Name: Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-26T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Lernen Sie die Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Säugetierzellen. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Beobachtungen und die Bewertung pathogener Mutationen.

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Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft unterstützt.

1. Erstellung der Plasmide <ol><li> Subklonierung der cDNA für jedes Protein von Interesse in sowohl den pLuc und pYFP Vektoren unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken (Abbildung 1). Für detaillierte Protokolle siehe Green et al 13. </li><li> Sequence alle Konstrukte, um zu überprüfen, dass die Proteine ​​von Interesse sind im Rahmen mit dem Luc / YFP-Sequenz ohne dazwischen Stop-Codons. </li><li> Funktionstests durchzuführen, wie gewünscht, um zu bestätigen, daß die Fusionsproteine, die biologische Aktivität beibehalten. In dem hier vorliegenden Fall wurde die subzelluläre Lokalisation von YFP Fusionsproteine ​​mittels Fluoreszenzmikroskopie ermittelt. </li><li> Machen Expressionsplasmide für entsprechende Luc und YFP Kontrollproteinen durch gentech die relevanten Targeting-Signale in den pLuc und pYFP Expressionsvektoren. In dem hier vorgestellten Fall erzeugen Kernziel Luc und YFP-Konstrukten durch Einfügen eines Kernlokalisationssignal in die pLuc pYFP und Vektoren. </li><li> Macheneine positive Kontrolle, in der Luc-Konstrukt und YFP zu einem einzigen Polypeptid fusioniert. In dem hier dargestellten Fall erzeugen eine positive Kontrolle, bei der die YFP-kodierenden Sequenz in den Vektor eingefügt pLuc. </li><li> Wähle einen neutralen Füllstoff-Plasmid verwendet werden, um die Masse der DNA-Transfektion in Mischungen auszugleichen. Verwenden ein Plasmid, das keine eukaryotischen Promotor und daher transkriptionell inaktiv in Säugerzellen, wie beispielsweise einer bakteriellen Clonierungsvektor. </li></ol> 2. Herstellung von DNA-Mischungen <ol><li> Schätzung der Konzentration aller in Abschnitt 1 auf der Basis der Absorption bei 260 nm beschriebenen Plasmide (1 Absorptionseinheit beträgt 50 ug / ml DNA). Bestimmung der Molekülmasse von jedem Plasmid durch Multiplizieren der Anzahl von Basenpaaren von 650 Da. Verwenden der Konzentration und Molmasse, um die molare Konzentration der einzelnen Plasmid-Präparation zu berechnen. Verdünne die Plasmid-DNA-Präparationen in einer Konzentration von 36 nM. Diese werden die Arbeitsvorräte werdendas wird verwendet, um die DNA-Mischungen für die Transfektion vorzubereiten. </li><li> Vorbereitung einer Kontroll-DNA-Gemisch, das 1,800 ng Plasmid-Füllstoff in einem Endvolumen von 20 &amp;mgr; l Wasser. </li><li> Bereiten Sie eine Kontroll-DNA-Mix mit 5 ul der pLuc-Kontrollkonstrukt. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen. </li><li> Bereiten Sie eine Kontroll-DNA-Mix mit 5 ul pLuc-Kontrollkonstrukt und 5 ul pYFP-Kontrollkonstrukt. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen. </li><li> Bereiten Sie eine Kontroll-DNA-Mix mit 5 ul der positiven Kontrolle Konstrukt. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen. </li><li> Bereiten Sie die folgenden DNA mischt, um für die Homodimerisierung eines Proteins von Interesse, X. Test für jede DNA-Mischung kombiniert 5 ul der entsprechenden pLuc konstruieren und 5 ul des pYFP zu konstruieren. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen. A) pLuc-Steuerung und pYFP-X B) pLuc-X und pYFP-Steuer C) pLuc-X und-X pYFP </li><li> Bereiten Sie die folgenden DNA vermischt, um eine Wechselwirkung zwischen einem Paar von Proteinen von Interesse zu testen, X und Y für jede DNA-Mischung kombiniert 5 ul der entsprechenden pLuc konstruieren und 5 ul der pYFP konstruieren. