Name: ScanLag: High-Throughput-Quantifizierung von Colony Wachstum und Verzögerungszeit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Erfahren Sie die ScanLag-Methode zur Hochdurchsatz-Quantifizierung von Koloniewachstum und Verzögerungszeit bei Bakterien. Diese Technik ermöglicht die Unterscheidung zwischen langer Verzögerungszeit und langsamem Wachstum auf Einzelvariantenebene.

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Wir danken Eliq Oster für die Bilder des Bacillus subtillis. Die Arbeit wird vom Europäischen Forschungsrat (# 260871) und der Israel Science Foundation (#592/10) unterstützt.

1. Erstellen Sie das Setup- <ol><li> Wählen Sie einen Flachbettscanner mit einer optischen Auflösung: 4.800 dpi; Hardware-Auflösung: 4.800 x 9.600 dpi; Farbtiefe: 48 bit, die an den jeweiligen Temperatur und Luftfeuchtigkeit arbeiten können. </li><li> Petrischalen haben erhebliche Lautstärke, im Gegensatz zu Papier in der Regel auf kommerziellen Scannern. Die Kolonien liegen auf der Oberseite des Agar-Schicht, ungefähr 5 mm über der Scanneroberfläche. Hinweis: Für die meisten Scanner die Kolonien werden fokussiert. </li><li> Einige Scanner-Unternehmen nicht erlauben den Anschluss von mehr als einer Instanz der Scanner des gleichen Typs auf dem gleichen Computer. Stellen Sie sicher, dass mehr als ein Scanner angeschlossen und eindeutig identifiziert werden. </li><li> Bereiten Sie das Zubehör, wie unten aufgeführt: <ol><li> Bereiten Stücke von schwarzem Filz sterile Tuch, um die Platten bedeckt sind (Abbildung 1 Schritt 2). </li><li> Um die Petrischalen in Position zu halten, bereiten weißen Plattenhalter (Materialien und Methoden), die die Scanner, die passen und 6 hol habenn die Größe der Schalen (1 Schritt 3). </li></ol></li><li> Wenn die für das Wachstum des Mikroorganismus benötigt werden, stellen die Scanner in einer temperaturgeregelten Umgebung. Verbinden der Scanner an den Computer. </li><li> Optional: Verbinden Sie das Relais an den Computer an und umgehen die Ein / Aus-Schalter des Scanners, um Temperaturgefälle zu überwinden. HINWEIS: Die Relaiseinheit ist für extrem temperaturempfindlichen Mikroorganismen. Sie schaltet den Scanner so, dass die Elektronik nicht die Oberfläche ungleichmäßig erhitzen. Mit nur einem Teil der Oberfläche des Scanners können ähnliche Ergebnisse zu erzielen. </li></ol> 2. Installieren des Scan-Managers <ol><li> Kopieren Sie alle &quot;Scan-Manager&quot; Anwendungsdateien in einem bestimmten Verzeichnis aus http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html. </li><li> Konfigurieren ScanningManager.exe.config Datei entsprechend den Scanner Namen, in der Computerverwaltung-&gt; Geräte-Manager-&gt; Imaging Devices (erscheint <strong&gt; Abbildung 2). </li><li> Für die Fehlersuche der &quot;Scanning-Manager&quot;-Anwendung finden Sie in der Readme-Datei. </li><li> Für weitere Dokumentation auf der &quot;Scanning-Manager&quot;-Anwendung finden Sie Documentation.html. </li></ol> 3. Führen Sie ein Experiment <ol><li> Bereiten Sie die Petrischalen (Abbildung 1): <ol><li> Verdünnte die Kultur etwa 2.000 CFU / ml. Platte 0,1 ml Kultur gleichmäßig auf der Plattenoberfläche. </li><li> Um einen guten Kontrast zwischen den Kolonien und die Schale zu gewinnen und Feuchtigkeit wird die Platte mit einem Stück schwarzen Filz sterilen Tuch. Setzen Sie Deckel auf der Platte. </li></ol></li><li> Platzieren der Platten in den Halterungen an den Scanner. </li><li> Starten Sie den Scan-Manager (Abbildung 3): Wählen Sie die teilnehmenden Scanner aus der Liste der angeschlossenen Scanner. Wählen Sie die Anzahl der Bilder, die (Wiederholungen) entnommen werden, das Zeitintervall zwischen aufeinanderfolgenden Bildern (Zeitlücke) und die Zeitverzögerung, bevor ter experimentieren (Start nach). </li></ol> 4. Analyse der Bilder HINWEIS: Eine Übersicht über Berechnungsmethoden für die Analyse der Bilder in MATLAB mit &quot;ScanLag&quot;, die frei verfügbar für nicht-kommerzielle Nutzung an http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications ist vorgesehen. html. Weitere Funktionen sind in der Software-Handbuch beschrieben und ein Beispiel-Code ergänzt. <ol><li> Die Bilder von jedem Scanner Sortierung in separaten Ordnern. </li><li> Mit Befehlsfenster Matlab, führen Sie die folgenden Verfahren. Die um diese Verfahren ausführen Parameter werden im Software-Handbuch definiert. <ol><li> Führen PreparePictures Vorverarbeitung durchführen: In der Vorverarbeitung werden die Bilder von einem Scanner ausgerichtet ist. Jede Petrischale wird aus jeder Folge von Bildern abgeschnitten. Der Zeitpunkt, zu dem jedes Bild gesammelt wurde, wird von der Zeitstempel abgerufen. </li><li> Führen TLAllPlates