Name: Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Lernen Sie die Reinigung des CFTR-Proteins in Saccharomyces cerevisiae für strukturelle und funktionelle Studien. Diese Methode liefert milligrammreine Mengen funktionalen Proteins für die Arzneimittelentwicklung bei Mukoviszidose.

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Diese Arbeit wurde von der US-Cystic Fibrosis Foundation (CFF) durch ihre Struktur Consortium CFTR 3D finanziert. TR wurde von einem britischen CF Treu Stipendium und NC von einer britischen BBSRC Stipendium finanziert. Wir bekennen uns zu unserer Kollegen in der CFF CFTR 3D-Struktur Konsortium für ihre Hilfe und Beratung und für die Gestaltung der Codon-optimierten Huhn CFTR-Sequenz und Reinigung Tags.

1. Herstellung von Puffern <ol><li> Um den Bestand der 100x-Protease-Inhibitor zu machen (PI) Cocktail auflösen 96 mg AEBSF, 3,5 mg Chymostatin, 10 mg E64, 16,5 mg Leupeptin, Pepstatin 16,5 mg, 348 mg PMSF und 4 mg Bestatin in 20 ml DMSO. Stellen Sie 1 ml Aliquots und bei -20 ° C Um eine 100x Stock Benzamidin zu machen, lösen sich 720 mg in 20 ml Reinstwasser (ddH2O) und Speicher in 1 ml Aliquots bei -20 ° C. Diese Menge reicht für eine Reinigung. In allen Puffern werden PI und Benzamidin Aktien zu einem 1:100-Verdünnung eingesetzt. </li><li> Vorbereiten &quot;mPIB &#39;(0,3 M Tris pH 8, 0,3 M Saccharose, 2 mM DTT) und&quot; CFTR&#39; (50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) Glycerin, 1 mM DTT) Puffer und Kälte auf 4 ° C . Vor Gebrauch hinzuzufügen 1:100 der Protease-Inhibitor-Cocktail und 1:100 Benzamidin nach dem Volumen der mPIB verwendet, um die Zellpellet zu resuspendieren (zB Einsatz 3.5 ml PI und 3,5 ml Benzamidin in einem Gesamtvolumen von 350 ml mPIB). </li><li> Bereiten solubilization Puffer. Lyso-Phosphatidyl-Glycerin-14 (LPG)-Lösungspuffer (50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) Glycerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, Protease-Inhibitoren (PI) und 4% (w / v) LPG) und Dodecylmaltosid (DDM) Lösungspuffer (50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) Glycerin, 1 M NaCl, 1 mM DTT, Protease-Inhibitoren, 4% (w / v) DDM). Puffer können in einem Ultraschallbad (35 W, 40 kHz) mit Ultraschall behandelt werden, um mit der Verbreitung von Waschmittel zu erleichtern, aber vermeiden Vortexen des Gemisches, wie dies erzeugt Blasen. Kühle auf 4 º C vor der Verwendung. </li><li> CFTR Reinigungspuffer für den LPG-Reinigung ist 50 mM Tris, 10% (v / v) Glycerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (w / v) LPG-14 und Proteaseinhibitoren. Planen 350 ml dieses Puffers und 150 ml des gleichen Puffers plus 1 M Imidazol. Der pH-Wert der beiden Puffer 8. </li><li> Der Puffer für die Reinigung im DDM besteht aus 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) Glycerin, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (w / v) DDM. Planen 350 ml dieses Puffers und 150 ml des gleichen Puffers plus 1 M Imidazole. Der pH-Wert der beiden Puffer 8. </li><li> Für die Gelpermeationschromatographie (GPC)-Puffer LPG enthält, bereiten 50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) Glycerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,05% (w / v) LPG-14. GPC mit DDM bereiten Puffer von 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) Glycerin, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (w / v) DDM. Alle Puffer und ddH 2 O auf der GPC-Säule verwendet wird, sollte gefiltert (0,2 &amp;mgr; m-Filter) und vor der Verwendung entgast. </li><li> SDS-PAGE-Probenpuffer (2 x die Arbeitskonzentration): 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 5% (v / v) Glycerin, 5 mM EDTA, 0,02% (w / v) Bromphenolblau. Stellen Sie 700 ul Aliquots und bei -20 ° C Vor der Verwendung, 200 ul 20% (w / v) Natriumdodecylsulfat (SDS) und 100 ml frisches 0,5 M DTT. Inkubation für mindestens 10 min mit der Probe bei Raumtemperatur vor dem Laden auf Gel. Nicht erhitzen; Dies wird das GFP denaturieren und kann dazu führen CFTR zu aggregieren. </li><li> Um Lipid-Aktien für die Rekonstitution zu machen, lösen eine 4:1 (w / w) Mischung von E. coli Lipide eind Cholesterin in Chloroform und Methanol (2:1 v / v), und trocken in eine Glasampulle unter N 2-Gas für 2 Stunden, um einen Lipidfilm zu bilden. Hinzufügen GPC-Puffer (ohne NaCl) auf eine Lipidkonzentration von 40 mg / ml und nach mit Verwirbelung und Beschallung (35 W, 40 kHz), um die Lösung zu klären. </li><li> Für den ATPase-Assay herzustellen 100x Bestände ATPase-Inhibitoren durch Auflösen SCH28080 bis 1 mM in DMSO, NaSCN bis 1 M in ddH 2 O und Oligomycin bis 2,5 mM in 100% (v / v) Ethanol. Shop bei -20 ° C 100 ml zu der ATPase-Puffer mit 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NH 4 Cl, 5 mM MgSO &amp;sub4; und 0,02% (w / v) NaN 3. Dies kann bei Raumtemperatur gelagert und für mehrere Tests verwendet werden. Eine 5 mM ATP Lager unmittelbar vor der Verwendung und auf Eis zu halten. (NB Verwenden Na 2 ATP zu hohe Hintergrundsignal von Phosphat in dem Test zu verhindern). Vorbereitung der SDS-Stop-Lösung (12% (w / v) SDS in ddH 2 O). </li><li> Für die Erkennung Chifflet vorzubereiten Puffer A (3% (w/ V) Ascorbat, 0,5% (w / v) Ammoniummolybdat, 0,5 M HCl) unmittelbar vor dem Gebrauch und Puffer B (2% (w / v) Natrium-Citrat, 2% (w / v) Natrium-meta-Arsenit, 2% (v / v) Essigsäure). </li></ol> 2. Isolierung von Hefe-Mikrosomen <ol><li> S. cerevisiae Huhn CFTR exprimieren, werden wie in O&#39;Ryan et al (2012) 14 gewachsen.. Speichern das Material aus einer 20 l-Fermentation in zwei Aliquots bei -80 ° C für bis zu 6 Monate. </li><li> Tauen Sie ein Aliquot von Zellen schnell und resuspendieren in 3 ml pro Gramm gekühlt mPIB von Zellen. </li><li> Stören Zellen in einer Kugelmühle mit Glasperlen von 425-600 Mikrometer Durchmesser. Verwenden Sie fünf 1 min Perioden der Zellaufschluss durch 1 min Ruhezeiten getrennt. (Die Ruhezeiten sind wichtig, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht während der Unterbrechung aufgeheizt.) </li><li> Überwachung der Zellaufschluß durch Zentrifugation einer 1 ml-Probe des Zelllysats aus der Kugelmühle. Zentrifuge (12.000 × g, 4 ° C, 5 min) in einer Tisch zentrifuge. Verdünnen Sie den Überstand in 1:50 mit mPIB in einer Küvette und messen Sie die A 380. Wenn A 380&gt; 0.1, oder hat trotz mehrerer wiederholt Wulst-Prügel Zyklen gestoppt zu, mit dem folgenden Schritt fort. Wenn nicht, wiederholen 2,3-2,4. </li><li> Zentrifugieren Sie die Gesamt Zelllysat (12.000 x g, 4 ° C, 20 min). Bewahren Sie den Überstand. Entsorgen Sie die Pellet (mit aufgebrochenen Zellen und Mitochondrien), aber wenn es irgendeinen Zweifel über die Effizienz der Zellbruch (siehe 2.4), dann behalten die Pellet auch. </li><li> Zentrifugieren des Überstands aus dem vorherigen Schritt (200.000 × g, 4 ° C, 1,5 h). Überstand verwerfen und Resuspendieren der pelletiert mikrosomalen Membranen in CFTR-Puffer. Wenn