Bestimmung der spontanen lokomotorischen Aktivität in Drosophila melanogaster

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die spontane Bewegungsaktivität von Fruchtfliegen zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst experimentelle Fliegen gesammelt und gealtert werden. Der zweite Schritt besteht darin, Populationsmonitore in einem temperaturgesteuerten Inkubator einzurichten und die entsprechende Software herunterzuladen.

Als nächstes werden die Fliegen in Glasdateien übertragen und dann in Populationsmonitoren platziert, wo die Aktivitätsmonitore ausgeführt werden. Der letzte Schritt besteht darin, die Daten zu analysieren. Letztendlich werden Populationsmonitore verwendet, um Unterschiede in der spontanen körperlichen Aktivität von Fliegen aufzuzeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. der negativen Geo-Achse, besteht darin, dass sie eine einfache, zuverlässige und objektive kontinuierliche Aufzeichnung der spontanen körperlichen Aktivität mehrerer Fliegenpopulationen ermöglicht. Diese Methode kann uns helfen zu bestimmen, wie sich verschiedene Manipulationen auf Fliegen auswirken. Spontane körperliche Aktivität, die das Verfahren demonstriert, wird Suzanne Kowski, eine Laborassistentin aus einem Labor, beginnen, das Essen gemäß den im begleitenden Textprotokoll aufgeführten Schritten zuzubereiten und unter ständigem Mischen auf einer heißen Platte abkühlen zu lassen.

Aliquotieren Sie fünf Milliliter Lebensmittel in jedes schmale Glasfläschchen und stellen Sie sicher, dass die Lebensmittelmenge unter dem untersten Ring der Bevölkerung liegt. Überwachen Sie, nachdem die Lebensmittel auf Raumtemperatur abgekühlt sind. Decken Sie die Fläschchen mit Schwammstopfen ab und halten Sie sie bis zu zwei Wochen lang bei vier Grad Celsius.

Erwärmen Sie die Fläschchen vor Gebrauch auf Raumtemperatur. Als nächstes züchten Sie Canton S-Fliegen in Plastikfläschchen mit Standard-Laborfutter. Bewahren Sie die Fläschchen in einer befeuchteten, temperaturgesteuerten Kammer bei 25 Grad Celsius in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus auf.

Adulte Fliegen morgens aus den Fläschchen entfernen. Trennen Sie dann neu eingeschlossene Fliegen innerhalb von acht Stunden nach dem Welo auf einem Kohlendioxid-Pad nach Geschlecht, um sicherzustellen, dass die weiblichen Fliegen Jungfrauen sind. Bereiten Sie 10 Fläschchen mit Elternfliegen vor, indem Sie fünf bis 10 Tage alte, jungfräuliche männliche und weibliche Fliegen platzieren.

Fliegen in einem Standard-Futterfläschchen mit mehreren Hefekörnern. Halten Sie die Fliegen in einem Inkubator bei 25 Grad Celsius mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus für zwei Tage. Geben Sie die Fliegen alle zwei Tage in ein neues Plastikfläschchen und bewahren Sie die Fläschchen mit den daraus resultierenden Eiern in einem Inkubator bei 25 Grad Celsius auf.

Räumen und entsorgen Sie dann die Fliegen, die er am ersten Tag verschlossen hat, und geben Sie die Fläschchen zurück in den Brutkasten, um am zweiten Tag eine synchronisiertere Fliegenpopulation zu sammeln. Als nächstes sammeln Sie auf einem Kohlendioxid-Pad innerhalb von 24 Stunden mit einem Metalllöffel schnell 25 männliche und 25 weibliche Fliegen pro Fläschchen. Notieren Sie den Tag von ELO auf dem Fläschchen.

Setze jeweils mindestens fünf Replizierungsfläschchen zusammen. Für Versuchs- und Kontrollgruppen. Bewahren Sie die Fläschchen in temperaturkontrollierten Klimakammern bei 25 Grad Celsius mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus auf.

Geben Sie die Fliegen 10 Tage lang jeden zweiten Tag in ein neues Plastikfläschchen. Platzieren Sie die Populationsmonitore mit einem Trichter in einem temperaturgesteuerten Inkubator. Verbinden Sie als Nächstes jeden Monitor mit einem vieradrigen Telefonkabel über einen Fünf-Wege-Splitter mit der Netzteil-Schnittstelleneinheit (PSIU).