zu Erkennung und Verfolgung durchzuführen In Each Petrischale getrennt, Kolonien werden erkannt und eine Identifikationsnummer zugewiesen. </li><li> Analyse der extrahierten Daten: Die Größen der einzelnen Kolonie erkannt werden als eine Funktion der Zeit gemessen. Um das Erscheinungsbild Verteilung der Kolonien zu extrahieren verwenden Sie die folgenden Funktionen in Matlab-Befehlsfenster (weitere Informationen finden Sie im Software-Handbuch vorhanden): <ol><li> Führen ScanLagApp, um die Analyse eines bestimmten Petrischale zusammen mit dem Graphen der Kolonien Display-Größe über der Zeit (Abbildung 4). <ol><li> Verwenden Sie den Schieberegler, um die aktuelle Zeit von der Platte zu ändern. Der Zeitpunkt wird auch durch eine entsprechende vertikale Linie auf der Kolonien Flächendiagramm angezeigt werden. </li><li> Klicken Sie auf eine Kolonie zu seinem zugehörigen Kurve zu sehen, und umgekehrt, klicken Sie auf eine Kurve zu seinem zugehörigen Kolonie zu finden. Nach der Identifizierung der Kolonie kann der Phänotyp, der durch die Auswahl der Kolonie von der Petrischale identifiziert abgerufen werden. </li><li> Filter Fehler in der automatischen Analyse von choosingen eine Kolonie und dann auf die Schaltfläche auszuschließen. Beim Anklicken ausschließen die Anzahl der Kolonie wird gelb. </li></ol></li><li> Nachdem man durch die Ergebnisse der Analyse von jeder Platte, fassen die Ergebnisse: <ol><li> Führen AddHistograms um ein Histogramm der Erscheinungszeiten erstellen. </li><li> Führen plotDeathCurve um eine Überlebenskurve Darstellung der Verteilung erstellen. </li><li> Führen GetAppearanceTimes, um das Aussehen Zeit aller Kolonien im Experiment zu bekommen. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Mikroskopische Methoden, die auf die direkte Beobachtung werden oft als die &quot;goldene Standard&quot; für das Studium Single-Cell-Verhalten betrachtet. ScanLag, die Messung der Verteilung der Verzögerungszeiten in Bakterienpopulationen ermöglicht, liefert Daten in guter Übereinstimmung mit der von der Einzelzellanalyse erhaltene Verteilung und erzielt viel höhere Statistik. Mehrere wichtige Schritte müssen für diese Methode durchgeführt werden, um gut zu funktionieren: Erstens, nicht auf die Scanner-Auflösung, die 4800 x 9600 sein sollte, um gute Bilder zu erhalten gefährden. Zweitens, bewusst sein, dass es ohne die Power-Management-Modul (Schritt 1.6), Temperaturgefälle auf der Flachbett-Oberfläche entwickeln und das Wachstum beeinflussen. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Filtration von Defekten wie z. B. Staub, die fälschlicherweise als Kolonien, die von der Software gezählt haben kann. Der integrierte Hintergrundabzug der Software überwindet diese Mängel in der Regel, aber manchmal &quot;false&quot; Kolonien müssenmanuell gefiltert werden. Die wichtigsten Schritte zur Problembehandlung zwischen den Platten Variation Adresse könnte in die Einrichtung, aus mehreren Gründen: (a) Die Wachstumsrate der Mikroorganismen wird durch die Temperatur beeinflusst. Temperatur-und Feuchtigkeitsbedingungen aufgrund der ungleichmäßigen Belüftung oder Position der Schale im Inkubator erfolgen. (B) Die Elektronik der Scanner könnte erwärmen und zu einem Temperaturgradienten über die Oberfläche des Scanners. Fig. 10 zeigt den Einfluß eines solchen räumlichen Wärmegradienten über Bacillus Bakterien zusammen mit den Messungen der Temperatur auf der Oberfläche vor dem Scanner und nach der Implementierung des Power-Management-Modul (Schritt 1.6). Beachten Sie, dass dieses Modul vielleicht nicht für neuere Scanner notwendig sein, und wenn nur ein Teil der Scanner-Oberfläche verwendet wird, kann die Energieverwaltung unnötig. (C) Platten mit unterschiedlicher Opazität des Nährstoff-Agar könnte, um verschiedene Ebenen der Erkennung führen. Fig. 11 thE Toleranz für unterschiedliche Volumina Nähragar, die in verschiedenen Trübungen führen. Experimentell ScanLag die Technik ist einfach durchzuführen und erfordert nur Mikroorganismen auf Standard-Petrischalen Platte, und sie auf die Scanner-Oberfläche platzieren. Die, die entwickelt wurde Software steuert den gesamten Vorgang. Die Bildaufnahme wird automatisch durchgeführt, und die Bildanalyse zur Kolonieverfolgung ist auch automatisch. Weiterhin kann das System vergrösserte werden, um viele verschiedene Bedingungen zur gleichen Zeit zu messen. Schließlich beruft sich die Methode für kommerzielle Büroscanner und ist daher kostengünstig. Diese Technik kann zur Erforschung von Mikroorganismen, die aus E. unterscheiden verlängert coli K-12, jedoch einige Überlegungen müssen gemacht werden. Erstens muss der Einfluss des frühen erscheinen Kolonien auf den späteren bewertet