Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Interaktion zwischen zwei Proteinen und lebenden kultivierten Zellen zu beobachten. Dies wird durch die Subklonierung der CDNAs für die beiden interessierenden Proteine in Plasmide erreicht, die die Beschichtungssequenz für Luciferase oder gelb fluoreszierendes Protein, abgekürzt YFP, enthalten, um Vektoren für die Expression von Proteinen in Säugetierzellen zu erzeugen. In einem zweiten Schritt werden die Plasmide in kultivierte Zellen transfiziert, was zur Expression von YFP- und Luciferase-Fusionsproteinen führt.

Als nächstes wird den Zellen Luciferase-Substrat zugesetzt, um die Lichtemission der Luciferase zu initiieren. Es werden Ergebnisse erzielt, die eine Interaktion zwischen den beiden Fusionsproteinen basierend auf dem Energietransfer von LUCIFERASE zu YFP zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Fällung besteht darin, dass sie es ermöglicht, Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu beobachten.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der funktionellen Genomik zu beantworten, indem sie bestimmt, ob eine bei einem Patienten gefundene Mutation die Protein-Protein-Wechselwirkungen beeinflusst. Der erste Schritt des Verfahrens wird von RAB tric, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert, um mit der Erstellung der Plasmide zu beginnen, wie im Textprotokoll beschrieben. Schätzen Sie die Konzentration auf der Grundlage der Extinktion bei 260 Nanometern.

Bestimmen Sie die Molekülmasse jedes Plasmids, indem Sie die Anzahl der Basenpaare mit 650.Dalton multiplizieren. Verwenden Sie die Konzentration und die Molekülmasse, um die molare Konzentration jedes Plasmidpräparats zu berechnen. Die Plasmid-DNA-Präparate werden auf eine Konzentration von 36 Nanomolaren verdünnt.

Dabei handelt es sich um die Arbeitsmaterialien, die zur Herstellung der DNA-Mischungen verwendet werden. Zur Transfektion. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Einrichtung der DNA-Mixe Um den Erfolg zu gewährleisten, erstellen wir Tabellenkalkulationen, um die richtige Menge jeder Komponente im Voraus zu berechnen, und wir gehen mit großer Sorgfalt vor.

Beim Einrichten der DN-Mischungen. Bereiten Sie die erste Kontroll-DNA-Mischung vor, die 1800 Nanogramm Füllstoffplasmid in einem endgültigen Volumen von 20 Mikrolitern Wasser enthält. Richten Sie dann einen zweiten kontrollierten DNA-Mix ein, indem Sie fünf Mikroliter des P-Look-Kontrollkonstrukts vorbereiten.

Fügen Sie ein Füllstoffplasmid hinzu, um die Gesamt-DNA-Masse auf 1800 Nanogramm zu bringen. Fügen Sie Wasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 20 Mikroliter zu bringen. Bereiten Sie eine dritte Kontroll-DNA-Mischung vor, die fünf Mikroliter des P-Look-Kontrollkonstrukts und fünf Mikroliter des PYFP-Kontrollkonstrukts enthält.

Füllstoff, Plasmid und Wasser wie zuvor zugeben. Richten Sie schließlich eine vierte Kontroll-DNA-Mischung ein, die fünf Mikroliter des Positivkontrollkonstrukts enthält. Fügen Sie auch hier Füllstoff, Plasmid und Wasser auf die gleiche Weise hinzu.

Bereiten Sie als Nächstes 3D-NA-Mischungen vor, um die Homodimerisierung eines Proteins von Interesse x zu testen. Kombinieren Sie für jeden DNA-Mix fünf Mikroliter des relevanten P-Look-Konstrukts und fünf Mikroliter des PYFP-Konstrukts und fügen Sie Füllstoff, Plasmid und Wasser hinzu. Bereiten Sie dann DNA-Mischungen vor, um auf eine Wechselwirkung zwischen einem Paar von Proteinen von Interesse X und Y zu testen. Kombinieren Sie für jede DNA-Mischung fünf Mikroliter des relevanten P-Look-Konstrukts und fünf Mikroliter des PYFP-Konstrukts zusammen mit Füllstoff, Plasmid und Wassergewinnung subkonfluenten hec 2 9 3-Zellen aus einem 75-Quadratzentimeter-Kolben verdünnen Sie 10 % der Gesamtzellen in 13 Milliliter Kulturmedium.

Geben Sie dann 130 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung einer weißen, 96-Well-Gewebekulturplatte mit klarem Boden, bevor Sie die Zellen 24 Stunden lang kultivieren. Berechnen Sie als Nächstes die Anzahl der zu transfizierenden Vertiefungen, indem Sie die Anzahl der DNA-Mischungen mit drei multiplizieren. Bereiten Sie einen Mastermix vor, der 6,3 Mikroliter Raumtemperatur, serumfreies Medium und 0,18 Mikroliter Transfektionsreagenz pro Vertiefung enthält, die durch Vortexen gemischt werden, bevor Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Geben Sie dann 20 Mikroliter Serum-Transfektionsreagenz-Mastermix in die erforderliche Anzahl von Röhrchen. Geben Sie zwei Mikroliter der entsprechenden DNA-Mischung in jedes Röhrchen und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zum Schluss transfizieren Sie mit jeder Transfektionsmischung drei Vertiefungen.