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen. A) pLuc-Steuerung und pYFP-X B) pLuc-X und pYFP-Steuer C) pLuc-Steuerung und pYFP-Y D) pLuc-Y und pYFP-Steuer E) pLuc-X-und-Y pYFP F) pLuc-Y und X-pYFP </li></ol> 3. Transfektion <ol><li> Ernte subkonfluenten HEK293-Zellen aus einem 75 cm 2-Kolben. Verdünnte 10% der gesamten Zellen in 13 ml Kulturmedium. Dispense 130 ul Zellsuspension in jede Vertiefung einer weißendurchsichtigem Boden 96-well Gewebekulturplatte. Kulturzellen für 24 Stunden. </li><li> Berechnung der Anzahl der Vertiefungen durch Multiplikation der Anzahl der DNA-Mischungen von 3 transfiziert werden. Bringen serumfreiem Kulturmedium auf Raumtemperatur. Erstellen Sie einen Master-Mix mit 6,3 ul Serum-freien Medium und 0,18 ul Transfektionsreagenz pro Vertiefung. Durch Vortexen mischen und bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Bereiten Transfektion Mischungen durch Zugabe von 2 ul DNA-Mix auf 20 ul Serum-freien Medium / Transfektionsreagenz Master-Mix. Nicht mit dem Vortex. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Transfektion von drei Brunnen mit jeder Transfektion Mix Abgabe 6,5 ul Transfektionsmischung pro Vertiefung. Kultur die Zellen für weitere 36 bis 48 Stunden. </li></ol> 4. Messung von BRET-Signal <ol><li> Auflösen lebenden Zellen Luciferase Substrat bei 34 mg / ml in DMSO durch Vortexen. </li><li> Verdünnen wiederhergestellt Lebendzell-Luciferase-Substrat bei 1:1000 in Verdünnungsmedium Substrat pauf 37 ° C wieder erwärmt, Lassen Sie 50 ul Substrat Verdünnungsmedium pro Vertiefung. Vortex mischen. Ein Niederschlag bilden kann, aber nicht mit dem Assay interferieren. </li><li> Absaugen Kulturmedium aus der 96-Well-Platte. Geben Sie 50 ul verdünnte Lebendzell-Luciferase-Substrat in jede Vertiefung. Kulturzellen für mindestens 2 Stunden (bis zu 24 h). </li><li> Nehmen Sie den Deckel von der 96-Well-Platte und Inkubation der Platte für 10 Minuten bei Raumtemperatur in dem Luminometer. </li><li> Messen von Emissions Luc und YFP eine gut zu einem Zeitpunkt. Messen Emission von Luc mit einem Filter blockieren Wellenlängen größer als 470 nm ist. Messen von Emissions YFP Verwendung eines 500-600 nm Bandpass-Filters. Integrieren Emissionssignale über 10 sek. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Mittelwert der Luc Emissionswerte von den 3 Brunnen, die nur den Füllstoff Plasmid erhielt. Subtrahieren Sie diesen Wert von allen anderen Luc Emissionswerte, die Hintergrund-subtrahiert Luc Emissionswerte zu erzeugen.</li><li> Mittelwert der YFP Emissionswerte von den 3 Brunnen, die nur den Füllstoff Plasmid erhielt. Subtrahieren Sie diesen Wert von allen anderen YFP-Emissionswerte, die Hintergrund-subtrahiert YFP-Emissionswerte zu erzeugen. </li><li> Für jeden gut, teilen Sie die Hintergrund-subtrahiert YFP-Emissionswert durch den Hintergrund-subtrahiert Luc Emissionswert um den unkorrigierten BRET-Verhältnis geben. </li><li> Mittelwert der unkorrigierten BRET-Verhältnisse aus den drei Brunnen, die nur mit dem pLuc-Kontroll-Plasmid transfiziert wurden. Subtrahieren Sie diesen Wert von allen anderen unkorrigierten BRET-Verhältnisse, um die korrigierten BRET-Verhältnisse zu geben. </li><li> Für jeden der verbleibenden Sätze von korrigierten BRET-Verhältnisse, der Mittelwert der Werte aus den drei Vertiefungen transfiziert, um eine endgültige BRET-Verhältnis zu erhalten. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die Konstruktion der Fusionsprotein-Expressionskonstrukte ist ein kritischer Schritt bei der Einrichtung der BRET-Untersuchung. In den hier vorgestellten, wurden die Proteine ​​von Interesse an den C-Terminus von Luciferase oder YFP fusioniert. Es ist auch möglich und kann notwendig sein, um Proteine ​​an dem N-Terminus von Luciferase / YFP verschmelzen. Bei einigen Proteinen Fusionen können entweder nur an den N-oder C-Terminus um eine Unterbrechung der Proteinstruktur und-funktion zu vermeiden akzeptiert. Außerdem für...