werden, wie im einzelnen in einer früheren Veröffentlichung 7 beschrieben. Für E. Coli K-12, diemaximale Dichte von KBE pro Platte beträgt 200. Andere Stämme mit verschiedenen Größen der Kolonien, und andere mögliche Übersprechen zwischen Kolonien, könnte eine andere Dichte erfordern. Zweitens wird die Analyse der Platten auf bestimmte Software-basierte Schwellenwerte, müssen möglicherweise modifiziert werden, abhängig von dem Kontrast zwischen dem festen Medium und die Kolonien kalibriert. Die Software kann auch erweitert werden, um andere Kolonie Merkmale zu extrahieren, über Verzögerung und Wachstumsrate. Der Software-Code ist offen und kann modifiziert werden, um Kolonie Form, Helligkeit, Glätte und Farbe zu extrahieren. Da Messungen an Kolonien, die aus einzelnen Zellen stammen vorgenommen, die Daten zeigen neue Phänotypen, die nicht durch Bevölkerungsebene Messungen gemessen werden kann. Die Bedeutung der Verzögerungszeitverteilung wird in Gegenwart von Antibiotika offenbart. Viele Antibiotika sind dafür bekannt, effektiv zu sein nur gegen wachsende Zellen; daher so lange wie Zellen bleiben in der Lag-Phase und nicht wachsen, sind sie provon Auswirkungen dieser Antibiotika 21 geschützt. Wenn die Zahl der Überlebenden Bakterien werden in Zeitintervallen während der Behandlung mit Antibiotika 15,22,23 ausgewertet wird eine Subpopulation von Bakterien, genannt persisters oft offenbart. In bestimmten Fällen Immunität gegen Antibiotika-Behandlung stammt aus längeren Verzögerung. Mit diesem Aufbau ist diese Verzögerung ergeben, und oft eine nicht-triviale Verteilung 24 (Fig. 6). Dieses Verfahren ermöglicht auch die Wiedergewinnung von seltenen Mutanten. Beispielsweise nach der Plattierung einen mutagenisierten Population, Mutanten können basierend auf den Phänotyp identifiziert und isoliert werden direkt, ohne Selektion. Die Einrichtung könnte auch Zell-Zell-Interaktionen zu überwachen durch Messung des Wachstums der Kolonien in Abhängigkeit von der Dichte benachbarter Kolonien und Phänomene wie Quorum Sensing oder die Ausbreitung von Bakterien zu quantifizieren Schwärmen. Mehrdimensionale Informationen, die von zukünftigen Experimenten mit dieser Methode aufgedeckt werden, um eine bessere Charakterisierung der mikrobiellen Population führens und der Fortschritte in der Medizin-und Umweltforschung.

Bakterien entwickelt haben, um zu vielen stressigen Bedingungen zu reagieren. Ein allgemeines Merkmal der Anpassung an Stress ist eine Änderung der Wachstumsdynamik 1,2. Die exponentielle Wachstumsrate und die Verzögerungszeit, nämlich die Zeit benötigt, um an neue Bedingungen anzupassen: Wachstumsdynamik wird meist durch zwei Parameter gekennzeichnet. Wohingegen eine große Anzahl von Hochdurchsatz-Methoden konzentrieren sich auf Messungen der Wachstumsrate, die Verzögerungszeit oft eine übersehene Parameter, obwohl es der entscheidende Parameter für die Charakterisierung der Anpassung an neue Bedingungen. Die Quantifizierung der Anpassung an sich verändernde Bedingungen durchgeführt worden ist traditionell mit mühsamen manuellen Methoden 3,4. Kürzlich wurden fortgeschrittene Techniken zur Analyse von Einzelzellen 5,6 entwickelt. Jedoch ist es immer noch schwierig, ein normales Wachstum zu unterscheiden nach einer Verzögerung des Wachstums (nämlich eine Verzögerungszeit) von 2,3 langsames Wachstum. Automatisiertes Verfahren wurde konstruiert, ScanLag 7, umzu unterscheiden zwischen diesen beiden ähnliche Phänotypen. Ein markantes Beispiel für die Bedeutung der Studie der Verzögerungszeit Verteilung unter Antibiotika-Behandlung enthüllt. Viele Antibiotika und anderen Belastungen zu töten nur aktiv wachsenden Zellen, und somit Zellen, die &quot;rückständigen&quot; sind geschützt 8. Um Verzögerungszeit zu überwachen, kann man einzelne Zellen unter dem Mikroskop beobachten und überwachen die erste Liga Zeit. Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode ist, dass die dynamische Zeitbereich ist begrenzt; diejenigen Zellen, die früh wachsen bedecken die Oberfläche mit einer exponentiellen Rate, effektiv abnehm das Wachstum von Zellen mit längeren Verzögerungszeit. Verwendung von Strömungskammern etwas umgeht dieses 5, aber eine begrenzte Anzahl von Zellen verfolgt werden kann und der Anteil der Bakterien, die die Lag-Phase verlassen, nachdem die Mehrheit der Bevölkerung hat begonnen wächst nicht beobachtet werden kann. Trotz dieser Einschränkungen sind einige Studien des Einflusses der Gehalt an Di ausgewertetfferent betont auf Zeitverzögerung der Verbreitung mittels Einzelzellmikroskopie 12.09. Eine weitere Möglichkeit, Verzögerungszeit Verteilung zu überwachen, ist durch Trübungsmessungen 13,14. Viele parallele Kulturen, jeweils