die Mikrosomen werden für die Reinigung unter Verwendung DDM soll, ergänzen das CFTR-Puffer mit 1 M NaCl. </li><li> Wiederholen Sie die Zentrifugation der Membranfraktion suspendiert (100.000 x g, 4 ° C, 1 h), und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren der pelletiert Mikrosomen inein Mindestvolumen von CFTR-Puffer (endgültige Volumen 5-15 ml, insgesamt mikrosomalen Protein 70-200 mg). Ein Bradford-Assay kann verwendet werden, um die Gesamtkonzentration der mikrosomalen Proteine ​​25 zu bestimmen. Zusätzlich das Fluoreszenzemissionsspektrum der Membranen sollte gemessen (Anregung = 485 nm, Emission = 500-600 nm) und sollte eine deutliche GFP-Fluoreszenz-Peak (Maximum bei 512 nm) haben. CFTR spezifisch auf einem SDS-PAGE-Gel unter Bedingungen gescannt GFP-Fluoreszenz (Fig. 1) erkannt werden. </li><li> Blitz Einfrieren der resuspendiert Mikrosomen durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff und bei -80 ° C, oder fahren Sie mit Schritt 3 fort. </li></ol> 3. Solubilisierung von Mikrosomen <ol><li> Wenn gefroren, auftauen Mikros unmittelbar vor der Verwendung in einem Wasserbad auf 10 ° C eingestellt </li><li> Zur Solubilisierung von Membranen, verdünnt den Mikrosomen mit einem gleichen Volumen des jeweiligen Lösungspuffer (Schritt 1.3), um eine endgültige Konzentration von Waschmittel geben2% (w / v) und eine mikrosomale Proteinkonzentration von 5 mg / ml. Inkubieren dieser Mischung für 1 h bei 4 ° C unter Rühren (Schwenker). Bewahren Sie 200 ul für die Analyse. </li><li> Zentrifugieren der Mischung (100.000 × g, 4 ° C, 45 min). Entfernen Sie den Überstand der solubilisierten Membranproteine ​​enthalten, führt es durch einen 0,45 um Spritzenfilter speichern und auf Eis. Messung der Fluoreszenz des Überstands (wie in Schritt 2.8). </li><li> Resuspendieren der unlöslichen Fraktion in 1% (w / v) SDS-Lösung auf ein Volumen gleich der löslichen Fraktion. Messung der Fluoreszenz in dieser Fraktion und behalten ein Aliquot von 50 &amp;mgr; l SDS-PAGE-Analyse. </li></ol> 4. Nickel-Affinitätsreinigung von CFTR <ol><li> Link-zwei 5 ml Nickel-Sepharose Säulen in Reihe. Waschen mit 2 Säulenvolumina (CV) 20% (v / v) Ethanol, gefolgt von 2 CV ddH 2 O, dann waschen Sie die Säule mit 2 CV Solubilisierungspuffer (Schritt 1,4 bis 1,5), die 1 M Imidazol. Wiederholen Sie mit 2 CV von solubilizatIonen-Puffer fehlt Imidazol. </li><li> Hinzufügen Imidazol bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zu dem solubilisierten Material (Schritt 2.8) und manuell, wenn unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitschromatographievorrichtung das Material auf die Säule oder in eine Probenschleife geladen. </li><li> Laden des gelösten Materials auf die Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min, und wäscht mit 2 CV Imidazol-Puffer fehlen bei der gleichen Fließrate, um ungebundenes Material zu entfernen. Sammeln Fraktionen in 50 ml Falcon-Röhrchen. </li><li> Zum ersten Wäsche mit 3 CV des Reinigungspuffer mit 40 mM Imidazol bei einer Durchflussrate von 1 ml / min. 2 ml Fraktionen. </li><li> Für die zweite Wäsche mit 3 SV Reinigungspuffer mit 100 mM Imidazol. 2 ml Fraktionen. </li><li> Elute CFTR vom HisTrap Säule mit 3 CV von Reinigungspuffer mit 400 mM Imidazol. 2 ml Fraktionen. </li><li> Überwachung der Fluoreszenz in eluierten Fraktionen (Schritt 2.8). </li><li> Bewahren Aliquots der Peak-Fraktionen für die SDS-PAGE-Analyse. Flash-Freeze verbleibenden Spitzen fraction Proben und bei -80 ° C, bzw. den nächsten Reinigungsschritt weiter. </li></ol> 5. Gelpermeationschromatographie (GPC) Reinigung des CFTR <ol><li> Äquilibrieren die Spalte (Superose 6 10/300 GL) mit 1,2 CV ddH 2 O, gefolgt von 1,2 CV GPC-Puffer. </li><li> Während des Schrittes 5.1, konzentrieren die Ni-Affinitäts-gereinigten Fraktionen mit der höchsten GFP-Fluoreszenz unter Verwendung einer 100.000 MWCO Filterzentrifuge bei 4 ° C. Wenn Reinigung in DDM vermeiden Konzentrieren der Probe über einer Proteinkonzentration von 0,3 mg / ml Protein, wie dies signifikante Probenverlust. Entfernen Sie den Rückstand aus dem Konzentrator und Zentrifuge bei 100.000 x g für 30 min bei 4 ° C, um große Partikel zu pelletieren. </li><li> Spritzen Sie dieses Beispiel auf die Säule und Elution mit einem isokratischen Gradienten von 1,2 CV GPC-Puffer. Sammeln Sie 0,5 ml-Fraktionen. </li><li> Messen GFP-Fluoreszenz, wie in Abschnitt 2.8, diese Fraktionen, die CFTR identifizieren. Bewahren Sie eine kleine Menge (zB &lt;/ Em&gt; 50 &amp;mgr; l) von jedem für die Analyse durch SDS-PAGE. </li><li> Frieren Fraktionen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C </li></ol> 6. Rekonstitution von CFTR <ol><li> Hinzufügen Lipide (Schritt 1,8) zu dem gereinigten CFTR an Lipid-zu-Protein-Verhältnis 100:1 (w / w) und Inkubation bei 4 ° C für 1 Stunde. Ebenso eine lipid nur Steuerung eingestellt, und ersetzen Sie das gereinigte Protein mit dem gleichen Volumen GPC-Puffer. </li><li> Entfernen Sie Reinigungsmittel aus dem Protein / Lipid-Mischung mit hydrophoben Adsorbens Perlen. In 5 CV ddH 2 O, 5 CV 70% (v / v) Ethanol, 5 CV ddH 2 O und 5 CV GPC Puffer ohne Waschmittel waschen Adsorbens Perlen. 200 mg Adsorbens gewaschen Perlen pro ml gereinigtem Protein und Inkubieren bei 4 ° C über Nacht unter leichtem Schütteln. </li><li> Sammeln Sie die Rekonstitution Probe aus den Adsorbens Perlen in ein frisches Röhrchen mit einem dünnen-ended Pipettenspitze. </li></ol> 7. Messung der ATPase-Aktivität <ol><li> Bestimmen Sie die Rate der CFTR-spezifische ATPase-Aktivität unter Verwendung eines modifizierten Chifflet Assay 26,27 in einer 96-Well-Plattenformat. Mit Natriumphosphat-Stammlösung (0,65 mM) vorzubereiten 0-20 nmol Phosphat in einem Gesamtvolumen von 50 ul als Standards. Verwenden Sie eine 1:1-Mischung von CFTR-ATPase-Puffer und Puffer, um die Phosphat-Lager zu verdünnen. </li><li> Inkubation sowohl wiederhergestellt CFTR und leere Liposomen mit 1:100 (v / v) ATPase-Inhibitoren (Schritt 1,9) auf Eis für 10 min. Verwenden Sie mindestens 5 ug wiederhergestellt CFTR. </li><li> Hinzufügen ATP (Schritt 1,9) zu einer Endkonzentration von 2 mM und Inkubation bei 25 ° C für 1 Stunde. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 40 ul 10% (w / v) SDS (Schritt 1,9) zu jeder Vertiefung (einschließlich der Standards). </li><li> 100 l Puffer A (Schritt 1.10) und Inkubation für 10 min. Füge 100 &amp;mgr; l Puffer B (1,10) in jede Vertiefung und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 800 nm in einer 96-Well-Platte-kompatible UV / Vis-Spektrophotometers. </li><li> Konvertieren Absorption bei 800 nm in einer Menge an freigesetztem Phosphat mittels derPhosphat-Standards. Berechnen Sie die Geschwindigkeit der ATP-Hydrolyse nach Abzug der Hintergrundsignal (Liposomen nur Brunnen). </li><li> Für nicht wiederhergestellt CFTR folgen dem gleichen Protokoll mit CFTR-Puffer für die Hintergrundwerte. </li></ol>