Verbinden Sie dann das Telefonkabel mit der PSIU. Schließen Sie die PSIU an eine Steckdose mit 100 bis 240 Volt an und stecken Sie den Ausgangsstecker des Netzteils in einen der PSIU-Gegenstecker. Laden Sie dann die USB-Software herunter, die von der PSIU verwendet wird, um eine Datenverbindung zwischen dem Computerprogramm und der PSIU und den Aktivitätsmonitoren herzustellen.

Starten Sie das Programm. Dann unter Einstellungen. Wählen Sie die serielle Schnittstelle PSIU für Macintosh.

Wählen Sie dann das Leseintervall aus. Wählen Sie als Nächstes die Monitore anhand ihrer eindeutigen Herstellernummer aus. Wählen Sie den Monitorbereich aus, der den Nummern entspricht, die den Monitoren zugewiesen wurden.

Stellen Sie sicher, dass alle Monitore richtig angeschlossen sind, indem Sie nach dem grünen Licht Ausschau halten. Ein rotes Licht zeigt an, dass die Verbindung unterbrochen wurde. Ein schwarzes Feld zeigt an, dass das System ausgeschaltet ist oder dass die USB-Verbindung nicht ordnungsgemäß hergestellt wurde.

Trennen Sie männliche und weibliche Fliegen gleichen Alters. Auf einem Kohlendioxid-Pad 10 männliche und 10 weibliche Fliegen bei getrennter Raumtemperatur platzieren. Glas vi.

Verwenden Sie mindestens drei Fläschchen für jede Versuchs- und Kontrolllinie, und lassen Sie die Fläschchen für jedes Fliegengeschlecht auf der Seite, bis sich die Fliegen von Kohlendioxid erholt haben, um sicherzustellen, dass sie nicht im Futter stecken bleiben. Lassen Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, um sich vom Kohlenoxid zu erholen. Platzieren Sie dann die Fläschchen in der Population.

Monitore sind in den Inkubatoren untergebracht. Geben Sie die Fliegen nach drei oder vier Tagen in neue Fläschchen um, um ein Austrocknen der Lebensmittel zu vermeiden. Scannen Sie am Ende des Experiments die Daten, um doppelte Messwerte zu eliminieren und sicherzustellen, dass die Aufzeichnungen vollständig sind.

Wählen Sie mit dem Dateiscan 110 x das Intervall für die Datenerfassung aus und verwerfen Sie die Daten, die innerhalb der ersten 24 Stunden im ausgewählten Zeitraum gesammelt wurden. Das Programm sendet die aktuelle Gesamtzählung für jeden Monitor an den Computer und beginnt erneut bei Null zu zählen. Wählen Sie als Nächstes einen experimentellen Namen aus, und kopieren Sie die Dateien aus dem Datenordner des Computers, um die Daten zu speichern.

Beginnen Sie mit der Datenanalyse, indem Sie die in den Textdateien gesammelten Daten sorgfältig in Spalten von Excel-Tabellen kopieren. Berechnen Sie dann für jeden Monitor die Gesamtaktivität innerhalb eines gewünschten Zeitraums, die die Summe der Aktivität darstellt, die bei drei verschiedenen Höhen von Infrarotstrahlen erfasst wurde. Bestimmen Sie schließlich die durchschnittliche lokomotorische Aktivität und die Standardabweichung zwischen den drei Monitoren, die drei biologische Replikate repräsentieren, mit dem zweiseitigen Studenten-T-Test.

Die spontane Bewegungsaktivität bei Drosophila hängt vom Geschlecht der Fliege und vom hellen Dunkelzyklus ab. Wie diese Grafik der durchschnittlichen Aktivität von männlichen und weiblichen Fliegen zeigt, markiert der Pfeil den Übergang von hell zu dunkel. Wenn eine Abnahme der Aktivität beobachtet wird, nimmt die Gesamtaktivität von 20 Tage alten männlichen Fliegen zu, wenn die Fliegen bei einer kalorienarmen Diät die Hälfte der Menge an Standardfutter erhalten, verglichen mit der verminderten Aktivität von Fliegen bei einer kalorienreichen Diät.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die spontane körperliche Aktivität von Drosophila bestimmen können. Diese Methode ist hilfreich, um festzustellen, wie sich unterschiedliche Genetik oder Umweltmanipulationen auf die Aktivität von Fliegen auswirken.