Eine einfache und schnelle Protokoll zur Messung neutralen Lipiden in Algenzellen mit Fluoreszenz

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, den neutralen Lipidgehalt von Algenzellen mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffs Nilrot zu messen. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst in einer Ethanollösung suspendiert werden, um die Zellwand und die Zellmembran durchlässig zu machen. In einem zweiten Schritt wird der fluoreszierende Farbstoff Nilrot zugesetzt, der in die Zellen gelangt und sich in den unpolaren Bereichen der Zelle, einschließlich der neutralen Lipidkörper, anreichert.

Anschließend werden die Proben einer Anregungslichtquelle von 530 Nanometern ausgesetzt, wodurch das in den neutralen Lipidkörpern absorbierte Nilrot bei 604 Nanometern fluoresziert. Die Ergebnisse werden im Massenmaßstab erzielt, indem die einzelnen Tests in einem Mikrotiter-Multipl durchgeführt und ein Spektralphotometer verwendet wird, um schnelle Fluoreszenzmesswerte zu erzeugen. Die Messwerte zeigen einen linearen Zusammenhang zwischen dem neutralen Lipidgehalt der lgalen Zellen und der Intensität der Fluoreszenzmessung.

Die Umrechnung von Fluoreszenzmessungen in den Ölgehalt kann mit einer Kalibrierkurve erreicht werden, die mit Zellen bekannter Ölzusammensetzung erstellt wurde. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Protokollen, wie z. B. der gravimetrischen Methode Bly Dire, besteht darin, dass sie eine schnelle Bestimmung des neutralen Lipidgehalts mit Materialien ermöglicht, die den meisten Laboren zur Verfügung stehen. Diese Methode liefert eine unmittelbare Rückmeldung über die Leistung von Bioprozessen während der Algenkultivierung.

Auch der hohe Durchsatz, den der 96-Well-Plattenleser ermöglicht, ist ideal für Screening-Studien und faktorielle Experimente. Obwohl diese Technik für Chlorella und s Desus optimiert wurde, kann sie leicht für die Analyse anderer Lgal-Spezies modifiziert werden. Okay. Entnehmen Sie zunächst ein Probenvolumen aus der wachsenden Algenkultur, das mindestens 200 Milligramm Trockenbiomasse liefert.

400 bis 600 Milligramm sind vorzuziehen. Zentrifugieren Sie die Probe 10.000 Mal 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius. G, entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit dem gleichen Volumen Phosphatpuffer, der auf den gleichen pH-Wert wie das Wachstumsmedium formuliert ist.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt drei Waschschritte. Das Pellet in entionisiertem Wasser resuspendieren und in eine vorgewogene Wiegeschale geben. Lassen Sie die Probe 48 Stunden lang bei 50 Grad Celsius trocknen.

Die getrockneten Algenkulturen können für die zukünftige Verwendung bei Raumtemperatur gelagert werden. Messen Sie etwa 50 Milligramm trockene Algenbiomasse in einer Molkeschale. Übertragen Sie die Biomasse bei Bedarf in einen mit Hexan vorgewaschenen Mörser, waschen Sie die Molkeschale mit einer kleinen Menge Hexan mit einer früheren Pipette, um die Biomasse vollständig in die Mörserordnung zu übertragen.

Mahlen Sie anschließend die Algenbiomasse fünf Minuten lang mit einem Stößel. Beginnen Sie mit einem sanften Mahlen und steigern Sie die Intensität nach und nach. Mahlen Sie die Biomasse zu einer feinen und glatten Paste.

Geben Sie während des Zeitraums von fünf Minuten einige Milliliter Hexan in den Mörser und mischen Sie die resultierende Aufschlämmung mit dem Stößel, bis sie homogenisiert ist. Stellen Sie sicher, dass alle Zelltrümmer, die an den Wänden des Mörtels haften, freigeschlagen und in der Flüssigkeit suspendiert werden. Übertragen Sie anschließend das Hexanzellenmassengemisch in ein kompatibles Zentrifugenröhrchen.

Wiederholen Sie dies drei- bis fünfmal, bis die gesamte Biomasse in das Zentrifugenröhrchen überführt wurde. Zentrifugieren Sie die Probe 20 Minuten lang bei 10.000 Mal bei vier Grad Celsius. G.Nach dem Zentrifugieren den Überstand vorsichtig in eine vorgewogene Metallschale pipettieren, die in der Abzugshaube aufbewahrt werden kann.

Führen Sie eine zweite Hexanextraktion durch, indem Sie dem Pellet drei Milliliter Hexan hinzufügen und kräftig vortexen. Wiederholen Sie eine Minute lang die Zentrifugation und den Transfer des Überstands. Die Masse des extrahierten Öls wird gravimetrisch bestimmt, nachdem das Hexan vollständig verdampft ist.

Für die fluormetrische Quantifizierung sind alle Algenproben mit der gleichen Biomassekonzentration und auf die gleiche Weise wie die bei der Messung verwendeten Standards vorzubereiten. Tun Sie dies, indem Sie vorgetrocknete Proben in der entsprechenden Menge Phosphatpuffer suspendieren. Falls erforderlich, verwenden Sie einen Homogenisator, um die Wiederbelebungssuspension getrockneter LGA-Zellen zu erleichtern.

