Bestimmung der spontanen lokomotorischen Aktivität in
10. April 2014
Drosophila melanogaster sind nützlich bei der Untersuchung genetischer oder umwelt Manipulationen, die Verhaltensweisen wie spontane Bewegungsaktivität beeinflussen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das Monitore mit Infrarot-Strahlen und Datenanalyse-Software, um die spontane Bewegungsaktivität zu quantifizieren nutzt.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die spontane motorische Aktivität von Fruchtfliegen zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst experimentelle Fliegen gesammelt und altern gelassen werden. Der zweite Schritt besteht darin, Populationsmonitore in einem temperaturgeregelten Inkubator einzurichten und die entsprechende Software herunterzuladen.
Anschließend werden die Fliegen in Glasgefäße überführt und in Populationsmonitore gestellt, in denen die Aktivitätsmessungen durchgeführt werden. Der letzte Schritt besteht in der Analyse der Daten. Letztendlich dienen Populationsmonitore dazu, Unterschiede in der spontanen körperlichen Aktivität von Fliegen aufzuzeigen.
Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der negativen Geo-Achse besteht darin, dass sie eine einfache, zuverlässige und objektive kontinuierliche Erfassung der spontanen körperlichen Aktivität mehrerer Fliegenpopulationen ermöglicht. Diese Methode kann uns helfen zu bestimmen, wie unterschiedliche Manipulationen die Fliegen beeinflussen. Die spontane körperliche Aktivität, die die Durchführung des Verfahrens demonstriert, wird von Suzanne Kowski, einer Laborassistentin aus einem Labor, durchgeführt. Beginnen Sie damit, das Futter gemäß den im begleitenden Textprotokoll aufgeführten Schritten zuzubereiten, und lassen Sie es bei ständigem Rühren auf einer Heizplatte abkühlen.
Geben Sie jeweils fünf Milliliter Nahrung in enge Glasgefäße und achten Sie darauf, dass die Menge der Nahrung unterhalb des untersten Rings der Population liegt. Überwachen Sie die Proben, nachdem die Nahrung auf Raumtemperatur abgekühlt ist. Verschließen Sie die Gefäße mit Spongienstopfen und lagern Sie sie bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius.
Wärmen Sie die Röhrchen vor Gebrauch auf Raumtemperatur auf. Züchten Sie anschließend Canton-S-Fliegen in Plastikröhrchen mit standardisierter Labornahrung. Bewahren Sie die Röhrchen in einer befeuchteten, temperaturgeregelten Kammer bei 25 Grad Celsius im 12-Stunden-Licht-Dunkel-Wechsel an.
Entfernen Sie erwachsene Fliegen morgens aus den Röhrchen. Trennen Sie anschließend innerhalb von acht Stunden nach dem Schlupf neu geschlüpfte Fliegen nach Geschlecht auf einer Kohlendioxid-Matte, um sicherzustellen, dass die weiblichen Fliegen jungfräulich sind. Bereiten Sie 10 Röhrchen mit Eltern-Fliegen vor, indem Sie fünf bis zehn Tage alte jungfräuliche Männchen und Weibchen einsetzen.
Fliegen in einer Standardnahrungsröhre mit mehreren Hefekörnern. Halten Sie die Fliegen zwei Tage lang in einem Inkubator bei 25 Grad Celsius mit einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Wechsel. Überführen Sie die Fliegen jeden zweiten Tag in eine neue Kunststoffröhre und stellen Sie die Röhren mit den resultierenden Eiern in einen Inkubator bei 25 Grad Celsius.
Danach entfernen und entsorgen Sie die Fliegen, die am ersten Tag geschlüpft sind, und stellen Sie die Röhrchen zurück in den Inkubator, um am zweiten Tag eine stärker synchronisierte Population von Fliegen zu erhalten. Danach sammeln Sie auf einer Kohlendioxid-Matte innerhalb von 24 Stunden schnell jeweils 25 männliche und 25 weibliche Fliegen pro Röhrchen mit einem Metalllöffel. Notieren Sie den Tag des ELOs auf dem Röhrchen.