Sowohl klassische Verknüpfung und Next-Generation-Sequencing-Analysen von menschlichen Erkrankungen werden enthüllt die klinische Bedeutung von Proteinen in einer Reihe von biologischen Stoffwechselwegen beteiligt. Es ist oft der Fall, dass vor der Identifizierung in dieser Untersuchungen hat es wenig oder keine Untersuchung der biologischen Funktion dieser Proteine. Ein fruchtbarer Weg erkunden die biologische Funktion eines Proteins von Interesse zu beginnen, ist zu erkennen, welche anderen Proteinen interagiert es mit in seine physiologischen Kontext. Charakterisierung molekularer Netzwerke auf diese Weise Einblicke in die biologischen Signalwege des menschlichen Phänotyp zugrunde liegen. Die am häufigsten verwendete Groß Screening Ansätze zur Identifizierung von Kandidaten-Interaktionspartner für Proteine ​​von Interesse sind Hefe-Zwei-Hybrid-Screening-1 und Massenspektrometrie-basierte Proteomik 2. Diese Methoden können in die eine mögliche interagierende Proteine ​​sehr erfolgreich sein, aber arE anfällig für falsch-positive Ergebnisse. Daher Bestätigung einer Interaktion von Hefe-Zwei-Hybrid-oder Massenspektrometrie Screening identifizierten erfordert Validierung der Interaktion mit einer zweiten Technik. Typischerweise wird eine Co-Immunfällung oder Pull-down-Assays für diesen Zweck 3 verwendet. Ein Nachteil der Verwendung derartiger Techniken zur Validierung der Anforderung zur Zelllyse, welche die intrazellulären Bedingungen, die für die Aufrechterhaltung bestimmter Protein-Wechselwirkungen sein können zerstört. Ein zweiter Nachteil ist, dass schwache oder transiente Protein-Interaktionen während der Waschschritte kann gestört werden. Darüber hinaus sind diese Assays verlangen bedeutende praktische Zeit werden in der Anzahl der Proben, die gleichzeitig verarbeitet werden kann, begrenzt, und oft zeitaufwändige Optimierung von Reagenzien und Protokollen. Um einige der Probleme, mit Co-Immunopräzipitation Experimente zu überwinden, wurden mehrere Assays, die auf Fluoreszenz-und biolum entwickeltinescent Proteine, die in lebenden Zellen verwendet werden kann. Die ersten dieser Tests wurden auf Fluoreszenz (oder Förster) Resonanzenergietransfer (FRET), die nicht-strahlende Energieübertragung zwischen zwei fluoreszierende Proteine ​​mit überlappenden Emissions-und Anregungsspektren 4 basiert. Die Effizienz der Energieübertragung ist stark abstandsabhängig, also die Beobachtung des FRET Phänomen erfordert, dass die Donor-und Akzeptor-Fluorophore in unmittelbarer Nähe sein. Und die zweite als eine Fusion mit dem Akzeptor-Fluorophor (üblicherweise gelb fluoreszierendes Protein, YFP), um eine Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen von Interesse zu testen, wird ein Protein als Fusion mit dem Donor-Fluorophor (GFP allgemein cyan fluoreszierendes Protein) ausgedrückt. Eine Interaktion zwischen den beiden Proteinen von Interesse kann die Donor-und Akzeptor Fluorophore nahe genug für die Energieübertragung auftreten zu bringen, was zu einer messbaren Erhöhung der Emission von Licht aus dem Akzeptor YFP bezogen auf die GFP Spender führen wird. FRET wurde im Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen 4 erfolgreich. Der Hauptnachteil der Verwendung von FRET zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen ist die Voraussetzung für eine externe Beleuchtung zur Anregung des Donor-Fluorophors. Aussenbeleuchtung zu hohen Hintergrund in der Emissionssignal, unerwünschte Anregung des Akzeptor und Bleichen von Spender-und Akzeptor-Fluorophore. Diese Effekte verringern die Empfindlichkeit des Assays zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Eine Veränderung des FRET-Assay, der das Problem der hohen Hintergrund von externen Beleuchtungswindet die Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET)-Assay 5,6. Im BRET-System der Donor-Fluorophor durch eine Luciferase-Enzym ersetzt. Somit ist die Energie für die Anregung des Akzeptor-Fluorophors in dem System durch die Oxidation eines Luciferase-Substrat erzeugt, der eine externe Beleuchtung notwendig. In der am meistenallgemeine Konfiguration dieses Assays ist die Spender Renilla reniformis-Luciferase und der Akzeptor YFP (für eine Diskussion der alternativen Donor-und Akzeptor-Proteine ​​siehe Pfleger et al. 5). Dementsprechend wird in diesem System ein Protein von Interesse an Luciferase und einem potentiell interagierenden Protein YFP oder umgekehrt fusioniert. BRET-Assay erfordert die Zugabe von Coelenterazin als Substrat für Luciferase. Da Coelenterazin zellpermeables, ist es möglich, BRET-Assays mit lebenden Zellen durchzuführen. Jedoch ist natives Coelenterazin in wässriger Lösung instabil, und das Enzym-unabhängigen Abbau von Coelenterazin sowohl die Konzentration von Substrat für den Test zur Verfügung und erzeugt Autolumineszenz, die die Empfindlichkeit der Messung der Luciferase-Aktivität reduziert. Die Verwendung von BRET in lebenden Zellen wurde durch die Entwicklung von Schutz Coelenterazine, die in wässriger Lösung stabil sind, aber durch cytosolische Esterase erleichterts nach der Diffusion durch die Zellmembran zum aktiven Coelenterazin in die Zelle 7 zu erzeugen. Nach der Zugabe von Substrat zu Zellen Luciferase-und YFP-Fusionsproteine ​​exprimieren, wird die Energieübertragung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, die zu durch Überwachung der Emission von Luciferase und YFP quantifiziert. Weil Protein-Wechselwirkungen direkt in lebende Zellen in Multi-Well-Platten beobachtet werden, stellt die BRET-Untersuchung eine einfache, skalierbare Verfahren zur Validierung putative Wechselwirkungen, kosten-und zeiteffizient ist. Neben der Validierung putativen Interaktoren in Proteom-Screening Studien identifiziert, kann das BRET-System auch Testkandidat Interaktoren, die aus dem Stand der biochemischen und strukturellen Studien zu dem Protein von Interesse verwendet werden. Nachdem das Vorliegen einer Protein-Protein-Wechselwirkung (entweder unter Verwendung des BRET-Assays oder durch andere Verfahren) hergestellt wurde, gibt es ein Potential für die BRET-Untersuchung zu emp seinLoyed weiter, um die Interaktion zu charakterisieren. Zum Beispiel können die zusammenwirkenden Bereiche durch Erzeugen stumpf Versionen der Proteine ​​abgebildet werden, und die Beteiligung von spezifischen Resten in der Interaktion kann durch die Schaffung von Punktmutationen nachgewiesen werden. Weiterhin kann die modulatorische Wirkung von posttranslationalen Modifikationen oder kleine Moleküle (z. B. Drogen oder Liganden) an Protein-Protein-Wechselwirkungen untersucht werden 8-10. BRET-Assay hat auch ein großes Potenzial für die Untersuchung von Mutationen in Patienten-DNA identifiziert. In Fällen, wo eine ursächliche Rolle für eine Mutation festgestellt wurde, die Untersuchung der Wirkung der Mutation auf die Protein-Protein-Interaktionen mit BRET kann mehr über die molekularen Ätiologie des Phänotyps 11 offenbaren. Seit dem Aufkommen von Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation, ist es zunehmend üblich, mehrere potentiell schädlichen Mutationen in einer einzelnen identifiziert werden, in welchem ​​Fall es nicht klar, welche rele sindvant mit dem Phänotyp 12. In dieser Situation kann der BRET-Untersuchung wertvoll bei der Bewertung der Auswirkungen der Mutationen auf die Proteinfunktion und damit ihre Bedeutung für die Erkrankung.