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<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+determination+of+inorganic+phosphate+in+the+presence+of+labile+organic+phosphate+and+high+concentrations+of+protein%3A+Application+to+lens+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases.</a> Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).</li>
<li>Rothnie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+cholesterol+in+maintenance+of+P-glycoprotein+activity+and+its+membrane+perturbing+influence%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence.</a> Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen im Wettbewerb noch andere widerstreitenden Interessen in Bezug auf diese Arbeit.

Wir haben zuvor für die Überexpression des murinen CFTR 14 beschriebenen Verfahrens. Seit der Veröffentlichung des Protokolls, haben wir verschiedene Orthologen von CFTR Ausdruck gebracht haben und gereinigt mit dem gleichen System. Orthologe alle bisher getesteten und in dem Flüssiggas-Waschmittel gereinigt, während die DDM-Reinigung zeigte mehr Variation in verschiedenen Orthologe (Daten nicht gezeigt). Diese Flexibilität zeigt die Stärke des Hefe-Ansatz: Es ist möglich, viele Konstrukte relativ rasch, um ein für einen bestimmten Zweck zu wählen screenen. Waschen der Hefe-Mikrosomen mit Puffer, enthaltend 1 M NaCl vor der DDM-Ergebnisse in einer Reinigungsmikros Herstellung Solubilisierung und reduziert Verunreinigungen in späteren Phasen. Dieser Schritt ist nicht notwendig in der LPG-Protokoll als die endgültige CFTR Probe&gt; 90% rein, ohne die Mikros waschen. Außerdem, Reinigung im DDM erfordert mehrere Änderungen der Puffer zur Solubilisierung einnd Reinigung, nämlich die zusätzliche Zugabe von Glycerin und Salz. Zusammen stellen diese Zusätze deutlich die Bindung des DDM-solubilisierten Protein an der Säule erhöht. Das DDM Reinigungsmethode hat Raum für Verbesserungen, insbesondere die Entnahme eines 40 kDa großen Verunreinigung, die durch Massenspektrometrie beurteilt, ist aufgrund der Hefe ribosomalen Untereinheit L3, die eine inhärente Affinität für Nickel Harz zu haben scheint. Es gibt keinen offensichtlichen polyHis-Sequenz in der L3-Protein, aber Prüfung der 3D-Struktur, wenn das Ribosom gebunden (PDB = 1FFK) zeigt, dass der gefaltete L3-Untereinheit hat ein Potential polyHis Cluster. Dass diese Band ist in LPG-gereinigte Material weniger problematisch kann aufgrund der härteren LPG Reinigungsmittel sein. Obwohl die Reinigung in DDM scheint schlechter als die in der LPG zu sein, kann milder Detergenzien wie DDM mehr mit funktionellen und strukturellen Analysen kompatibel sein und haben bereits in mehreren Röntgen crystall verwendetographic Studien von Membranproteinen 15-21. Ferner bezeichnet unsere Ergebnisse, dass die Verwendung von LPG führt zum Verlust der ATPase-Funktion in Bezug auf die Reinigung CFTR in DDM. Daher würden wir die LPG-basierte Reinigungsprotokoll für die Erzeugung von CFTR wobei die Reinheit entscheidend empfehlen, beispielsweise in Anwendungen wie der Charakterisierung von posttranslationaler Modifikationen, oder bei der Erzeugung von Antikörpern, die LPG-basiertes Protokoll gewählt werden würde . Auf der anderen Seite in Anwendungen, bei denen die Aktivität und vollständig nativen Zustand des Proteins ist wesentlich, würden wir die DDM-basiertes Protokoll als eine bessere Option vorschlagen. Abschließend Dieses Protokoll beschreibt ein reproduzierbares Verfahren zur Isolierung von CFTR in der zwitterionischen Detergens-LPG 14 oder das nicht-ionische Detergens DDM. Als solche zeigt eine größere Palette von Reinigungsbedingungen für CFTR als zuvor berichtet worden, 10-13. Zusätzlich Milligramm-Mengen von gereinigtem CFTR kannunter Verwendung dieser Verfahren, wenn sie mit einem hohen Volumen Hefewachstum System wie einem 20 L Fermenter und einer hohen Kapazität Zellerntesystem, wie ein 6 L niedriger Geschwindigkeit Zentrifugenrotor in Verbindung erhalten. Das erhaltene CFTR einen spalt GFP-Tag, das eine einfache Überwachung des Proteins in verschiedenen biochemischen und biophysikalischen Untersuchungen ermöglicht. Die in dieser Handschrift (Huhn CFTR-haltige Plasmid oder gefrorene Hefe-Zellen) beschrieben Reagenz kann durch die Cystic Fibrosis Foundation (USA) bezogen werden.