gestartet von einer einzelnen Zelle, in einem optischen Lesedichte, die die Anzahl von Bakterien in der Kultur im Laufe der Zeit misst gewachsen. Dieses Verfahren ist durch die Genauigkeit der Extrapolation und der Anzahl der Vertiefungen in einer Platte beschränkt. Ein automatisiertes Verfahren entwickelt, genannt ScanLag, dass Verzögerungszeiten und Wachstumszeitverteilungen ermöglicht zu beurteilen, auch für den kleinen Prozentsatz von Bakterien in einer Population, die sehr lange Verzögerungszeiten haben. Das Verfahren basiert auf dem Nachweis von Kolonien auf Nähragar herkömmlichen Platten 15 (Fig. 1) auf. Um automatisieren Erkennung 16,17 eine Reihe von kommerziellen Scanner 18, die von Software im Haus gerichtet sind, in regelmäßigen Abständen Bilder der Platten zu erwerben, wurde entwickelt. Software warentwickelt, um die Bilder automatisch zu analysieren und zu extrahieren 19,20 quantitative Parameter wie Zeit des Erscheinens der jeweiligen Kolonie und Wachstumszeit jeder Kolonie, die hier definiert als die Zeit, um von 20 Pixel auf 80 Pixel wachsen. Hier stellen wir die Methode im Detail, einschließlich der Konfiguration des Systems und die Verwendung der automatisierten Bildanalyse-Software, die eine bessere Benutzerschnittstelle verbessert ist. Dieses Verfahren geeignet ist, andere Eigenschaften der Kolonien, wie Morphologie und Farbe zu messen. Die Messung dieser Arten von Parametern wird die Verwendung des Systems in mehrdimensionalen Phenomics ermöglichen. Da das Verfahren erkennt Kolonien aus Einzelzellen, kann das System neue Phänotypen, die nicht durch Bevölkerungsebene Messungen gemessen werden kann offenbaren. Die Technik ermöglicht die Erfassung und Wiedergewinnung von seltenen Varianten und erleichtert Screening nach gewünschten Merkmalen.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB Bouillon</td><td>BD</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 90 mm</td><td>Miniplast</td><td>20090-01</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection v37</td><td>Epson</td><td>B11B207201</td><td>Flachbettscanner mit optischer Auflösung: 4.800 dpi, Hardware Auflösung:&nbsp; 4.800 x 9.600 dpi, Farbbittiefe 48 Bit.</td></tr><tr><td>Epson Perfection v200</td><td>Epson</td><td>B11B188011</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection 3490</td><td>Epson</td><td>B11B177011</td><td></td></tr><tr><td>ADU200 USB Relay</td><td>ONTRAK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stücke aus sterilem schwarzem Filztuch</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td>Ca. 100 x 100 mm</td></tr><tr><td>Weiße Tellerhalter</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td>Oberflächengröße, mit Loch</td></tr> <tr><td>mit 6 x 99 mm DurchmesserDelerin Ringe in der Größe der Petrischale</td><td>Maßanfertigung</td><td></td><td>Innendurchmesser: 72 mm Außendurchmesser: 86 mm Oberer Außendurchmesser: 90 mm</td></tr></tbody></table>

scanlag: high-throughput-quantifizierung von colony wachstum und verzögerungszeit

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

Wachstumsdynamik sind grundlegende Eigenschaften von Mikroorganismen. Wachstum präzise zu quantifizieren, ist ein wichtiges Ziel in der Mikrobiologie. Die Wachstumsdynamik wird sowohl durch die Verdopplungszeit des Mikroorganismus als auch durch eine Verzögerung des Wachstums beim Übergang von einem Zustand in einen anderen, die Verzögerung, beeinflusst. Die ScanLag-Methode ermöglicht die Charakterisierung dieser beiden unabhängigen Eigenschaften auf der Ebene von Kolonien, die jeweils aus einer einzigen Zelle stammen, wodurch eine zweidimensionale Verteilung der Verzögerungszeit und der Wachstumszeit erzeugt wird. In ScanLag wird die Messung der Zeit, die benötigt wird, um Kolonien auf herkömmlichen Nähragarplatten zu erkennen, auf einer Reihe von kommerziellen Scannern automatisiert, die von einer hauseigenen Anwendung gesteuert werden. Petrischalen werden auf den Scannern platziert, und die Anwendung nimmt regelmäßig Bilder auf. Die automatisierte Analyse des Koloniewachstums wird dann von einer Anwendung durchgeführt, die die Erscheinungszeit und die Wachstumsrate jeder Kolonie zurückgibt. Andere Parameter, wie z.B. die Form, Textur und Farbe der Kolonie, können für die mehrdimensionale Kartierung von Subpopulationen von Zellen extrahiert werden. Schließlich ermöglicht die Methode die Gewinnung seltener Varianten mit spezifischen Wachstumsphänotypen für die weitere Charakterisierung. Die Technik könnte in der Bakteriologie zur Identifizierung langer Verzögerungen eingesetzt werden, die zu einer Persistenz von Antibiotika führen können, sowie als allgemein kostengünstige Technik für phänotypische Screenings.