<table><tbody><tr><td>Nanodrop 8000</td><td>Nanodrop</td><td></td><td>Jedes Spektralphotometer, das Absorptionen bei 260 nm ablesen kann, ist geeignet. Die Bestimmung der Molekülmasse des Plasmids ist entscheidend für die Berechnung der DNA-Mengen, die in Transfektionsmischungen verwendet werden sollen.</td></tr><tr><td>96-Mikrotiterplatten, flacher Boden, weiß</td><td>Greiner Bio One 655098</td><td></td><td>weiße Platten reduzieren das Übersprechen zwischen den Wells und maximieren die Empfindlichkeit der Lumineszenzdetektion. Wells mit klarem Boden ermöglichen die Überwachung der Zelldichte. Die Platten müssen für die Zellkultur geeignet sein. Wenn Sie ein Top-Ablese-Luminometer verwenden, sollte der Plattendeckel abgenommen werden.</td></tr><tr><td>Unendlicher F200Pro Plattenleser mit Steuerungssoftware</td><td>TECAN</td><td></td><td>Verwenden Sie die Filter "Blue 1" und "Green 1" für die Lumineszenzmessung und die Filtersets und den dichoischen Spiegel für GFP für die Fluoreszenzmessung. Jedes Top-Leseplatten-Lesegerät, das in der Lage ist, zweifarbige Lumineszenz und Fluoreszenz zu messen, ist geeignet.</td></tr><tr><td>pLuc, pYFP, Positivkontrollplasmid</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Plasmide sind auf Anfrage bei den Autoren erhältlich.</td></tr><tr><td>pGEM-3Zf(+)</td><td>Promega</td><td>P2271</td><td>Füllstoffplasmid zur Äquilisierung der DNA-Masse in Transfektionsmischungen. Jedes Plasmid, dem ein eukaryotischer Promotor fehlt, wäre geeignet.</td></tr><tr><td>HEK293-Zellen</td><td>ECACC</td><td>85120602</td><td>Andere Zelllinien, die mit angemessener Effizienz transfizieren, können geeignet sein.</td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, mit Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>41966</td><td>Dies ist das Medium, das für die Kultivierung von HEK293-Zellen verwendet wird. Warm bei 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch. Wenn Sie eine andere Zelllinie verwenden, ersetzen Sie das hier beschriebene Wachstumsmedium durch ein zelllinienspezifisches Medium.</td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, kein Phenolrot (Substratverdünnungsmedium)</td><td>Gibco</td><td>21063</td><td>Dies ist das Substratverdünnungsmedium, das zur Verdünnung des Luciferasesubstrats (EnduRen) verwendet wird, da es kein Phenolrot enthält, was die Empfindlichkeit des Assays verringert. Enthält HEPES, um den korrekten pH-Wert während der Lumineszenzmessung aufrechtzuerhalten, während sich die Zellen außerhalb des CO2-Inkubators befinden. Warm bei 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch.</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985</td><td>OptiMEM wird zur Verdünnung des GeneJuice-Transfektionsreagenzes verwendet. Auch andere serumfreie Medien wären geeignet. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Zur Supplementierung von Zellkulturmedien in einer Konzentration von 10 % v/v.</td></tr><tr><td>GeneJuice Transfektionsreagenz</td><td>Novagen</td><td>70967</td><td>Wenn eine andere Zelllinie als HEK293 verwendet wird, kann es erforderlich sein, das Verhältnis des Genejuice-Transfektionsreagenzes zur DNA in den Transfektionsmischungen anzupassen. Andere Transfektionsreagenzien können verwendet werden. Bei Verwendung eines alternativen Transfektionsreagenzes kann es erforderlich sein, die in den Transfektionsmischungen verwendete DNA-Menge gemäß den Anweisungen des Herstellers zu optimieren.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Verwenden Sie steriles DMSO, das für die Gewebekultur geeignet ist.</td></tr><tr><td>EnduRen lebendzelliges Substrat</td><td>Promega</td><td>E6481</td><td>Rekonstituiert EnduRen in einer Dosis von 34 mg/ml in DMSO. Bei Verdünnung von EnduRen in Kulturmedium kann sich ein Niederschlag bilden. Dadurch wird der Assay nicht beeinträchtigt. Rekonstituiertes EnduRen bei -20 & Grad lagern; C und vermeiden Sie mehrere Frost-Tau-Zyklen. Stellen Sie sicher, dass rekonstituiertes EnduRen vollständig aufgetaut ist, bevor Sie es in Nährmedium verdünnen.</td></tr></tbody></table>