Cystische Fibrose (CF) ist die häufigste genetische Erkrankung in Europa und Nordamerika mit einer Inzidenz von etwa 1 zu 2.500 Lebendgeburten. CF tritt bei Mutationen in der Mukoviszidose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulator (CFTR)-Protein zu einem Verlust der Funktion an der Plasmamembran von Epithelzellen 1. Die schwerwiegendste Folge dieses Mangels ist irreversible Lungenschäden, die die Lebenserwartung der Betroffenen bis &lt;40 Jahre 2,3 verkürzt. CFTR ist ein ATP-binding cassette (ABC)-Transporter, die sich entwickelt hat, um ein Ionenkanal 1,4 geworden. Trotz seiner ziemlich veränderte Funktion in der Plasmamembran von Zellen, ist es noch immer eine signifikante Sequenzhomologie mit anderen ABC-Transportern. Interessanter, die Sonderteile von CFTR (dh seine regulatorischen Region und ihre N-und C-Termini) teilen sich keine signifikante Sequenzähnlichkeit mit anderen Metazoen ABC-Transporter, daher gibt es keine Hinweise auf thE Ursprünge dieser Sequenzen in CFTR. Auf der Basis seiner Primärstruktur wird CFTR als C-Familienmitglied der ABC-Transporter-Familie eingestuft, aber es gibt keine starken Beweise für eine Rest funktionellen Verknüpfung zu dieser Unterfamilie. Es wurden für 5-7 CFTR einige Berichte von Glutathion Transportaktivität, das wäre im Einklang mit den Rollen der anderen C-Familienmitglieder 8,9, obwohl auch andere Berichte deuten darauf hin, dass reduzierte Glutathion kann das CFTR-ATPase-Aktivität zu hemmen, statt, die die Substrat-induzierte Stimulation, die der ABC-Transporter 10 charakterisieren. Messung der Ionenleitfähigkeit ist empfindlich genug, damit die Kanalaktivität einzelner CFTR-Moleküle zu unter 1 und CFTR-Kanals Eigenschaften wurden als Funktion der Zeit, der Temperatur, der ATP-Konzentration, Membranpotential und Phosphorylierung als auch in der überwacht Vorhandensein einer Vielzahl von niedermolekularen Inhibitoren, Potentiatoren und Modifikatoren. DieseStudien haben auch wesentlich zu unserem Wissen, wie ABC-Transporter funktionieren aufgenommen. Dennoch Expression von CFTR in signifikanten Mengen und ihre anschließende Reinigung hat sich als besonders anspruchsvoll und Erfolg auf einige wenige Labors 10-13 beschränkt zu sein. Die Notwendigkeit, wirksamere Medikamente zu entwickeln drängt, doch dieser Prozess durch den Mangel an CFTR gereinigt für das Screening kleiner Moleküle behindert. Die Lösung des CFTR-Expression und Reinigung Problem wäre Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening auf eine Korrektur des primären Defekt in CF ausgerichtet und ermöglichen würden zudem eine Route für hochauflösende Strukturuntersuchungen zu Rational Drug Design zu informieren. Selbst relativ grundlegenden biochemischen Eigenschaften des Proteins, wie seine funktionellen oligomeren Zustand, interagierende Proteine ​​und ATPase-Aktivität bleiben schlecht charakterisiert. Wir haben zuvor ein Protokoll für die großtechnische Expression von GFP-und His-markierten murinen CFTR berichtetin S. cerevisiae 14 und nun beschriebenen Protokolle für die Reinigung von CFTR. Wir haben diese Methoden verwendet, um fünf Orthologe von CFTR und Darstellung von Daten für die Reinigung von Hühner CFTR als Beispiel zu reinigen. Die Auswahl von Detergentien zur Solubilisierung und Reinigung ist ein kritischer Schritt bei der Reinigung von jeder Membranprotein. Nachdem die Löslichkeit von CFTR in mehreren Detergenzien gescreent, haben wir zwei kontras Detergenzien zur Verwendung in der Reinigung ausgewählt. Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) ein nicht-ionisches Detergens wurde ausgiebig sowohl für strukturelle und funktionelle Studien von Membranproteinen 15-21 verwendet. Das ionische Detergens 1-Tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerin) (LPG-14) ist bei der Solubilisierung von CFTR hocheffiziente und vorher bei der Reinigung von funktionellen Membranproteine ​​10 verwendet wurde, 22,23, einschließlich Reinigung des CFTR von S. 24 cerevisiae. &lt;/ P&gt;