Als ein Beispiel der Verzögerungszeit Verteilungsextraktions, Fig. 5 zeigt die Fähigkeit von ScanLag mit spezifischen Eigenschaften auf eine Platte über die Zeit zu identifizieren und zu verfolgen jede Kolonie, wie sie in einem Screening-Assay durchgeführt werden. Wenn die Kultur des Mikroorganismus ist heterogen, könnten die verschiedenen Subpopulationen sich während des Assays zeigen. Zum Beispiel zeigt Fig. 6 die Darstellung Quantifizierung und somit zeigt bimodale Verzögerungszeitverteilung in einem Mutantenstamm von E. coli. Die Wachstumsrate der Zellen beeinflusst die Auftrittszeit der Kolonie. Wenn Kolonien wachsen mit der gleichen Geschwindigkeit kann der späte Auftreten zu der Verzögerungszeit (Fig. 7) zurückgeführt werden. Um zu überprüfen, dass die Methode tatsächlich misst die Verzögerungszeit von Einzelzellen verglichen wir ScanLag Ergebnisse mit den Ergebnissen Einzelzellmikroskopie; ist diese Prüfung abausführlich in einer früheren Publikation 7 ribed. Dieses Verfahren ermöglicht die Überwachung von viel mehr Zellen als mit Mikroskopie ausgewertet. Die Verwendung von Mikroskopie und mit ScanLag erhaltenen Ausschüttungen weitgehend überlappen. Die ScanLag Verteilung ist etwas breiter; theoretische Analysen vorhersagen Erweiterung in der Größenordnung der Standardabweichung der Teilung Zeit. Wenn Wachstumszeit ist für jeden Stamm, muß der Ursprung der Verzögerung in der Erscheinung weiter untersucht werden, die mit anderen Verfahren. Der Einfluss des frühen erscheinende Kolonien auf das Aussehen der Kolonien wurde später untersucht. Kontrollexperimente 7 bestätigt, dass spätere Aussehen so lange wie die Gesamtzahl der Kolonien pro Platte hat (Abbildung 8) nicht mehr als 200 nicht betroffen war. Ein weiteres Kontrollexperiment bestätigt, dass der Standort der Kolonie auf der Platte wurde sein Aussehen Zeit 7 nicht zu beeinträchtigen. Die Analyse des pneuste wird spezifischen Schwellenwerten, die eine Modifizierung in Abhängigkeit von Nährstoffen in Wachstumsmedium oder dem Typ des Mikroorganismus vorliegt benötigen kalibriert. Dennoch ist die Analyse für eine Vielzahl von Schwellenwerten ziemlich robust wie in Fig. 9 gezeigt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig1highres.jpg" width="500" /> 1. Eine schematische Darstellung der Schritte, um eine Kolonie Aussehen Verteilung erstellen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Ein Screenshot der Geräte-Manager zeigt die Namen der angeschlossenen Scanner und der Konfigurationsdatei. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/5456/51456fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößern</a>Version dieser Figur. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig3highres.jpg" width="500" /> Ein Screenshot der Scan Manager Abbildung 3.. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Ein Screenshot der ScanLagApp. Ein Bild der Platte ist auf der linken Seite, und die Wachstumskurven der einzelnen Kolonie sind auf der rechten Seite, wie in der Anleitung beschrieben. Die Spitzen in einigen Kolonien Bereich Kurven auftreten, wenn zwei oder mehr Kolonien zu verschmelzen. Beim Zusammenführen der Kolonien erfolgt, wird der Bereich dieser Kolonien als gemeinsames Gebiet betrachtet. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig5highres.jpg" width="500" /> 5. Ein repräsentatives Ergebnis der Analyse einer Platte. (A) Ein Bild von dem Ausgang der Erfassungsanwendung am Ende des Experiments. Jede Kolonie Bereich identifiziert wird, gefärbt und mit einer eindeutigen ID-Nummer zugewiesen. Die Pfeile zeigen auf repräsentative Kolonien in B. gemessen Die Kolonie wird auf der Grundlage Intensitätsschwelle erkannt (für E. coli-Kolonien auf LB-Agar-Agar oder M9 diese Schwelle beträgt 0,03. Für andere Medien oder Bakterien, diese Schwelle in den Funktions ProcessPictures eingestellt werden ). Nur Objekte über 10 Pixel gezählt (diese Schwelle in den Funktions MatchColonies geändert werden). Nachweis einer Kolonie beginnt bei etwa 10 5 Bakterien. (B) Grundstücke der Fläche in Pixeln gegenüber der Zeit von vier repräsentativen Kolonien in dieser Platte. Das &quot;Aussehen Zeit&quot; jeder Kolonie ist, wenn die Kolonie festgestellt wird. Die &quot;Wachstumszeit&quot; jeder Kolonie wird hier definiert als die Zeit, her wachsenm 20 Pixel auf 80 Pixel (diese Grenzen einstellbar mit der Funktion getAppearanceGrowthByVec sind). Die Software schließt die Kolonien, die vor dem Erreichen der oberen Grenze zusammengeführt. Identifizierung einer besonderen Kolonie nach seiner Eigenschaften ist einfach dank der Identifikationsnummer und die Farbe zu jeder Kolonie zugeordnet. Beispiels