Stellen Sie für die experimentellen und Kontrollgruppen jeweils mindestens fünf Wiederholungsgefäße zusammen. Lagern Sie die Gefäße in temperaturgeregelten Umweltkammern bei 25 Grad Celsius mit einem 12-Stunden-Licht-Dunkel-Wechsel.
Überführen Sie die Fliegen alle zwei Tage in ein neues Plastikgefäß für insgesamt 10 Tage. Stellen Sie die Populationsmonitore mithilfe eines Trichters in einen temperaturgeregelten Inkubator. Schließen Sie anschließend jeden Monitor über ein Vier-Draht-Telefonkabel über einen Fünf-Wege-Verteiler an die Stromversorgungsschnittstelle oder PSIU an.
Verbinden Sie dann das Telefonkabel mit der PSIU. Schließen Sie die PSIU an eine Stromversorgung von 100 bis 240 Volt an, und stecken Sie den Ausgangsstecker des Netzteils in eine der passenden Buchsen der PSIU. Laden Sie anschließend die USB-Software herunter, die von der PSIU verwendet wird, um eine Datenverbindung zwischen dem Computerprogramm und der PSIU sowie den Aktivitätsmonitoren herzustellen.
Starten Sie das Programm. Wählen Sie dann unter Einstellungen den seriellen Anschluss PSIU für Macintosh.
Danach wählen Sie das Leseintervall aus. Anschließend wählen Sie die Messgeräte anhand ihrer eindeutigen Herstellernummer aus. Wählen Sie den Messbereich aus, der den den Messgeräten zugewiesenen Nummern entspricht.
Stellen Sie sicher, dass alle Monitore ordnungsgemäß angeschlossen sind, indem Sie nach dem grünen Licht suchen. Ein rotes Licht zeigt an, dass die Verbindung unterbrochen ist. Eine schwarze Box zeigt an, dass das System ausgeschaltet ist oder dass die USB-Verbindung nicht korrekt hergestellt wurde.
Trennen Sie männliche und weibliche Fliegen desselben Alters. Legen Sie jeweils 10 männliche und 10 weibliche Fliegen auf eine Kohlendioxid-Matte in getrennte Glasgefäße bei Raumtemperatur.
Verwenden Sie für jede experimentelle und kontrollierte Linie sowie für jedes Geschlecht der Fliegen mindestens drei Gefäße und stellen Sie die Gefäße so lange auf die Seite, bis sich die Fliegen von dem Kohlendioxid erholt haben, um sicherzustellen, dass sie nicht im Nährmedium stecken bleiben. Lassen Sie sie zwei Stunden bei Raumtemperatur zur Erholung von dem Kohlenmonoxid. Danach stellen Sie die Gefäße in die Population.
In den Inkubatoren untergebrachte Monitore. Überführen Sie die Fliegen nach drei oder vier Tagen in neue Röhrchen, um zu verhindern, dass das Futter austrocknet. Scannen Sie am Ende des Experiments die Daten, um doppelte Messungen zu entfernen, und stellen Sie sicher, dass die Aufzeichnungen vollständig sind.
Wählen Sie mit dem Dateiscan 110 x das Intervall für die Datensammlung aus und verwerfen Sie die innerhalb der ersten 24 Stunden im ausgewählten Zeitraum gesammelten Daten. Das Programm sendet die aktuelle Gesamtanzahl für jeden Monitor an den Computer und beginnt erneut mit dem Zählen ab null. Wählen Sie anschließend einen Verschulsnamen und kopieren Sie die Dateien aus dem Datenordner des Computers, um die Daten zu speichern.
Beginnen Sie die Datenanalyse, indem Sie die in den Textdateien gesammelten Daten sorgfältig in Spalten von Excel-Arbeitsblättern übertragen. Berechnen Sie anschließend die Gesamtaktivität über einen gewünschten Zeitraum für jeden Monitor, die die Summe der Aktivität an drei verschiedenen Höhen der Infrarotstrahlen darstellt. Bestimmen Sie abschließend die durchschnittliche Lokomotoraktivität und die Standardabweichung zwischen den drei Monitoren, die drei biologische Wiederholungen repräsentieren, mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests.
