Name: Anwendung von Retinsäure zu Osteozyten Kulturen aus primären Maus-Osteoblasten erhalten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Gewinnung reifer Osteozyten aus primären Maus-Osteoblasten mittels All-Trans-Retinsäure. Diese Technik ermöglicht die schnelle Erzeugung homogener Zellpopulationen für die Knochenbiologie.

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Die Finanzierung wurde von &quot;Progetto ein concorso Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico IRCCS 2009-2010&quot;, um MD, und Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano bereitgestellt

Alle Tierversuche wurden nach der aktuellen nationalen und europäischen Vorschriften über den Schutz von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken verwendet und überprüft wurden und von der Ethikkommission der Universität Mailand durchgeführt genehmigt. 1. Isolierung von Primär Osteoblasten Die Methode, mit geringfügigen Änderung, nach dem von Dodig et al 14 beschrieben ist. <ol><li> Vorbereitung Digestionsmittel, durch Zugabe von 0,1% Collagenase P und 0,05% Trypsin (ab 2,5% Trypsin 10X, ohne Phenolrot) mit HBSS-Medium (Hanks Balanced Salt Solution, ohne Calcium, Magnesium oder Phenolrot). </li><li> Verwenden Sie 3-4 Tage alten Mäusen (das Verfahren kann so wenig wie 1-Maus angewendet werden.) </li><li> Sacrifice durch Enthauptung. Sprühen Sie den Kopf mit 70% Ethanol und auf Eis zu halten. Entfernen Sie Haut-und Muskelschichten durch Pinzette und Seziersaal / chirurgische Schere. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Scheitelbeine undtrennen Sie diese, indem Sie die Pfeilnaht in zwei Hälften. Stellen Sie sicher, Knochen sind frei von Nähten und anhaftendem Gewebe und legen einzelnen Knochenstücke in gut-Platten mit HBSS Medium, bis das Verfahren abgeschlossen ist. </li><li> Entsorgen HBSS und fügen Sie in jede Vertiefung der Digestionsmittel für 15 min bei 37 ° C </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> Fügen Sie die Verdauung wieder Medium für 15 min bei 37 ° C </li><li> Diese Zeit zu sparen den Überstand und legen Sie sie in alpha-MEM (Minimum Essential Medium) mit 10% FBS (Fetal Bovine Serum) und 1% Streptomycin / Penicillin. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.7 und 1.8 2x. </li><li> Pool der drei Fraktionen gesammelt, Spin-Zellen durch Zentrifugation bei 425 g für 5 min den Überstand verwerfen, 3 ml ergänzten alpha-MEM, um das Zellpellet resuspendieren und in ein 25 cm 2-Kolben. </li><li> Ändern Sie das Medium nach 24 Stunden, um Schmutz und abgestorbene Zellen zu entfernen. </li><li> Dann werden 50 &amp;mgr; g / ml Ascorbinsäure (AA) und 3 mM GlyCEROL 2-phosphat Dinatriumsalz-Hydrat (GP) an die alpha-MEM-Medium. </li><li> Danach ändern Sie die Medium (MEM alpha-Plus AA / GP) jeden zweiten Tag. </li></ol> 2. ATRA-Protokoll <ol><li> Führen Sie alle Experimente mit ATRA (All-Trans-Retinsäure) in einem abgedunkelten Raum, um die Inaktivierung zu verhindern. </li><li> Bereiten Sie eine 1X Trypsin-Lösung in HBSS Medium und halten bei 37 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus subkonfluente Zellen und waschen Sie sie sorgfältig mit HBSS. </li><li> 1 ml Trypsin, sanft drehen Sie den Kolben, damit alle Zellen durch Trypsin abgedeckt werden, und Inkubation für 3 min bei 37 ° C </li><li> Überprüfen Sie für die eigentliche Ablösung von Zellen unter einem inversen Mikroskop. </li><li> 3 ml alpha-MEM-Medium, um Trypsin zu inaktivieren. </li><li> Recover die Zellen und Zentrifugieren für 15 min bei 425 g. </li><li> Zellpellet in frischem Medium. </li><li> Geben Sie einen Tropfen in einer Zählkammer Zählkammer, zu ermöglichen, für ein paar Minuten absetzen und zählen die cell Nummer. </li><li> Ort Zellen in 25 cm 2-Kolben in einer Dichte von 10.000 Zellen / cm 2 mit Alpha-MEM sowie AA / GP. Seien Sie sich bewusst, dass die Zelldichte, die für die optimale Entwicklung von Zellprozessen und interzellulären Kontakten. Ein Ausgangsdichte von mehr als 10.000 Zellen / cm 2 beeinträchtigt die richtige Entwicklung von Zellprozessen, aber niedrigere Zellzahlen führen zu vorzeitigem Zelltod aufgrund der Abwesenheit von interzellulären Kontakten. </li><li> In 5 uM ATRA auf das Medium alle 24 Stunden. </li><li> Überwachen Sie die Zellen täglich Morphologie