprotokoll beschrieben, und kultivieren Sie sie vier bis acht Wochen lang, ohne das Medium zu wechseln, da dies die induzierten Neuronen schädigen könnte, während sie reifen, um den Erwerb eines neuronalen Phänotyps nachzuweisen. Führen Sie die Immunzytochemie gegen neuronale Antigene wie Beta-drei-Tubulin, Map zwei und Nen durch. Wie zuvor in diesem Video gezeigt, zeigt die Immunzytochemie an erfolgreich etablierten Kulturen aus dem adulten menschlichen Großhirnkortex eine beträchtliche Heterogenität zwischen Kulturen aus Proben unterschiedlicher Patienten, wie mittels Durchflusszytometrie quantifiziert wurde.Es gibt einen beträchtlichen Anteil an Zellen, die PDGFR-beta sowie andere Parasitenmarker wie CD146, NG2 und CD13 in geringerem Maße exprimieren. Ebenso wird SMA in einer geringen Teilpopulation der kultivierten Zellen bei Passage null exprimiert; üblicherweise liegen weniger als 10 % CD34-positiver endothelialer Zellen vor, die mit fortschreitender Passagierung unter die Nachweisgrenze abnehmen. Ebenso stellen Astrozyten in früheren Passagen lediglich eine vernachlässigbare Kontamination dar.Immunophytochemische und Durchflusszytometriedaten werden vollständig durch quantitative RT-PCR bestätigt. Eine weitere Anreicherung von parasitär abstammenden Zellen kann zu diesem Zeitpunkt durch FACS erreicht werden. Dies ist insbesondere dann relevant, wenn die Reinheit der Kultur am unteren Ende des Spektrums liegt, wie durch das Ausmaß der PDGFR-beta-Expression widergespiegelt wird.Daher haben wir einen Antikörper gegen P-D-G-F-R-Beta-CD-140B allein oder in Kombination mit einem Anti-CD-146-Antikörper verwendet, wobei alle CD-34-positiven Kontaminanten zur FACS-Analyse ausgeschlossen wurden. Insbesondere verändert die Transduktion dieser Kulturen mit Kontrollviren ihr Expressionsprofil nicht, was darauf hinweist, dass sie in der Parasitenlinie verbleiben. Ebenso führt die retrovirale Expression von SOX2 allein weder zu morphologischen Veränderungen noch induziert sie die Expression von Beta-3-Tubulin.Im Gegensatz dazu zeigen etwa 10 % der Zellen, die allein mit einem A SCL one-kodierenden Retrovirus transduziert wurden, die Expression von Beta-drei-Tubulin, entwickeln jedoch keine neuronale Morphologie. Auffällig ist, dass nahezu 50 % aller Zellen, die gleichzeitig mit So zwei und A SCL one kotransduziert wurden, Beta-drei-Tubulin exprimieren, wobei ein Drittel davon zudem neuronale Fortsätze aufweist, was auf ihre Schicksalsumwandlung in PNS-Zellen hinweist. Für die Durchführung dieses Verfahrens.Andere Techniken wie die Patch-Clamp-Elektrophysiologie können eingesetzt werden, um zusätzliche Fragen zur Reifung und Funktionalität induzierter Neuronen zu beantworten.

lineage-reprogramming-pericyte-derived-cells-adult-human-brain-into

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Primary, vermehren humanen fötalen brain-derived, multipotente...

Progenitor-abgeleiteten Oligodendrozyten Culture System von Human Fetal Gehirn

Dieses Video zeigt die direkte Reprogrammierung von genetisch veränderten hämatopoetischen Vorläuferzellen in neuronale Stammzellen. Transkriptionsfaktoren, die von hämatopoetischen Vorläuferzellen exprimiert werden, lösen eine Kaskade von molekularen Ereignissen aus, die ihre Umwandlung erleichtern. Weitere spezifische Medien werden verwendet, um induzierte neuronale Stammzellen zu selektieren und zu züchten.

Direkte Reprogrammierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen in neurale Stammzellen

Dieses Video zeigt den Prozess zur Differenzierung von induzierten neuralen Vorläuferzellen (iNPCs) in Neuronen und Astrozyten mit Hilfe spezieller Medien.