untersuchung von protein-protein-interaktionen in lebenden zellen mit biolumineszenz-resonanz-energie-transfer

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays, die auf Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer (BRET) eine empfindliche und zuverlässige Mittel zur Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu überwachen. BRET ist die nicht-strahlende Energieübertragung von einem &quot;Geber&quot; Luciferase-Enzym, um eine &quot;Akzeptor-Fluoreszenzprotein. Bei der häufigsten Konfiguration dieses Assays ist die Spender Renilla reniformis-Luciferase und der Akzeptor gelb fluoreszierendes Protein (YFP). Da die Effizienz der Energieübertragung ist stark abstandsabhängige Beobachtung des BRET Phänomen erfordert, dass der Donor und der Akzeptor in der Nähe sein. Um eine Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen von Interesse in kultivierte Säugerzellen zu testen, wird ein Protein als Fusion mit Luciferase und die zweite als eine Fusion mit YFP ausgedrückt. Eine Interaktion zwischen den beiden Proteinen von Interesse kann die Donor-und Akzeptor nahe genug für die Energieübertragung auftreten zu bringen. Im Vergleich zu anderen Techniken für die Untersuchung von Protein-Protein-inWechselwirkungen, die BRET-Assay ist empfindlich, erfordert wenig Handhabungszeit und einige Reagenzien und ist in der Lage, Wechselwirkungen, die schwache, vorübergehende, oder abhängig von der biochemischen Umgebung innerhalb einer lebenden Zelle gefunden werden, sind zu erkennen. Es ist daher ein idealer Ansatz für die Bestätigung mutmaßlichen Wechselwirkungen von Hefe-Zwei-Hybrid-oder Massenspektrometrie Proteomik Studien vorgeschlagen, und außerdem ist es gut geeignet für die Zuordnung der Interaktion Regionen, die den Effekt von post-translationalen Modifikationen auf Protein-Protein-Wechselwirkungen und Bewertung der Auswirkungen von Mutationen in Patienten-DNA identifiziert.