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; m Spritzenvorsatzfilter&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>FC121</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO Zentrifugalkonzentrator (PES-Membran)</td><td>Vivaspin</td><td>VS0641</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Mikrofuge-Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>72.695</td><td></td></tr><tr><td>40Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td><a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901">337901</a></td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterile Falcon-Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Adenosintriphosphat-Dinatriumsalz (Na2ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigkeitschromatographie-System</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td></td></tr><tr><td>Aminoethylbenzolsulfonylfluorid (AEBSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8456</td><td></td></tr><tr><td>Glasperlenschlagender Zelldisruptor</td><td>BioSpec</td><td>1107900</td><td></td></tr><tr><td>Tisch-Zentrifuge&nbsp;</td><td>HERMLE</td><td>Z300</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Tisch-Mikrofuge&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-100-511</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidinhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>434760</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobe Kügelchen SM-2 Adsorptionsmittel</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>357000</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Bildgebungssystem</td><td>BioRad</td><td>170-808</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Chymostatin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Gesamtlipidextrakt</td><td>Avanti-Lipide</td><td>100500</td><td></td></tr><tr><td>Epoxysuccinyl-leucylamido-butan (E-64)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Glasperlen, Säure gewaschene</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>65017</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP Säulen (5 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-05</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Coomassie Stain</td><td>Novexin</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge JA-17 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369691</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Merck</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>Lyso-phosphatidylglycerol-14 (LPG)</td><td>Avanti lipide</td><td>858120</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Geltank SDS-PAGE System</td><td>BioRad</td><td>165-8006</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-Maltopyranosid (DDM)</td><td>Affymetrix</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>Vorgefärbte Proteinstandards</td><td>Fermentas</td><td>SM1811</td><td></td></tr><tr><td>Entsalzungssäulen (Sephadex G-25)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4265</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>SCH28080</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4443</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>Natriumthiocyanat (NaSCN)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251410</td><td></td></tr><tr><td>Gelfiltration 10/300 GL Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>Star Labs</td><td>N2400-0001</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschall-Wasserbad</td><td>Ultrawave</td><td>F0002202</td><td></td></tr><tr><td>Multimode-Plattenleser</td><td>BioTek</td><td>BTH1MF</td><td></td></tr></tbody></table>

die reinigung des cystic fibrosis transmembran regulator-protein in ausgedrückt<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defekte in der Mukoviszidose-Transmembran Regulator (CFTR)-Protein führen zystischer Fibrose (CF), eine autosomal-rezessive Erkrankung, die derzeit begrenzt die durchschnittliche Lebenserwartung der Erkrankten bis &lt;40 Jahre alt. Die Entwicklung neuer Wirkstoffmoleküle, die Aktivität von CFTR wiederherzustellen, ist ein wichtiges Ziel in der Behandlung CF, und die Isolation von funktionell aktiven CFTR ist ein sinnvoller Schritt zur Erreichung dieses Ziels. Wir beschreiben zwei Verfahren zur Reinigung von CFTR aus einer eukaryotischen heterologen Expressionssystem, S. cerevisiae. Wie prokaryotischen Systemen, S. cerevisiae kann schnell im Labor mit geringen Kosten angebaut werden, kann aber auch Verkehrs-und posttranslational große Membranproteine ​​modifizieren. Die Auswahl von Detergentien zur Solubilisierung und Reinigung ist ein kritischer Schritt bei der Reinigung von jeder Membranprotein. Nachdem die Löslichkeit von CFTR in mehreren Detergenzien gescreent, haben wir zwei Co ausgewähltntrasting Detergenzien zur Verwendung bei der Reinigung, die die endgültige CFTR Vorbereitung auf die später geplanten Experimenten zugeschnitten werden können. Bei diesem Verfahren stellen wir Vergleich der Reinigung von CFTR in Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) und 1-Tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerin) (LPG-14). Protein in DDM mit dieser Methode gereinigt zeigt ATPase-Aktivität in funktionellen Tests. Protein in LPG-14 gereinigt zeigt hoher Reinheit und Ausbeute, kann verwendet werden, um post-translationale Modifikationen zu untersuchen, und für strukturelle Methoden wie Kleinwinkelröntgenstreuung und Elektronenmikroskopie eingesetzt werden. Aber es zeigt deutlich niedriger ATPase-Aktivität.