beurteilen: morphologische Veränderungen werden in der Regel nach 48 Stunden beobachtet. Wenn nach der ersten 24-48 Stunden werden die Zellen noch proliferierenden, Ausstrich auf die oben Dichte. Eine homogene Population von reifen Knochenzellen vorhanden ist, nach 4-5 Tagen. Abhängig von den Anforderungen, zu verwenden Zellen zu jedem Zeitpunkt, bis zu 12-15 Tagen. </li><li> Wenn Zellen auf anderen Trägern (wie Deckgläser oder Well-Platten) plattiert, sicher sein, dass die oben Dichte beibehalten wird undATRA weiterhin alle 24 Stunden bis zur Verwendung hinzufügen. Zellen lassen sich an die neue Träger für mindestens 24 h vor dem Experiment zu haften. </li></ol> 3. Immunfärbung <ol><li> Für Immunfärbung Platte die Zellen auf Deckgläsern und folgen etablierten Methoden (siehe zB Burry 15). </li><li> Zum Beispiel kann für die indirekte Immunfluoreszenz, fix in 4% Paraformaldehyd oder kaltem Aceton inkubiert sequentiell mit dem primären Antikörper bei RT für 1 Stunde in einer feuchten Kammer, dann mit der fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper im Dunkeln bei RT für 30 min, in einer befeuchteten Kammer. </li><li> Verwenden DAPI oder Analoga für die Kerngegenfärbung, und montieren in der Anti-Fading-Medium. </li></ol> 4. Alizarinrot Färbung und Extraktion <ol><li> Platte die Zellen auf Deckgläsern. </li><li> Fixieren die Zellen durch Eintauchen des Deck in 70% Ethanol für 10 min. </li><li> Decken Sie die Zellen mit einigen Tropfen Alizarin-Rot-Färbung-Lösung (1 mg / ml, pH 5,5)für 30 min. </li><li> Mit Leitungswasser waschen Sie die Deckgläser. Montieren Sie mit einem Tropfen Glycerin auf Glasobjektträger und nehmen Sie Bilder mit einem aufrechten Mikroskop bei 10X und 20X Vergrößerung. </li><li> Nach dem obigen Verfahren erholen die Deckgläser durch Eintauchen der Objektträger in Leitungswasser. </li><li> Setzen jedes Deckglas in einem Well-Platte. </li><li> In 60% Perchlorsäure (die Menge hat, genug, um die Zellen vollständig bedeckt sein) und lassen O / N bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Messen der optischen Dichte des Überstands durch Spektrophotometrie bei 450 nm Wellenlänge. </li><li> Um Werte für die Zellzahl zu normalisieren, fügen Janus Green (0,2% ige Lösung in PBS), um die Zellpräparation für 10 Minuten abdecken. </li><li> Sorgfältig mit hochreinem Wasser waschen. </li><li> In 0,5 N HCl (die Menge hat, genug, um alle Zellen zu decken) und schütteln mit der Hand ein paar Sekunden. </li><li> Die Absorption bei 615 nm spektralphotometrisch. </li></ol>

<ol><li>Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+quantitative+3D+imaging+of+the+osteocyte+lacuno-canalicular+network%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network.</a> Bone. 47 (5), 848-858 (2010).</li>
<li>Cheng, F., Hulley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteocyte--a+novel+endocrine+regulator+of+body+phosphate+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Maturitas%22%5BJournal%5D)">The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis.</a> Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).</li>
<li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> 45 (4), 682-692 (2009).</li>
<li>Dallas, S. L., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+transition+from+osteoblast+to+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte.</a> Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).</li>
<li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of osteocytes.</a> J Bone Miner Res. 7 (4), 389-396 (1992).</li>
<li>Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+isolation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Osteocyte isolation and culture.</a> Methods Mol Med. 80, 41-50 (2003).</li>
<li>Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., Jähn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+osteocytes+from+the+long+bones+of+skeletally+mature+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice.</a> Biotechniques. 52 (6), 361-373 Forthcoming.</li>
<li>Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte.</a> Bone. 54 (2), 296-206 Forthcoming.</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+an+osteocyte-like+cell+line%2C+MLO-Y4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Metab%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4.</a> J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).</li>