Das Prinzip der BRET-Untersuchung ist in Fig. 2 dargestellt. Assay-Setup in den hier vorgestellten Experimenten verwendet, ist in Fig. 3 dargestellt. Die Erfassung eines starken BRET-Signal von Zellen mit einem Luciferase-YFP Fusionsprotein transfiziert bestätigt, dass die Energieübertragung zu beobachten war in dieser Versuchsanordnung (Fig. 4). Unsere Forschung konzentriert sich auf die Rolle der Familie von FOXP Transkriptionsrepressoren ...

Wechselwirkungen zwischen Proteinen sind von grundlegender Bedeutung für alle zellulären Prozesse. Verwendung Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer, kann die Wechselwirkung zwischen einem Paar von Proteinen in lebenden Zellen und in Echtzeit überwacht werden. Darüber hinaus können die Auswirkungen von potentiell pathogenen Mutationen zu beurteilen.

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Interaktion zwischen zwei Proteinen und lebenden kultivierten Zellen zu beobachten. Dies wird erreicht, indem die cDNAs für die beiden interessierenden Proteine in Plasmide kloniert werden, die die Kodiersequenz für Luciferase oder das gelbe fluoreszierende Protein, abgekürzt YFP, enthalten, um Vektoren zur Expression der Proteine in Säugerzellen zu erzeugen. In einem zweiten Schritt werden die Plasmide in kultivierte Zellen transfiziert, was zur Expression von YFP- und Luciferase-Fusionsproteinen führt.Anschließend wird den Zellen das Luciferase-Substrat zugesetzt, um die Lichtemission der Luciferase einzuleiten. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eine Wechselwirkung zwischen den beiden Fusionsproteinen, die auf Energietransfer von LUCIFERASE zu YFP beruht. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Co-Immunpräzipitation besteht darin, dass Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen beobachtet werden können.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Funktionalen Genomik zu beantworten, indem bestimmt wird, ob eine bei einem Patienten gefundene Mutation Protein-Protein-Wechselwirkungen beeinflusst. Die Demonstration des ersten Schritts des Verfahrens wird von RAB Tric, einem Doktoranden aus meinem Labor, durchgeführt. Erstellen Sie zunächst die Plasmide, wie im Textprotokoll beschrieben. Schätzen Sie die Konzentration anhand der Absorption bei 260 Nanometern ab.Bestimmen Sie die molare Masse jedes Plasmids, indem Sie die Anzahl der Basenpaare mit 650 Daltons multiplizieren. Verwenden Sie die Konzentration und die molare Masse, um die molare Konzentration jeder Plasmidpräparation zu berechnen. Verdünnen Sie die Plasmid-DNA-Präparationen auf eine Konzentration von 36 Nanomolar.Dies sind die Arbeitsstämme, die zur Herstellung der DNA-Gemische verwendet werden. Für die Transfektion. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Herstellung der DNA-Gemische. Um den Erfolg sicherzustellen, erstellen wir Tabellenkalkulationen, um die korrekte Menge jedes Bestandteils vorab zu berechnen, und gehen äußerst sorgfältig vor.Bei der Herstellung der DN-Gemische: Bereiten Sie zunächst ein Kontroll-DNA-Gemisch mit 1800 Nanogramm Füllplasmid in einem Endvolumen von 20 Mikroliter Wasser vor. Danach stellen Sie ein zweites kontrolliertes DNA-Gemisch her, indem Sie fünf Mikroliter des P-Look-Kontrollkonstrukts ansetzen.Fügen Sie Füllplasmid hinzu, um die Gesamt-DNA-Masse auf 1800 Nanogramm zu bringen. Geben Sie Wasser hinzu, um das Endvolumen auf 20 Mikroliter aufzufüllen. Bereiten Sie eine dritte Kontroll-DNA-Mischung zu, die fünf Mikroliter des P-Look-Kontrollkonstrukts und fünf Mikroliter des PYFP-Kontrollkonstrukts enthält.Fügen Sie wie zuvor Füllplasmid und Wasser hinzu. Richten Sie schließlich eine vierte Kontroll-DNA-Mischung ein, die fünf Mikroliter des positiven Kontrollkonstrukts enthält. Fügen Sie erneut Füllplasmid und Wasser in gleicher Weise hinzu.Bereiten Sie als Nächstes 3D-NA-Mischungen vor, um die Homodimerisierung eines Proteins der Untersuchung x zu testen. Kombinieren Sie für jede DNA-Mischung fünf Mikroliter des entsprechenden P-Look-Konstrukts und fünf Mikroliter des PYFP-Konstrukts unter Zugabe von Füllplasmid und Wasser. Bereiten Sie anschließend DNA-Mischungen vor, um eine Interaktion zwischen einem Paar von Proteinen der Untersuchung X und Y zu testen. Kombinieren Sie für jede DNA-Mischung fünf Mikroliter des entsprechenden P-Look-Konstrukts und fünf Mikroliter des PYFP-Konstrukts zusammen mit Füllplasmid und Wasser. Ernten Sie subkonfluente HEC-293-Zellen aus einem 75 cm²-Fläschchen und verdünnen Sie 10 % der Gesamtzellzahl in 13 Milliliter Kulturmedium.Gegeben Sie anschließend 130 Mikroliter Zellsuspension in jedes Loch einer weißen, klaren 96-Loch-Gewebekulturplatte mit klarem Boden, bevor Sie die Zellen 24 Stunden lang kultivieren. Berechnen Sie danach die Anzahl der zu transinfizierenden Löcher, indem Sie die Anzahl der DNA-Mischungen mit drei multiplizieren. Bereiten Sie eine Master-Mischung vor, die pro Loch 6,3 Mikroliter Medium bei Raumtemperatur ohne Serum und 0,18 Mikroliter Transfektionsreagenz enthält; mischen Sie durch Vortexen und inkubieren Sie dann fünf Minuten bei Raumtemperatur.Danach 20 µL Medium ohne Serum und Transreagenz-Mastermix in die erforderliche Anzahl an Röhrchen abpipettieren. Jeweils zwei µL der entsprechenden DNA-Mischung in jedes Röhrchen hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Schließlich jeweils drei Vertiefungen mit jedem Transreagenz-Mix transinfizieren.Geben Sie 6,5 µL Transfektionsmix pro Vertiefung ab, bevor Sie die Zellen weitere 36 bis 48 Stunden kultivieren. Um das BRET-Signal zu messen, lösen Sie zunächst das Luciferase-Substrat für lebende Zellen mit 34 mg/mL in DMSO durch Vortexen auf.Rekonstitiertes Lebendzell-Luciferase-Substrat im Verhältnis 1:1000 in Substratverdünnungspuffer verdünnen und diesen vorher auf 37 Grad Celsius erwärmen. 