Kolonien # 1, 56, 77 und 124 sind in beiden Graphen hervorgehoben. <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig6highres.jpg" width="500" /> Aussehen Quantifizierung Abbildung 6. Können bimodale Verteilung Verzögerungszeit offenbaren. Vergleich ScanLag Analyse Histogramme der Auftritt mal für zwei verschiedene Stämme. Blaue Linie: Wildtyp-Stamm wächst exponentiell (Gesamt: 1.320 Kolonien); rote Linie hohe Persistenz-Mutante mit hinkt Bakterien (Gesamt: 1.529 Kolonien) bereichert. (A) Normierte Histogramme Aussehen. Der Spitzendes Auftretens von exponentiell wachsenden Zellen ist die typische Zeit, um eine nachweisbare Kolonie wachsen. Einschub: gleiche Histogramm des Mutantenstammes nach Abzug der Zeitpunkt der Spitze der exponentiellen Kultur, um die tatsächliche Zeitverzögerung auf Log beabstandeten Fächern, die die Verzögerungszeit bimodale Verteilung zu erhalten. (B) Überlebensfunktion von den gleichen Daten wie in (A) auf einer logarithmischen Skala. Diese Darstellung verbessert die späte Auftreten Schwanz der Mutante. <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7. Aussehen Verteilung und Wachstum Zeitverteilung. (A) und (B) zeigen zweidimensionale Histogramm der Auftrittszeit und die Wachstumszeit der zwei unterschiedlichen Bedingungen (Die Software schließt Kolonien, die vor dem Erreichen der oberen Grenze zusammengeführt). (C) Vergleichen der Histogrammeder beiden Stämme zeigen den Unterschied im Aussehen der Zeit, während die Wachstumszeiten (D) ähnlich sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig8highres.jpg" width="500" /> Abbildung 8. Das Aussehen der frühen Kolonien nicht mit dem Aussehen des späteren Kolonien stören. (A) lag time Verteilung von Wildtyp-Zellen allein plattiert. (B) zurückbleiben Zeitverteilung eines kalten sensiblen Stamm allein, nach der Übertragung auf permissiven Temperatur. (C) zurückbleiben Zeitverteilung beider Stämme unter den gleichen Bedingungen zusammen plattiert. Die schwarze Linie stellt die erwartete Verteilung auf der Grundlage der Messung erhalten wird, wenn jeder Stamm separat Daten. Ein gut eingreement zwischen erwarteten und gemessenen Verteilungen ist, solange die Gesamtzahl der Kolonien pro Platte unter 200 erhalten. <img alt="Fig. 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig9highres.jpg" width="500" /> .. 9 der Detektionsschwelle beeinträchtigt nicht die Form der Kolonie Aussehen Verteilung Die Kolonie Aussehen Verteilung wurde für den gleichen Datensatz mit zwei verschiedenen Schwellengrößen analysiert; (A) Schwellengröße ist 10 Pixel; (B) Schwellengröße ist 50 Pixel. Anzahl der Zellen pro Histogramm: ca. 1500. Die unterschiedlichen Detektionsschwelle nur zu einer Verschiebung der Erfassungszeit. <img alt="10" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig10highres.jpg" width="500" /> Abbildung 10. Temperaturstabilität Messungen across die Scanner-Oberfläche. (A) Bild von einer Platte mit Kolonien von Bacillus subtilis auf den Scanner ohne Power Management gewachsen. Die Oberfläche ist wärmer auf der Unterseite und damit die Kolonien wachsen schneller. Die schrittweise Linie neben der Platte ist eine schematische Darstellung der Wärmegefälle. (B) Die Temperaturstabilität wurde mit zwei Thermoelemente über die Scanner-Oberfläche platziert gemessen. Der Scanner erwärmt sich während jeder Abtastung und über die Zeit. (C) Mit Power Management ist die Temperatur gleichmäßiger und die Kolonien wachsen mit ähnlichen Raten. (D) wie (B) mit dem Power-Management-Modul. Temperaturkonstanz von ± 0.2 ° C. <img alt="11" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig11highres.jpg" width="500" /> Abbildung 11. Unterschiede in der Erscheinung Verteilung kann durch di seinfferences in den Bänden von Festmedium. Das gleiche Bakterienkultur wurde auf Platten mit unterschiedlichen Volumina LB-Agar ausplattiert, was zu einer unterschiedlichen Höhe der Agaroberfläche. Die unterschiedlichen Höhen führte zu unterschiedlichen Opazität der Platten und damit eine andere Detektionszeit. Die Zwischenplatten Unterschied wurde geprüft, und die Differenz zwischen den verschiedenen Höhenbedingungen. (A) Typische Unterschiede zwischen den Platten gleicher Volumina von 30 ± 0,5 ml LB-Agar. (B) Unterschied zwischen den verschiedenen Höhenbedingungen: das Aussehen Verteilung für Platten mit einem Volumen von 20 ± 0,5 ml (rot) von 30 ± 0,5 ml (grün) und 40 ± 0,5 ml (blau) gemessen. Jede Bedingung ist der Durchschnitt von 6 verschiedenen Platten. Solange das Volumen der Platten innerhalb von ± 5 ml-Bereich, ist die Deckkraft ähnlich und führt ähnliche Erscheinung Zeitverteilung.