<li>Mattinzoli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+of+in+vitro+osteocytogenesis+induced+by+retinoic+acid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment.</a> Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).</li>
<li>Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoids+in+embryonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Retinoids in embryonal development.</a> Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).</li>
<li>Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+all-trans+retinoic+acid+in+neurite+outgrowth+and+axonal+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation.</a> J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).</li>
<li>Vaughan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATRA+induces+podocyte+differentiation+and+alters+nephrin+and+podocin+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo.</a> Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).</li>
<li>Dodig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+TAAT-containing+motif+required+for+high+level+expression+of+the+COL1A1+promoter+in+differentiated+osteoblasts+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice.</a> J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).</li>
<li>Burry, R. W. Immunocytochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurry%2C+RW+%22A+practical+guide+for+biomedical+research%22">A practical guide for biomedical research</a>. , Springer. New York Dordrecht Heidelberg London. (2010).</li>
<li>Woo, S. M., Rosse, rJ., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Gu, G., Nars, M., Hentune, nT. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).</li>
<li>Boukhechba, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+osteocyte+differentiation+in+a+3D+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system.</a> J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).</li>
<li>Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenesis+in+vitro%3A+from+pre-osteoblasts+to+osteocytes%3A+a+contribution+from+the+Osteobiology+Research+Group%2C+The+Pennsylvania+State+University%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 Forthcoming.</li>
<li>Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+mineralization+as+a+trigger+for+osteocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation.</a> J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 Forthcoming.</li>
<li>Hirao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+is+an+important+mediator+of+the+transformation+of+osteoblasts+to+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes.</a> J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).</li>
<li>Brounais, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+oncostatin+M+treatment+induces+an+osteocyte-like+differentiation+on+osteosarcoma+and+calvaria%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria.</a> Bone. 44 (5), 830-839 (2009).</li>
<li>Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+an+osteocyte-like+phenotype+by+fibroblast+growth+factor-2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2.</a> Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).</li>
<li>Poole, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sclerostin+is+a+delayed+secreted+product+of+osteocytes+that+inhibits+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation.</a> FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).</li>
<li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Osteocyte%3A+An+Endocrine+Cell+and+More%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">The Osteocyte: An Endocrine Cell and More.</a> Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In den letzten Jahren hat sich die Osteozyten als die zentrale Zelle im Knochen entstanden. Fortschritte in der Forschung schrittweise enthüllt eine Reihe von bisher unbekannten oder unbewiesen osteocyte Eigenschaften, die für die Gestaltung von neuen und besseren Behandlung für eine Vielzahl von Knochenerkrankungen von enormem Wert sind. Allerdings hat die Untersuchung von osteocyte Biologie an der begrenzten Verfügbarkeit von in-vitro-Modelle leidet so sehr, dass Osteoblasten haben als Ersatzzellen über einen...