50 µL Substratverdünnungspuffer pro Gut entnehmen und kurz vortexen, um die Lösung zu mischen. Ein Niederschlag kann sich bilden, beeinträchtigt den Assay jedoch nicht.Aspirieren Sie das Kulturmedium von der 96-Loch-Platte und geben Sie 50 Mikroliter verdünntes, lebendes Zell-Luciferase-Substrat in jedes Loch, nachdem die Zellen mindestens zwei Stunden kultiviert wurden. Entfernen Sie den Deckel von der 96-Loch-Platte und inkubieren Sie die Platte 10 Minuten bei Raumtemperatur im Luminometer. Messen Sie die Emission von LUCIFERASE und YFP nacheinander pro Loch gemäß den Angaben im Textprotokoll und integrieren Sie die Emissionssignale über 10 Sekunden.Mitglieder der Fox-P-Familie von transkriptionellen Repressoren spielen eine Rolle bei der Gehirnentwicklung. Mutationen wurden mit Sprach- und Autismus-Spektrum-Störungen in Verbindung gebracht. FOX P2 ist bekannt dafür, Homodimere zu bilden, um den Brett-Assay zum Nachweis von Fox zu validieren.P zwei Homodimere Zellen wurden mit Konstrukten zur Expression von Luciferase als Donor oder YFP als Akzeptor transfiziert, die jeweils entweder an Fox P zwei oder an ein nukleäres Lokalisierungssignal fusioniert waren. Die kernzielgerichteten LUCIFERASE- und YFP-Proteine dienen als negative Kontrollen, während eine positive Kontrolle zur Detektion eines Brett dient. Signalzellen wurden außerdem mit einem Konstrukt zur Expression eines Luciferase-YFP-Fusionsproteins transfiziert.Der Anstieg des BRET-Signals zeigt, dass der BRET-Assay wirksam ist, um Fox P zwei-Homodimere nachzuweisen. Hier sind Fluoreszenzmikroskopieaufnahmen von Zellen dargestellt, die entweder mit YFP, das an ein nukleäres Lokalisierungssignal fusioniert ist, oder mit YFP, das an FOX P zwei fusioniert ist, transfiziert wurden. Die Spezifität der Interaktion wurde gezeigt, indem eine Mutation in FOX P zwei eingeführt wurde, die bekanntermaßen die Dimerisierung stört. Dabei wurden Luciferase-Fox P zwei-delta E 400 und YFP-Fox P zwei-Fusionsproteine gemeinsam exprimiert.Im Vergleich zur gleichzeitigen Expression von Fox B zwei und YFP Fox B zwei wurde eine Verringerung des Breath-Signals beobachtet. Diese Signalreduktion war nicht auf eine Veränderung der subzellulären Lokalisation des mutierten Proteins zurückzuführen. Um die Wirksamkeit des Bret-Assays bei der Detektion typischer Interaktionen zu beurteilen, wurde die Interaktion von Fox P zwei mit Fox P eins getestet. Ein Brett-Signal wurde in beiden möglichen Konfigurationen des Assays beobachtet. Darüber hinaus wurde die Eignung des Brett-Assays zur Detektion der Interaktion von Fox P zwei mit nicht-FOX P-Proteinen untersucht, indem die Interaktion mit CT BP eins analysiert wurde, einem transkriptionellen Co-Repressor und bekannten Interaktionspartner von Fox P zwei.Die Fox P2-CT BP1-Interaktion wurde mittels des BRET-Assays nachgewiesen, wenn Fox P2 das Donor-Fusionsprotein und CT BP1 der Akzeptor war, jedoch nicht in der umgekehrten Anordnung. Die Interaktion zwischen FOX P2 und CT BP1 wurde beobachtet, obwohl nur ein geringer Anteil von CT BP1 im Kern lokalisiert war, was die Empfindlichkeit dieses Assays unterstreicht. Schließlich wurde das BRET-Assay eingesetzt, um die Auswirkungen pathogener Mutationen in Fox P2 auf Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen.Es wurden zwei Punktmutationen in Fox P zwei beschrieben, die eine seltene autosomal-dominante Störung verursachen, die die Sprache und Sprachentwicklung betrifft. Die Fähigkeit der mutierten Proteine, mit dem Wildtyp-Fox P zwei zu dimerisieren, wurde mittels BRET-Assay untersucht. Die R 3 28 X-, aber nicht die R 5 53 H-Mutation, stört die Dimerisierung, wie die Ergebnisse mit Wildtyp-Fox B zwei als Donor und mutiertem Fox B zwei zeigen.Wie der Akzeptor zeigt, wurden für die umgekehrte Konfiguration dieselben Ergebnisse beobachtet. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie der Brot-Assay zur Überwachung von Protein-Protein-Interaktionen angewendet wird. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Zellbiologie, um Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen zu untersuchen.Nach Durchführung dieses Verfahrens können zusätzliche Techniken angewendet werden, um die Aktivität Ihres Proteins von Interesse zu analysieren, um die funktionellen Konsequenzen einer beobachteten Protein-Protein-Interaktion zu bewerten.