Differenzierung von induzierten neuralen Vorläuferzellen in Astrozyten

Das Video zeigt die Erzeugung von Neuronen aus adulten humanen dermalen Fibroblasten (aHDFs). Die aHDFs werden mit Hilfe eines lentiviralen Vektors reprogrammiert, der Gene für neuronale Transkriptionsfaktoren und kurze Haarnadel-RNAs (shRNAs) trägt. Die shRNAs hemmen die Expression eines neuronalen transkriptionellen Repressors, und die neuronalen Transkriptionsfaktoren aktivieren Gene, um aHDFs in Neuronen zu differenzieren. Diese reprogrammierten aHDFs werden in einem frühen und einem späten...

Generierung von Neuronen durch Reprogrammierung menschlicher dermaler Fibroblastenzellen

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Live Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur zelluläre Verhaltensweisen in Echtzeit zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Time-Lapse Video-Mikroskopie des primären Hirnrinde Zellen, die eine detaillierte Untersuchung der Phasen verordnet während der Linie Weiterentwicklung von primäre neurale Stammzellen zu differenzierten Neuronen und Glia ermöglichen.

Bildgebung des primären Hirnrinde Zellen unter Verwendung einer 2D Kultursystem zu leben

Ein robustes Protokoll zum neuronalen Populationen von Time-Lapse Video-Mikroskopie, gefolgt von Post-Processing Software-basierte Überwachung wird beschrieben. Diese Methode stellt ein leistungsfähiges Werkzeug zur biologischen Ereignisse in einer ausgewählten Population während live-imaging-Experimente zu identifizieren.

Leben Sie Imaging, gefolgt von einzelligen Tracking Monitor Zellbiologie und die Linie Fortschreiten der mehrere neuronalen Populationen

Direkte neuronale Umprogrammierung erzeugt Neuronen, die im Alter von der somatischen Startzelle beibehalten. Hier beschreiben wir eine einzelne Vektor-basierte Methode um induzierte Neuronen von dermalen Fibroblasten von Erwachsenen menschlichen Spendern erhalten zu generieren.

Einfache Erstellung einer High-Yield-Kultur der induzierten Neuronen aus Menschenhaut Erwachsenen Fibroblasten

Das Protokoll stellt die Reprogrammierung von peripheren mononukleären Blutzellen vor, um neuronale Stammzellen durch Sendai-Virusinfektion zu induzieren, Differenzierung von iNSCs in dopaminerge Neuronen, Transplantation von DA-Vorstufen in die einseitig Parkinson-Mausmodelle und Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von iNSC-abgeleiteten DA-Vorstufen für die PD-Behandlung.

Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien

Wir beschreiben ein Protokoll zur Neuprogrammierung menschlicher hautabgeleiteter Fibroblasten in induzierte neuronale Vorläuferzellen (iNPCs) und deren anschließende Differenzierung in induzierte Astrozyten (iAs). Diese Methode führt zu einer schnellen und reproduzierbaren Generierung von iNPCs und iAs in großen Mengen.

In-vitro-Modellierung für neurologische Erkrankungen mit direkter Konvertierung von Fibroblasten in neuronale Progenitorzellen und Differenzierung in Astrozyten

Die Fähigkeit, Stammzellen und ihre Nachkommen mit einem Fluorophor unter Verwendung einer induzierbaren transgenen Linienverfolgungs-Mauslinie dauerhaft zu markieren, ermöglicht eine räumliche und zeitliche Analyse von Aktivierung, Proliferation, Migration und / oder Differenzierung in vivo. Die Abstammungsverfolgung kann neue Informationen über die Verpflichtung der Abstammung, die Reaktion auf Interventionen und die Multipotenz aufdecken.

Abstammungsverfolgung von induzierbaren fluoreszenzmarkierten Stammzellen im erwachsenen Mäusegehirn

Erfahren Sie die direkte Umwandlung von Perizyten in Neuronen im erwachsenen menschlichen Gehirn mittels retroviraler Vektoren. Diese Methode ermöglicht innovative Ansätze zur neuronalen Regeneration.

Lineage-Umprogrammierung der Perizyten-abgeleiteten Zellen des erwachsenen menschlichen Gehirn in Neuronen induziert

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