Das oben beschriebene Protokoll ist ein effizientes Mittel, um CFTR angereicherte Mikros fast vollständige Wiederherstellung der CFTR während des Zellbruch und Herstellung der Roh-Mikrosomen (Fig. 1) zu isolieren. Andere Zellbruchverfahren können auch effektiv verwendet werden. Wir haben eine Druckzelle Französisch und andere high-pressure/cavitation Geräte (auch in Kombination mit Auftreffen auf einem Rubin Ziel) mit gleicher Effizienz eingesetzt. Für Komfort und niedrigen Anschaffungskosten der Geräte, finden wir die Wulst-Verfahren die besten Schläge. Mit LPG um sie zu lösen und zu reinigen CFTR ergab 80 ug Protein / L Kultur bei&gt; 90% Reinheit (Abbildung 2). Die hohe Ausbeute war durch effiziente Solubilisierung von CFTR von LPG (vgl. Abb. 2b, Spuren 2 und 4). Außerdem effizient und feste Bindung an die Säule führte zu einem minimalen Verlust von CFTR in der ungebundenen Fraktion und der Abwesenheit von CFTR in den Waschfraktionen (Fig. 2, Bahnen 3, 5, und6). Das eluierte Protein besaß eine Reinheit von&gt; 90%, durch Coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gelen abgeschätzt und mit Densitometrie des CFTR-und Schadstoff Bands. Gelpermeationschromatographie (GPC) getrennt LPG-CFTR gereinigt von Verunreinigungen Gewicht niedermolekularen (Abbildung 4, unteres Bild). Das Protokoll für die Reinigung unter Verwendung von CFTR DDM gibt Reinheit von etwa 60% und die Ausbeute von etwa 50 ug / l (Fig. 3). Elektronenmikroskopie (EM) von negativ gefärbten Fraktionen, die von der GPC-Elution bei 10 ml (Fig. 4) zeigte, dass DDM-gereinigt CFTR enthält Aggregate von 20-30 nm Durchmesser und kleinere Teilchen von 10 nm Durchmesser (Daten nicht gezeigt). Es ist möglich, dass die kleinen Aggregate reversibel zu verknüpfen und distanzieren wie Ultrafiltration mit einer 1 MDa cut-off Filter war nicht in der EM-nachweisbar Aggregate zu entfernen. LPG-gereinigte Material nicht zu einer Schein-Netz entladen adsorbieren, daher wurde durch Kryo-EM der ungefärbten Fraktionen untersucht. Dies zeigte,eine sehr homogene Kornpopulation einer relativ geringen Größe (6-8 nm Durchmesser, Daten nicht gezeigt). Schließlich wurde die ATPase-Aktivität der gereinigten Proteine ​​(Abbildung 5) gemessen. Als Mitglied der ABC-Protein-Familie, hat CFTR zwei Nukleotid-Bindungsdomänen (NBDs), die zur Bindung und / oder Hydrolyse von ATP. Die Daten zeigen, daß das gereinigte Protein war nicht in der Lage, ATP in der LPG-solubilisierten Zustand hydrolysieren und zeigte schwache ATPase-Aktivität in Gegenwart von DDM (Abbildung 5, ungefüllte Balken). Nach der Zugabe von Lipiden und Entfernen des Detergens wurde die ATPase-Aktivität 4-fach höher für Proben, die in DDM (13 nmol ATP / min / mg Protein) gereinigt worden war. Die Zugabe von Lipiden und Entfernen von LPG ähnlich wiederhergestellt Aktivität CFTR isoliert worden waren, die mit LPG, jedoch mit einer abschließenden Untersatz (1,5 nmol ATP / min / mg Protein) als die DDM-gereinigt und wiederhergestellten Materials. <img alt="Figur 1"fo: content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1.jpg&quot; /&gt; 1. Überwachungsebenen Huhn CFTR im Zelllysat (CL), die Überstände (S) und Pellets (P) während der verschiedenen Schritte der Zentrifugation für Mikros Isolierung und Waschen verwendet. SDS-PAGE Gele wurden unter Verwendung des in-Gel-Fluoreszenz des GFP visualisiert -Tag. Der Überstand nach dem Aufbrechen der Zellen und Zentrifugation bei 14000 × g enthält praktisch alle CFTR (einschließlich Abbauprodukte). Ultrazentrifugation bei 200.000 xg Sedimente alle in voller Länge CFTR verlassen einige Fragmente im Überstand. Ultrazentrifugation bei 100.000 × g salz gewaschen Mikros Pellets fast alle CFTR mit dem Entfernen einiger weiterer Fragmente. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2.jpg" /> 2. Reinigung von Hühner CFTR in LPG durch immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Färbung (oberes Feld) und Fluoreszenz-Detektion des GFP-Tag (untere Tafel) untersucht. Tracks: (1) Mikrosomen. (2) LPG-Mikrosomen gelöst. (3) Nicht konsolidiert Material. (4) Das unlösliche Material. (5) und (6) 40 bis 100 mM Imidazol-Waschanlagen. (7) Material eluiert mit 400 mM Imidazol. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3.jpg" /> 3. Reinigung von Hühner CFTR in DDM durch immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Färbung analysiert. Die Linke Tafel zeigt Fraktionen vor der Elution. Mehrere aufeinanderfolgende Elution Fraktionen werden in der rechten Panel mit CFTR in gezeigtdurch den Pfeil dicated. Später Fraktionen werden in einem 40 kDa Verunreinigung, die durch Massenspektrometrie als ribosomale Protein L3 identifiziert wurde bereichert. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4.jpg" /> 4. Reinigung von Hühner CFTR durch Gelpermeationschromatographie. CFTR durch Ni-Affinitätschromatographie gereinigt wurde, eingeengt und auf einem GPC-Säule aufgetragen. Das Elutionsprofil für CFTR (oben) in Puffer gereinigt enthalten LPG-14 (durchgezogene Linie) oder DDM (gestrichelte Linie) überlagert werden. SDS-PAGE (unten) ergab, dass CFTR zwischen 8 und 11 ml eluiert. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5.jpg" /> Abbildung 5. ATPase activity gereinigtes Hühner CFTR Fraktionen. Protein in DDM oder LPG gereinigt wurde unter Verwendung einer modifizierten Chifflet Assay 26 in Gegenwart eines Cocktails von ATPase-Inhibitoren, jede Hintergrund-ATPase-Aktivität von F-, P-und V-Typ-ATPasen (ungefüllte Balken zu entfernen getestet ). Die Rate der ATP-Hydrolyse wurde auch nach Entfernung des Detergens und Lipid-Zugabe (gefüllte Balken) gemessen. Das Diagramm zeigt den Mittelwert und Standardabweichung (n = 3). Unterschiede zwischen den Mittelwerten für die ATPase-Aktivität in Gegenwart und Abwesenheit von Lipid und Differenz-Aktivität in DDM und LPG signifikant für p &lt;0,05.

Die heterologe Expression und Reinigung des Mukoviszidose Transmembran Regulator (CFTR) sind bedeutende Herausforderungen und limitierende Faktoren bei der Entwicklung von Arzneimitteltherapien für Mukoviszidose. Dieses Protokoll beschreibt zwei Verfahren zur Isolierung von Milligramm-Mengen von CFTR für funktionelle und strukturelle Untersuchungen.