ScanLag ist eine Hochdurchsatzmethode zur Messung der Wachstumsverzögerung, d. h. der Verzögerungszeit, sowie der Wachstumsrate von Kolonien für Tausende von Zellen parallel. Das Screening mit ScanLag ermöglicht die Unterscheidung zwischen langer Verzögerungszeit und langsamem Wachstum auf der Ebene einer einzelnen Variante.

ScanLag: High-Throughput-Quantifizierung von Colony Wachstum und Verzögerungszeit

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Lag-Verteilung einer bakteriellen Kultur zu quantifizieren, um auf Ebene einer einzelnen Variante zwischen langer Lag-Phase und langsamen Wachstum unterscheiden zu können. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Anordnung aus mehreren Scannern aufgebaut wird, die von einem einzigen Computer erkannt werden. Im zweiten Schritt werden definierte koloniebildende Einheiten auf Petrischalen mit herkömmlichem Nähragar aufgebracht.Anschließend werden die Petrischalen in speziell konstruierte Halterungen auf den Scannern platziert und mittels der Scanner zeitraffende Aufnahmen der Kolonien angefertigt. Im letzten Schritt erfolgt die Bildanalyse mit der Scan-Lag-Software, die die Bilder automatisch auswertet und quantitative Parameter wie den Zeitpunkt des Auftretens jeder Kolonie sowie die Wachstumszeit jeder Kolonie extrahiert. Schließlich werden mithilfe von MATLAB-Funktionen aus diesen Daten das Lag-Histogramm erstellt.Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose persistierender Infektionen, da sie den Nachweis langsamer Varianten ermöglicht. Wählen Sie zunächst einen Flachbettscanner mit einer optischen Auflösung von 4.800 DPI, einer Hardware-Auflösung von 4.800 × 9.600 DPI und einer Farbtiefe von 48 Bit, der bei den erforderlichen Temperatur- und Luftfeuchtigkeitsbedingungen betrieben werden kann. Wählen Sie einen Scanner, der es ermöglicht, mehrere Scanner an den Computer anzuschließen und sie zu identifizieren.Im Gegensatz zu Papier, das üblicherweise bei handelsüblichen Scannern verwendet wird, haben Petrischalen ein erhebliches Volumen, sodass die Kolonien etwa fünf Millimeter über der Oberfläche des Scanners auf der Agarschicht liegen. Bei den meisten Scannern werden die Kolonien scharf abgebildet sein.Bereiten Sie Stücke sterilen schwarzen Filztuchs vor, um die Platten abzudecken und die Petrischalen an ihrem Platz zu halten. Bereiten Sie weiße Plattenträger vor, die auf die Scanner passen und sechs Löcher aufweisen, die dem Durchmesser der Schalen entsprechen, falls erforderlich für das Wachstum des Mikroorganismus. Stellen Sie die Scanner in eine temperaturgeregelte Umgebung.Schließen Sie die Scanner an den Computer an, um den Scan-Manager zu installieren. Kopieren Sie alle Anwendungsdateien des Scan-Managers aus der Scan-Lag-Website in ein bestimmtes Verzeichnis. Verwenden Sie einen Computer mit einem Windows-XP-Betriebssystem und stellen Sie sicher, dass Microsoft.Die .NET Framework-Version 2.0 ist installiert. Vorgang unterbrochen. Suchen Sie die Scannernamen in der Geräteverwaltung des Computermanagements unter Bildgeräte. Konfigurieren Sie dann die Konfigurationsdatei des Scanmanagers entsprechend diesen Namen.Um ein Experiment durchzuführen, verdünnen Sie die Kultur zunächst auf etwa 2000 KBE pro Milliliter. Anschließend werden 0,1 Milliliter der Kultur gleichmäßig auf Petrischalen ausgetragen, die mit herkömmlichem Nähragar vorbereitet wurden. Danach wird die Schale mit einem Stück steriler, schwarzer Filzunterlage abgedeckt, um einen guten Kontrast zwischen den Kolonien und der Schale zu erzielen und Feuchtigkeit zu absorbieren.Setzen Sie den Deckel auf die Platte und stellen Sie die Platten in die Halterungen der Scanner. Starten Sie den Scan-Manager und wählen Sie die teilnehmenden Scanner aus der Liste der angeschlossenen Scanner aus.Wählen Sie anschließend