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Forschung

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Biologie

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Die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen ist bei der Bestimmung der räumlich-zeitliche Regulation der zellulären Signalübertragung wichtig. Hier beschreiben wir bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) als eine einfache Methode zur Überwachung der räumlichen Wechselwirkungen von Proteinen in der Zelle.

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Erweiterung der Grundlagen und Anwendbarkeit der Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL) durch Vermessung der einschlägigen Grundsätze und demonstriert seine Kompatibilität mit einer Vielzahl von Fluorophore und Antikörper-bezogene Bedingungen.

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Wir beschreiben hier eine verbesserte Lumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (LRET) Verfahren, wo wir eine Protease-Schnittstelle zwischen dem Spender und Akzeptor-Fluorophor Stellen einzuführen. Diese Modifikation erlaubt es uns, spezifische LRET Signale aus Membranproteinen von Interesse, so dass für die Untersuchung von Membranproteinen ohne Proteinreinigung erhalten.

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Der Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen zwei Fluorophor-Molekülen kann zur Untersuchung von Proteininteraktionen in der lebenden Zelle verwendet werden. Hier wird ein Protokoll zur Verfügung gestellt, wie FRET in lebenden Zellen gemessen werden kann, indem die sensibilisierte Emission des Akzeptors und das Abschrecken des Donormoleküls mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie detektiert werden.

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Dieses Protokoll beschreibt einen BRET-basierten Assay zur Messung der Wechselwirkungen der CRAF-Kinase mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen. Das Protokoll beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Zellen, zum Ablesen der BRET-Emissionen und zur Datenanalyse. Ein Beispielergebnis mit der Identifizierung geeigneter Kontrollen und der Fehlerbehebung für die Assay-Optimierung wird ebenfalls vorgestellt.

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Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die räumlich-zeitliche Dynamik der Akt-Aktivierung und Phosphorylierung in lebenden HepG2-Zellen zu quantifizieren. Die Förster-Resonanzenergietransfer-Bildgebung (FRET) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das wertvolle Einblicke in die Insulinsignalwege und die Stoffwechselregulation in Krebszellen liefert.

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