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, große Mengen des funktionsfähigen cystischen Fibrose-Transmembranleitungsregulators, also des CFTR-Proteins, zu isolieren. Dies wird zunächst durch die heterologe Überexpression des Hühner-CFTR-Proteins in Charmy visi erreicht. Der zweite Schritt besteht darin, die Hefe-Zellen zu lysieren und die angereicherte mikrosomale Fraktion zu isolieren.Anschließend wird CFTR solubilisiert und gereinigt. Der letzte Schritt besteht darin, die Hydrolyserate von ATP durch das gereinigte Protein zu messen, um zu beurteilen, ob es funktionsfähig bleibt. Letztendlich ermöglicht die Überexpression in s visi die Produktion hochreiner, funktionskompetenter CFTR-Proteine in Milligramm-Mengen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Expression in Säugetierzelllinien, liegt darin, dass Hefen im Labor einfach, schnell und kostengünstig kultiviert werden können. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen im Bereich der Mukoviszidose zu beantworten, da das gereinigte Protein genutzt werden kann, um Wechselwirkungen zwischen in der Entwicklung befindlichen Wirkstoffen und dem CFTR-Protein zu untersuchen oder sogar nach neuen Wirkstoffen zu suchen. Die Methode ermöglicht Einblicke in die CFTR-Reinigung und kann zudem auf andere Membranproteine angewandt werden, die schwer zu exprimieren und zu reinigen sind.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da CFTR in Hefe rasch durch proteolytische Enzyme abgebaut wird und in Lösung dazu neigt, Aggregate zu bilden. In diesem Protokoll wird Hühner-CFTR aus zuvor eingefrorenen S-SEI-Zellen gereinigt. Die Verfahren zum Kultivieren und Gewinnen von CFTR-exprimierenden S-SEI-Zellen werden in einem früheren JoVE-Artikel veranschaulicht.Microsomen werden aus den Hefe-Zellen wie in der begleitenden Ver&ouml;ffentlichung beschrieben isoliert und anschlie&szlig;end in einem Mindestvolumen von f&uuml;nf bis 15 Milliliter CFTR-Puffer resuspendiert. Mithilfe eines Bradford-Assays kann die Gesamtmenge an mikrosomalen Proteinen bestimmt werden, die zwischen 70 und 200 Milligramm liegen sollte; au&szlig;erdem sollte das Fluoreszenzemissionsspektrum der Membranen einen charakteristischen GFP-Fluoreszenzpeak aufweisen. F&uuml;r die Solubilisierung und Reinigung von C-F-T-R-D-D-M-A werden zwei kontrastierende Detergenzien verwendet: ein nichtionisches Detergens (LPG 14) und ein ionisches Detergens.Bereiten Sie die geeigneten Puffer im Voraus gemäß dem Protokoll in der Ver&ouml;ffentlichung zur Solubilisierung von Membranen vor. Verd&uuml;nnen Sie die Mikrosomen mit einem gleichen Volumen des entsprechenden Solubilisierungspuffers, um eine endg&uuml;ltige Detergenskonzentration von 2&nbsp;% und eine mikrosomale Proteinkonzentration von f&uuml;nf Milligramm pro Milliliter zu erhalten. Inkubieren Sie dieses Gemisch eine Stunde lang bei vier Grad Celsius unter R&uuml;hren.Nach einer Stunde die Mischung bei 100.000 ×g und vier Grad Celsius 45 Minuten lang zentrifugieren. Den Überstand, der die solubilisierten Membranproteine enthält, abnehmen und aufbewahren.Suspendieren Sie den unlöslichen Anteil in 1 % SDS-Lösung auf ein Volumen, das dem des löslichen Anteils entspricht. Messen Sie die Fluoreszenz in diesem Anteil und heben Sie ein Eloqua von 50 Mikrolitern für die SDS-Page-Analyse auf. Um mit der Nickel-Affinitätsreinigung von CFTR zu beginnen, verbinden Sie fünf Milliliter Nickel-Spheros-Säulen in Serie, spülen Sie mit zwei Säulenvolumina (CV) 20 % Ethanol, gefolgt von zwei CV destilliertem, deionisiertem Wasser. Danach spülen Sie mit zwei CV Puffer zur Solubilisierung, der ein Molares MiaSole enthält, gefolgt von zwei CV Puffer zur Solubilisierung ohne Midsole. Fügen Sie MiaSole zu einer Endkonzentration von fünf Millimolar zum solubilisierten Material hinzu und geben Sie das Material nach zwei Waschungen mit ole-freiem Puffer in eine Proben-Schleife einer automatisierten Flüssigkeits-Chromatographie-Anlage. Um ungebundenes Material zu entfernen, waschen Sie die Säule mit drei Kolonnenvolumina Reinigungspuffer mit 40 Millimolar ole bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute. Sammeln Sie diese Fraktion in einem 50-Milliliter-Röhrchen.Für die zweite Waschung verwenden Sie drei CV Puffer zur Reinigung mit 100 Millimolar Ole. Sammeln Sie Fraktionen zu je zwei Milliliter in einer 96-Loch-Platte. Eluieren Sie CFTR aus der His-Säule mit drei CV Puffer zur Reinigung mit 400 Millimolar Ole. Sammeln Sie Fraktionen zu je zwei Milliliter in einer 96-Loch-Platte, überwachen Sie die Fluoreszenz in den eluierten Fraktionen und bewahren Sie Aliquots der Peakfraktionen auf.Für die SDS-Page-Analyse werden die verbleibenden Peakfraktionsproben für den nächsten Reinigungsschritt verwendet. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Säule mit 1,2 CV destilliertem, deionisiertem Wasser äquilibrieren, gefolgt von 1,2 CV Gel-Permeations-Chromatographie- oder GPC-Puffer, während die Säule äquilibriert wird. Konzentrieren Sie die Nickel-Affinitäts-reinigten Fraktionen mit der höchsten GFP-Fluoreszenz mithilfe eines zentrifugalen Filters mit einer Molekulargewichtsabscheidung von 100.000 kDa bei vier Grad Celsius.Wenn die Reinigung in DDM erfolgt, vermeiden Sie es, die Probe über eine Proteinkonzentration von 0,3 Milligramm pro Milliliter anzukonzentrieren, da dies zu einem erheblichen Verlust der Probe führt. Überführen Sie das RENATE aus den Konzentrationsvorrichtungen in Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 30 Minuten bei 100.000 × g und vier Grad Celsius, um große Partikel zu pelletieren. Geben Sie diese Probe auf die äquilibrierte Säule und eluieren Sie mit einem isokratischen Gradienten von 1,2 CV GPC-Puffer.Sammeln Sie Fraktionen zu je 0,5 Milliliter. Messen Sie die GFP-Fluoreszenz, um die Fraktionen zu identifizieren, die CFTR enthalten. Bewahren Sie ein kleines Volumen jeder Fraktion zur Analyse mittels SDS-Page auf, um CFTR zu rekonstituieren.Fügen Sie Lipide dem gereinigten CFTR hinzu. Verwenden Sie ein Verhältnis von Lipid zu Protein von 100 zu 1. Richten Sie ebenso eine Kontrolle mit nur Lipiden ein.Ersetzen Sie das gereinigte Protein durch das gleiche Volumen GPC-Puffer. Inkubieren Sie beide Proben eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie anschließend das Detergens aus der Protein-Lipid-Mischung mithilfe hydrophober absorbierender Kügelchen.Verwenden Sie 200 Milligramm vorgewaschener Adsorptionsperlen pro Milliliter gereinigtes Protein und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius mit sanfter Agitation. Am folgenden Tag sammeln Sie die Rekonstitutionsprobe von den Adsorptionsperlen mit einer dünnenden Pipettenspitze in einem frischen Reaktionsgefäß. Die CFTR-spezifische APAs-Aktivität des rekonstituierten CFTR wird mithilfe eines modifizierten Chile-Assays im 96-Well-Plattenformat gemessen; als Standards dienen null bis 20 Nanomol Natriumphosphat, verdünnt in einer 1:1-Mischung aus CFTR-Puffer und APAs-Puffer. Inkubieren Sie sowohl das rekonstituierte CFTR als auch leere Liposomen mit einem bis 100 APAs-Hemmstoffen auf Eis für 10 Minuten.Verwenden Sie mindestens fünf Mikrogramm rekonstituiertes CFTR. Überführen Sie die Proben in die 96-Loch-Platte und geben Sie ein TP so hinzu, dass eine Endkonzentration von zwei Millimolar erreicht wird. Inkubieren Sie eine Stunde bei 25 Grad Celsius. Beenden Sie die Reaktion nach einer Stunde durch Zugabe von 40 Mikrolitern 10 % SDS zu jedem Loch.Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter Puffer A in jede Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang. Danach geben Sie 100 Mikroliter Puffer B in jede Vertiefung und messen die Extinktion bei einer Wellenlänge von 800 Nanometern in einem mit einer 96-Loch-Platte kompatiblen UV-Vis-Spektrophotometer. Übertragen Sie die Extinktionsdaten in eine neue Tabelle.Wandeln Sie die Absorption bei 800 Nanometern unter Verwendung der Phosphatstandards in eine Menge freigesetzten Phosphats um, und berechnen Sie die Rate der TP-Hydrolyse anhand der dargestellten Schritte. Das in diesem Video demonstrierte Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Isolierung von CFTR-angereicherten Mikrosomen dar, bei der nahezu vollständige Rückgewinnung von CFTR während des Zellaufbruchs und der Herstellung der rohen Mikrosomen erzielt wird. Dieses Bild eines SDS-PAGE-Gels zeigt die Konzentrationen von Hühner-CFTR, die mittels Ingel-Fluoreszenz eines GFP-Tags während verschiedener Zentrifugationsschritte überwacht wurden, die für die Isolierung und das Waschen der Mikrosomen verwendet wurden.CL steht für Zelllysate, S steht für Überstände und P steht für Pellets. Der Überstand nach Zellzerstörung und Zentrifugation bei 14.000 × g enthält praktisch den gesamten CFTR einschließlich Abbauprodukten. Eine Ultrazentrifugation bei 200.000 × g sedimentiert den gesamten vollständigen CFTR, wobei einige Fragmente im Überstand verbleiben, sowie eine Ultrazentrifugation bei 100.000 × g von salzgewaschenen mikrosomalen Pellets.Nahezu der gesamte CFTR nach zusätzlichem Entfernen einiger Fragmente, Aufreinigung von Hühner-CFTR in LPG 14 mittels Immobilized-Metal-Ion-Affinitätschromatographie ergab 80 Mikrogramm Protein pro Liter Kultur mit einer Reinheit von über 90 %. Das obere Panel zeigt die durch SDS-Page analysierten Fraktionen, gefolgt von Kumasi-Färbung. Das untere Panel zeigt dieselben Fraktionen, detektiert durch die Fluoreszenz des GFP-Tags.Die hohe Ausbeute war auf eine effiziente Solubilisierung von CFTR durch LPG 14 zurückzuführen, wie der Vergleich zwischen der mit LPG solubilisierten Mikrosomen beladenen Spur zwei und der mit unlöslichem Material beladenen Spur vier zeigt. Zusätzlich führte eine effiziente und feste Bindung an die Säule zu einem minimalen Verlust von CFTR in der nicht gebundenen Fraktion, dargestellt in Spur drei, sowie zum Fehlen von CFTR in den Waschfraktionen, die durch die Spuren fünf und sechs repräsentiert werden. Das eluierte Protein wies eine Reinheit von über 90 % auf, geschätzt anhand von kumasi-gefärbten SDS-PAGE-Gelen und durch Dichtemessung der CFTR- und Kontaminantenbänder.Reinigung von Hühner-CFTR. Mittels Immobilisierter Metallionen-Affinitätschromatographie in DDM wurden etwa 50 Mikrogramm Protein pro Liter Kultur mit einer Reinheit von etwa 60 % erhalten. Diese Abbildung zeigt die durch SDS-PAGE analysierten Fraktionen, gefolgt von Kumasi-Färbung, wobei die Fraktionen vor der Elution links und mehrere aufeinanderfolgende Elutionsfraktionen rechts dargestellt sind.CFTR wird später durch den Pfeil angezeigt. Die Fraktionen sind angereichert mit einem 40 Kilodalton schweren Kontaminanten, der mittels Massenspektrometrie als ribosomales Protein L drei identifiziert wurde. Das aus Hühnern gewonnene CFTR, das entweder in LPG 14 oder DDM mittels immobilisierter Metallionen-Affinitätschromatographie gereinigt wurde, wurde anschließend durch Gelpermeationschromatographie weitergereinigt.Das Elucian-Profil von CFTR, das in einem Puffer mit LPG 14 gereinigt wurde, ist durch die durchgezogene Linie dargestellt. Während das Ian-Profil von CFTR, das in einem Puffer mit DDM gereinigt wurde, durch die gestrichelte Linie dargestellt ist, zeigte die SDS-Gelelektrophorese, dass das mit LPG gereinigte CFTR, das durch den Pfeil markiert ist, zwischen acht und elf Milliliter eluierte. Die Gelpermeationschromatographie trennte außerdem das mit LPG gereinigte CFTR von Kontaminanten mit niedrigem Molekulargewicht. Schließlich wurde die APA-Aktivität der gereinigten Proteine gemessen.Die Ergebnisse zeigen, dass das gereinigte Protein im LPG-solubilisierten Zustand nicht in der Lage war, ATP zu hydrolysieren, und eine schwache APAs-Aktivität in Gegenwart von DDM nach Zugabe von Lipiden und Entfernung des Detergens zeigte. Die APAs-Aktivität war vierfach höher bei Proben, die in DDM gereinigt worden waren: 13 mol ATP pro Minute und Milligramm Protein. Die Zugabe von Lipiden und die Entfernung von LPG stellten die Aktivität von CFTR, das zuvor mit LPG isoliert worden war, ähnlich wieder her, allerdings mit einer abschließend niedrigeren Rate im Vergleich zu dem mit DDM gereinigten und rekonstituierten Material: 1,5 mol ATP pro Minute und Milligramm Protein, sobald die Methode beherrscht war.Diese Technik kann in zwei Tagen abgeschlossen werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, stets daran zu denken, die Proben im Anschluss an das Verfahren ständig auf Eis zu lagern. Andere Methoden wie die thermische Stabilität, die Elektronenmikroskopie und die Röntgen-Kleinwinkelstreuung können verwendet werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Struktur und Stabilität des Proteins zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine klare Vorstellung davon haben, wie man große Mengen des CFTR-Proteins exprimiert und reinigt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Versuche, die zystische Fibrose Transmembran Regulator (CFTR) in...

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

Zystische Fibrose-Transmembran-Regulator (CFTR), eine epitheliale Chlorid-Kanal, wurde berichtet, dass mit verschiedenen Proteinen zu interagieren und zu regulieren wichtige zelluläre Prozesse, darunter die CFTR PDZ-Motiv-vermittelte Wechselwirkungen sind gut dokumentiert. Dieses Protokoll beschreibt Methoden, die wir entwickelt, um eine PDZ-abhängigen CFTR makromolekularen Signalkomplexes...

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Beschrieben wird hier ein schnelles und wirksames Verfahren für die funktionelle Rekonstitution von gereinigten Wildtyp- und mutierten CFTR-Proteins, die die Aktivität für dieses Chloridkanal, der bei zystischer Fibrose fehlerhaft ist bewahrt. Iodid-Efflux aus rekonstituierter Proteo von CFTR vermittelten ermöglicht Untersuchungen der Kanalaktivität und die Auswirkungen von kleinen Molekülen.

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

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