Geben Sie 6,5 Mikroliter Transfektionsmischung pro Vertiefung ab, bevor die Zellen für weitere 36 bis 48 Stunden kultiviert werden. Zur Messung des BRET-Signals. Zuerst wird das lebende Zell-Luciferase-Substrat bei 34 Milligramm pro Milliliter in DMSO durch Vortexen gelöst.

Verdünnen Sie das rekonstituierte lebende Zell-Luciferase-Substrat bei eins bis 1000 in Substratverdünnungsmedium und erwärmen Sie es bei 37 Grad Celsius. Lassen Sie 50 Mikroliter Substratverdünnungsmedium pro Well-Vortex mischen. Es kann sich ein Niederschlag bilden, der den Assay jedoch nicht beeinträchtigt.

Aspirieren Sie das Kulturmedium aus der 96-Well-Platte und geben Sie 50 Mikroliter verdünntes lebendes Zell-Luciferase-Substrat in jede Vertiefung ab, nachdem Sie die Zellen mindestens zwei Stunden lang kultiviert haben. Nehmen Sie den Deckel von der 96-Well-Platte ab und inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Luminometer. Messen Sie die Emissionen von LUCIFERASE und YFP jeweils gut gemäß den Angaben im Textprotokoll, integrieren Sie Emissionssignale über einen Zeitraum von 10 Sekunden.

Mitglieder der Fox P-Familie von transkriptionellen Repressoren spielen eine Rolle bei der Entwicklung des Gehirns. Mutationen wurden mit Sprach- und Autismus-Spektrum-Störungen in Verbindung gebracht. Es ist bekannt, dass FOX P two Homodimere bildet, um den Brett-Assay für den Nachweis von Fox zu validieren.

P zwei Homodimerzellen wurden transfiziert mit Konstrukten zur Expression von Luciferase als Donor oder YFP als Akzeptor, die entweder mit Fox P zwei oder einem nukleären Lokalisationssignal fusioniert wurden. Die nukleären Zielproteine LUCIFERASE und YFP dienen als Negativkontrollen als Positivkontrolle für den Nachweis eines Bretts. Signalzellen wurden auch mit einem Konstrukt zur Expression eines Luciferase-YFP-Fusionsproteins transfiziert.

Die Zunahme des BRET-Signals zeigt, dass der Bret-Assay wirksam bei der Detektion von Fox P zwei Homodimeren ist. Fluoreszenzmikroskopische Bilder von Zellen, die mit YFP transfiziert wurden, das mit einem Kernlokalisationssignal fusioniert wurde, oder mit YFP, das mit FOX P two fusioniert wurde, sind hier gezeigt. Die Spezifität der Interaktion wurde durch die Einführung einer Mutation in FOX P two demonstriert, von der bekannt ist, dass sie die Dimerisierung stört. Bei der Luciferase wurden Fox P zwei Delta E 400 und YFP Fox B zwei Fusionsproteine co-exprimiert.

Es wurde eine Verringerung des Atemsignals im Vergleich zur gleichzeitigen Expression von Fox B zwei und YFP Fox B zwei beobachtet. Diese Signalreduktion war nicht auf eine Veränderung der subzellulären Lokalisation des mutierten Proteins zurückzuführen. Um die Wirksamkeit des Bret-Assays bei der Detektion typischer Wechselwirkungen zu beurteilen, wurde die Interaktion von Fox P zwei mit Fox P 1 getestet. Ein Brett-Signal wurde in beiden möglichen Konfigurationen des Assays beobachtet. Darüber hinaus wurde die Eignung des Brett-Assays oder des Nachweises einer Wechselwirkung von Fox P zwei mit Nicht-FOX P-Proteinen getestet, indem die Interaktion mit CT BP one, einem transkriptionellen Co-Repressor und bekannten Fox P 2-Interaktionspartner, untersucht wurde.

Die Wechselwirkung zwischen Fox P und zwei CT BP eins wurde durch den Brett-Assay nachgewiesen, wenn Fox P zwei das Donorfusionsprotein und CT P eins der Akzeptor war, jedoch nicht in der umgekehrten Konfiguration. Die Interaktion zwischen FOX P two und CT P 1 wurde beobachtet, obwohl nur ein geringer Teil von CT BP 1 im Zellkern lokalisiert war, was die Sensitivität dieses Assays unterstreicht. Schließlich wurde der Bret-Assay eingesetzt, um die Auswirkungen pathogener Mutationen in Fox P two auf Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen.

wurde berichtet, dass zwei Punktmutationen in Fox P zwei eine seltene autosomal-dominante Störung verursachen, die das Sprechen und die Sprache beeinträchtigt. Die Fähigkeit der mutierten Proteine, mit dem Wildtyp-Fuchs P zwei zu dimerisieren, wurde mit dem BRET-Assay untersucht. Die R 3 28 X, nicht aber die R 5 53 H-Mutation, unterbricht die Dimerisierung der Ergebnisse mit dem Wildtyp Fox B zwei als Spender und der Mutante Fox B two.

Wie die Akzeptoren gezeigt sind, wurden die gleichen Ergebnisse für die umgekehrte Konfiguration beobachtet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Brot-Assay zur Überwachung von Protein-Protein-Wechselwirkungen anwenden können. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie den Weg, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu erforschen.

Nach diesem Verfahren können zusätzliche Techniken durchgeführt werden, um die Aktivität Ihres interessierenden Proteins zu testen und die funktionellen Konsequenzen einer beobachteten Protein-Protein-Interaktion zu bewerten.