Mischen Sie für jede Probe 80 Mikroliter einer vorbereiteten 30%igen Ethanollösung, 10 Mikroliter einer vorbereiteten Nilrotlösung und 10 Mikroliter Algensuspension in einer einzigen Vertiefung einer 96-Well-Platte. Um die Variabilität der Fluoreszenzmessung richtig zu berücksichtigen, führen Sie fünf Wiederholungen jeder Probe durch. Führen Sie als Nächstes eine Zwei-Punkt-Kalibrierungskurve mit zuvor vorbereiteten Standards durch.

Um die täglichen Schwankungen des Instruments und der Vorbereitung auf die Durchführung der Fluoreszenzmessungen in einem Multi-Well-Plattenleser-Spektralphotometer zu berücksichtigen, stellen Sie die Parameter so ein, dass sie bei 1.200 U/min schütteln und 30 Sekunden lang drei Millimeter umkreisen, gefolgt von einer Inkubation bei 40 Grad Celsius für 10 Minuten. Ein weiteres Schütteln bei 1.200 U/min und 30 Sekunden lang drei Millimeter umkreisen, um Fluoreszenz mit Anregung bei 530 Nanometern und Emission bei 604 Nanometern aufzuzeichnen. Starte dann den Lauf als letzten Schritt.

Rechnen Sie die Fluoreszenzmessungen mit den Ergebnissen der internen Standards in den Ölgehalt um, um die Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen. Verwenden Sie die mit dem Nilrot-Fleck vorbereitete Probe, um einen Objektträger der Prozessprobe gemäß den Standardlaborverfahren zu erstellen. Beginnen Sie mit dem Mikroskop im Transmissionsmodus, laden Sie den vorbereiteten Objektträger in das Mikroskop und lokalisieren Sie die Zellen in der gewünschten Vergrößerung.

Schalten Sie das Mikroskop nach dem Fokussieren vom Transmissions- in den Epi-Fluoreszenz-Beleuchtungsmodus um. Die Lichtquelle sollte nun direkt von der Objektivlinse kommen, was visuell bestätigt werden kann, indem der Raum zwischen Objektträger und Objektiv beobachtet wird. Setzen Sie einen grünen Anregungsfilter in die Lichtquelle und einen roten Emissionsfilter in den Beobachtungslichtweg ein.

Die Fluoreszenz der gefärbten Zellen sollte nun direkt durch das Okular sichtbar sein. Schalten Sie den Mikroskopbeobachtungsmodus vom Okular auf die montierte Kamera um und verwenden Sie die Betrachtungssoftware, um ein Bild der fluoreszierenden Küvetten aufzunehmen. Spezifische Einstellungen variieren je nach Instrument, Ausrüstung und Zelltyp.

Repräsentativen Algenzellen, die mit dem Farbstoff Nilrot gefärbt wurden, werden Bilder einer Prothe gezeigt, die in überschüssigem Stickstoff gezüchtet wurde, was zu einer sehr geringen intrazellulären Lipidakkumulation führte, die im Gegensatz zu Proben von OIDs gezeigt werden, die unter Stickstofflimitierung gezüchtet wurden. Unter Transmissionsbeleuchtung können die Lipidkörper der Zellen bei sorgfältiger Inspektion sichtbar gemacht werden, wo sie als glänzende kreisförmige Strukturen erscheinen und den Großteil des Zellvolumens ausmachen. Die hier gezeigten Zellen bestehen nur aus 5 % Öl nach Trockengewicht und enthalten keine signifikanten Mengen an Lipidkörpern, wenn sie den entsprechenden Lichtverhältnissen gezeigt werden.

Die Unterschiede in diesen Stichproben werden vergrößert. Die ölfetten Zellen erscheinen als fluoreszierende Ringe mit dunklen Körpern, während die ölreichen Zellen ein helles orangerotes Leuchten aufweisen, wo sie Lipidkörper angesammelt haben. Nilrot fluoresziert in Abhängigkeit von neutralen Lipiden, Phospholipiden, die sich an der Zellwand befinden, und unpolaren zellulären Proteinen bei unterschiedlichen Wellenlängen, weshalb die ölmageren Zellen als fluoreszierende Ringe mit dunklen Körpern erscheinen.

Diese Nichtspezifität ist auch die Ursache für die Hintergrundfluoreszenz während der Spektralphotometermessungen der neutralen Lipide unter den optimierten Bedingungen des Assays, Kalibrierungskurven mit R-Quadrat-Werten größer als 0,980 sind leicht erreichbar. Die Beziehung zwischen Zellölgehalt und Fluoreszenz wird nichtlinear, wenn die Zellen in einer Lösung gefärbt werden, in der ein Trägerlösungsmittel wie Ethanol fehlt. Die hier vorgestellten Daten haben ein R-Quadrat von 0,395 und wurden durch die Durchführung des Protokolls in einer 0%igen Ethanollösung erhalten.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 15 bis 20 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass alle Proben mit der gleichen Biomassekonzentration zubereitet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den neutralen Lipidgehalt von LGAL-Zellen sowohl mit herkömmlichen Hexan-Extraktionsprotokollen als auch mit dem einfacheren NAL-Rotfluoreszenz-Färbeverfahren messen können.