Die spontane motorische Aktivität bei Drosophila hängt vom Geschlecht der Fliege und vom Hell-Dunkel-Wechsel ab. Wie anhand dieses Diagramms der durchschnittlichen Aktivität männlicher und weiblicher Fliegen gezeigt wird, markiert der Pfeil den Übergang von Hell zu Dunkel. Während eine Abnahme der Aktivität beobachtet wird, nimmt die Gesamtaktivität 20 Tage alter männlicher Fliegen zu, wenn diesen die Hälfte der Standardnahrung in einer kalorienarmen Diät verabreicht wird, verglichen mit der verringerten Aktivität von Fliegen, die eine kalorienreiche Diät erhalten.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die spontane körperliche Aktivität von Drosophila bestimmt. Diese Methode ist hilfreich, um zu untersuchen, wie unterschiedliche genetische Faktoren oder Umweltmanipulationen die Aktivität der Fliegen beeinflussen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Quantifizierung der spontanen motorischen Aktivität bei Drosophila melanogaster. Mithilfe von Infrarot-Strahl-Monitoren und Analyse-Software können Forscher die körperliche Aktivität von Fruchtfliegen unter kontrollierten Bedingungen effektiv messen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Verhaltensbiologie
- Genetik
Hintergrund
- Drosophila melanogaster dient als Modellorganismus zur Untersuchung des Verhaltens.
- Das Verständnis der motorischen Aktivität kann Einblicke in genetische und umweltbedingte Einflüsse geben.
- Die Infrarot-Überwachungstechnologie ermöglicht eine präzise Aktivitätsverfolgung.
- Die Datenanalyse ist entscheidend für die Interpretation von Lokomotionsmustern.
Zweck der Studie
- Die spontane motorische Aktivität von Fruchtfliegen zu quantifizieren.
- Die Auswirkungen genetischer und umweltbedingter Faktoren auf das Verhalten zu bewerten.
- Einen standardisierten Protokollablauf für Forscher in diesem Bereich bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Sammlung und Alterung experimenteller Drosophila melanogaster.
- Einrichten von Populationsmonitoren in einem temperaturgeregelten Inkubator.
- Überführen der Fliegen in Glasgefäße zur Überwachung.
- Betrieb der Aktivitätsmonitore und Analyse der gesammelten Daten.
Hauptergebnisse
- Populationsmonitore quantifizieren effektiv Unterschiede in der motorischen Aktivität.
- Die Datenanalyse liefert Erkenntnisse über die Höhe der spontanen körperlichen Aktivität.
- Die Ergebnisse können zukünftige Studien zu Verhalten und Genetik beeinflussen.
- Das Protokoll ist reproduzierbar und auf verschiedene experimentelle Aufbauten anwendbar.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen zuverlässigen Ansatz zur Untersuchung der motorischen Aktivität von Fruchtfliegen.
- Das Verständnis dieser Verhaltensweisen kann das Wissen über genetische und umweltbedingte Wechselwirkungen erweitern.
- Das Protokoll kann an unterschiedliche Forschungsanforderungen in den Bereichen Neurowissenschaften und Biologie angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Quantifizierung der spontanen motorischen Aktivität bei Drosophila melanogaster liefert einen skalierbaren, objektiven Endpunkt zur Beurteilung genetischer und umweltbedingter Einflüsse auf das Verhalten und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in der frühen Forschungsphase im Bereich Neurowissenschaften und Stoffwechselerkrankungen. Diese Methode ermöglicht eine mechanistische Entwicklungsrisikominderung, indem sie phänotypische Ergebnisse mit der Modulation von Signalwegen verknüpft und somit eine vorhersagende Sicherheit bei der Identifizierung führender Kandidaten bietet. Aufgrund ihrer Reproduzierbarkeit und der Fähigkeit zur kontinuierlichen Überwachung stellt sie eine translationsfähige Biomarker-Plattform für die Validierung präklinischer Modelle dar.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem die spontane körperliche Aktivität als funktioneller Indikator für die Integrität neuronaler und metabolischer Signalwege gemessen wird.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch objektive, kontinuierliche Quantifizierung des motorischen Verhaltens unter genetischen und umweltbedingten Einflüssen.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Selektion von Projekten, indem Verbindungen oder genetische Modifikationen identifiziert werden, die Aktivitätsmuster signifikant verändern und somit eine Zielstrukturenbindung anzeigen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Testbereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Untersuchung vor, indem unter kontrollierten Bedingungen Basisprofile der Fortbewegungsaktivität etabliert werden.