die Anzahl der aufzunehmenden Bilder, das Zeitintervall zwischen den einzelnen Bildern und die Zeitverzögerung vor Beginn des Experiments für die Bildanalyse aus. Sortieren Sie zuerst die Bilder von jedem Scanner mithilfe des MATLAB-Befehlsfensters in separate Ordner. Führen Sie zunächst „prepare images“ zur Durchführung der Vorverarbeitung aus.In der Vorverarbeitung werden die Bilder aus einem Scanner ausgerichtet. Jede Petrischale wird aus jeder Bildsequenz zugeschnitten. Der Zeitpunkt, zu dem jedes Bild aufgenommen wurde, wird aus dem Zeitstempellauf abgerufen.Zeitraffer für alle Platten, um die Detektion und Verfolgung durchzuführen; Kolonien werden in jeder Petrischale erkannt und mit einer Identifikationsnummer versehen. Die Größen jeder erkannten Kolonie werden als Funktion der Zeit gemessen. Extrahieren Sie die Verteilung des Erscheinens der Kolonien mithilfe des MATLAB-Befehlsfensters.Führen Sie zuerst die Scan-Lag-App aus, um die Analyse einer bestimmten Petrischale zusammen mit dem Größen-zu-Zeit-Diagramm für die Kolonien anzuzeigen. Verwenden Sie dann den Schieberegler, um die aktuelle Zeit der Platte zu ändern. Die Zeit wird ebenfalls durch eine entsprechende vertikale Linie im Flächendiagramm der Kolonien angezeigt.Klicken Sie auf eine Kolonie, um die zugehörige Kurve anzusehen, und umgekehrt. Nachdem die Kolonie identifiziert wurde, kann das Phänotyp bestimmt werden, indem die Kolonie aus der identifizierten Petrischale entnommen wird. Filtern Sie Fehler in der automatischen Analyse, indem Sie eine Kolonie auswählen und den Ausschluss-Button anklicken.Beim Klicken auf „Ausschließen“ wird die Nummer der Kolonie gelb. Nachdem die Ergebnisse der Analyse jeder Platte durchgesehen wurden, summieren Sie die Ergebnisse. Beim ersten Durchlauf fügen Sie Histogramme hinzu, um ein Erscheinungshistogramm zu erstellen.Anschließend wird die Zeit über den Sterblichkeitsverlauf aufgetragen, um eine Überlebenskurve als Darstellung der Verteilung zu erstellen. Ein Beispiel einer extrahierten Lag-Phasen-Verteilung ist hier gezeigt. Mithilfe der Scan-Lag-Funktion können einzelne Kolonien mit spezifischen Eigenschaften auf einer Platte über die Zeit hinweg identifiziert und verfolgt werden, wie es in einem Screening-Assay durchgeführt wird.Wenn die Kultur des Mikroorganismus heterogen ist, können sich die unterschiedlichen Subpopulationen während des Assays zeigen. Diese Abbildung zeigt die Quantifizierung des Erscheinens und offenbart somit eine bimodale Lag-Phasen-Verteilung in einem Mutantenstamm von e coli. Dargestellt sind hier zweidimensionale Histogramme der Erscheinungszeit und der Wachstumszeit unter zwei verschiedenen Bedingungen.Der Vergleich der Histogramme der beiden Stämme zeigt den Unterschied in der Erscheinungszeit, während die Wachstumszeiten ähnlich sind. Wenn Kolonien mit der gleichen Rate wachsen, kann das spätere Auftreten auf die Lag-Phase zurückgeführt werden. Der Einfluss früh erscheinender Kolonien auf das Auftreten späterer Kolonien wurde untersucht.Hier gezeigt sind die Lag-Phasen-Verteilung von Wildtyp-Zellen, die allein ausgestrichen wurden, und die Lag-Phasen-Verteilung eines kälteempfindlichen Stammes. Kontrollversuche, bei denen nach der Übertragung auf die permissive Temperatur allein ausgestrichen wurde, bestätigten, dass das spätere Erscheinen nicht beeinträchtigt war, solange die Gesamtzahl der Kolonien pro Platte 200 nicht überschritt. Gemäß diesem Verfahren.Mit anderen Methoden wie der Ganzgenomsequenzierung oder der Expressionsanalyse können Kolonien mit interessantem Wachstumsphänotyp untersucht werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob der Phänotyp genetisch oder epigenetisch bedingt ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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