- Reproduzierbarkeit: Liefert standardisierte, quantitative Ergebnisse mittels Infrarotstrahlerfassung und ermöglicht so eine zuverlässige Bewertung von Substanzen über mehrere Wiederholungen hinweg.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die parallele Überwachung in mehreren Gefäßen zur hochdurchsatzfähigen Beurteilung pharmakologischer oder genetischer Eingriffe.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert menschliche Krankheitszustände, indem Bewegungsänderungen bei genetischen Modifikationen untersucht werden, die neurologische oder metabolische Störungen nachahmen.
- Translationale Kontinuität: Verbindet verhaltensbezogene Phänotypen aus der Entdeckungsphase mit der präklinischen Validierung durch konsistente, quantifizierbare Aktivitätsmetriken.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt die Festlegung von Weiterentwicklungskriterien, indem Aktivitätsänderungen mit der Zielmodulation korreliert werden, wodurch falsch-positive Ergebnisse in der Leitstruktur-Optimierung verringert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Testung der Zielhypothese über die Identifizierung von Leitsubstanzen bis hin zur präklinischen Validierung und liefert einen verhaltensbasierten Endpunkt, der mechanistische Erkenntnisse und phänotypische Ergebnisse verbindet.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen und die Validierung von Zielstrukturen, indem quantifiziert wird, wie genetische oder durch Wirkstoffe hervorgerufene Veränderungen die spontane motorische Aktivität beeinflussen.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch kontinuierliche, mehrparametrige Aktivitätsverfolgung in Fliegenpopulationen.
- Analytik: Erzeugt quantitative abhängige Messgrößen (Gesamtaktivität, Standardabweichung), die statistische Vergleiche zwischen experimentellen Bedingungen mittels t-Test-Analyse erlauben.
- Translationale Forschung: Trägt zur Entwicklung von Biomarkern bei, indem Veränderungen der motorischen Aktivität mit zugrundeliegenden genetischen oder metabolischen Störungen verknüpft werden, die für menschliche Krankheitsmodelle relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Plattform für Verhaltensscreenings, die in mehreren Projekten der Neurowissenschaft, des Stoffwechsels und der Alternsforschung eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unschärfen durch direkte Messung der spontanen körperlichen Aktivität als phänotypischen Anker reduziert werden.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch kalibrierte Infrarotüberwachung und definierte Datenanalyse-Workflows.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige, quantifizierbare Verhaltensdaten bereitgestellt werden, die die biologische Ausscheidung in späteren Stadien verringern.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung, indem Interventionen identifiziert werden, die signifikante und reproduzierbare Effekte auf die motorische Leistung haben.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Drosophila, in der Einrichtung von Verhaltensassays und in Infrarot-Überwachungssystemen.
- Benötigt Populationsmonitore, PSIU-Schnittstelle, temperaturgesteuerte Inkubatoren und Software zur Datenerfassung.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich der Alterung der Fliegen, der Geschlechtstrennung und der Vorbereitung der Vials.
- Schließt Anpassungsüberlegungen für unterschiedliche genetische Hintergründe, Ernährungsbedingungen und pharmakologische Behandlungen ein.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen wie das allmähliche Austrocknen des Nährbodens und die Notwendigkeit periodischer Vial-Wechsel zur Sicherstellung der Datenintegrität.