Osteozyten, die häufigste Knochenzelltyp sind terminal differenzierte, hochverzweigten Zellen tief in das Skelett entfernt. Der Zellkörper der reifen Knochenzellen werden im Knochen Lücken enthalten und haben unterschiedliche Formen; Osteozyten mit länglichen Zellkörper sind in den kortikalen Knochen gefunden, während abgerundete Osteozyten sind häufiger in der trabekulären Knochen ein. Verzweigte Dendriten erstrecken sich vom Zellkörper und befinden sich in winzigen Kanälen Kanälchen genannt, bilden ein komplexes Netz, das mehrere Kontakte nicht nur mit anderen Osteozyten, sondern auch mit anderen Knochenzelltypen, Knochenmark, Blutgefäße und damit verbundene Perizyten macht. Durch die Lücken und Kanälchen in der interstitiellen Flüssigkeit enthalten, sind Osteozyten letztlich auch dem Umlaufsystem verbunden, deshalb sind sie nicht nur lokale, sondern auch systemische Ereignisse, und umgekehrt, ihr Verhalten kann sowohl von lokalen und systemischen Veränderungen 2 geregelt werden, beeinflussen können. DieStudium der Osteozyten hat vor kurzem an Dynamik gewonnen, dank einiger technischer Verbesserungen, wie die Erzeugung von Gewebe-und zellspezifische transgene Tiere, die Verwendung von leistungsstarken Mikroskopie-Techniken und der Hochdurchsatz-Screening Molekular 3,4. Allerdings ist die Kenntnis dieser Zellen noch unvollständig, vor allem aufgrund der relativen Knappheit von angemessenen in vitro-Modellen. Eigentlich habe Osteozyten immer schwierig, wegen der tiefen Lage zu erhalten und zu pflegen in der Kultur, und das niedrige Niveau der Verbreitung, die eine solche differenzierte Zelltyp charakterisiert. Entlang der Jahre eine Reihe von Methoden entwickelt worden, um primäre Knochenzellen 5-7 isolieren, obwohl sie produzieren in der Regel niedriger Zellausbeuten und tragen das Risiko, dass sogar ein paar verunreinigen Fibroblasten schnell überwuchern die Osteozyten 8. Aus diesem Grund sind die meisten experimentellen in vitro Arbeit wurde bisher auf die etablierten osteocyte Zelle l durchgeführtine MLO-Y4 9. Weitere In-vitro-Methoden könnte die Möglichkeit der Untersuchung dieser Zellen zu erhöhen und könnte die Analyse der osteocyte Biologie und Pathophysiologie verbessern. Um weitgehend angenommen werden, sollten diese Methoden einfach zu reproduzieren, und würde nicht verlangen, spezielle Instrumente oder sehr lange Zeiten Zellreifung zu erreichen. Wichtig ist, wenn für Primärzellen, würden sie machen es möglich, die Vorteile von transgenen Tieren zu nehmen. Wir haben kürzlich beschrieben, dass die Behandlung der Osteoblasten-Zelllinie MC3T3-E1 und der primären Osteoblasten mit Retinsäure induziert eine rasche Änderung Phänotyp führt zu der Entwicklung einer homogenen Population von Zellen, die verzweigte morphologische und molekulare Merkmale von Osteozyten 10. All-trans-Retinsäure (ATRA) ein aktives Stoffwechselprodukt von Vitamin A, die Gen-Transkription reguliert durch Bindung der Kern Retinsäure-Rezeptoren (RARs). RARan DNA binden als Heterodimere mit dem Retinoid-X-Rezeptoren (RXRs), letztlich auf die Modulation von Retinsäure (RA) ansprechenden Zielgene 11 führt. ATRA ist gezeigt worden, die Differenzierung und Reifung von mehreren Zelltypen zu modulieren, darunter andere verzweigte Zellen, wie Nervenzellen 12 und 13 podocytes. Das hier beschriebene Verfahren wird nach Zugabe von ATRA an primären Osteoblasten basiert. Um wirksam zu sein, muss ATRA an einer präzisen Reifestufe auf Zellen in einem definierten Dichte ausplattiert hinzugefügt werden; Nach unserer Erfahrung diese Bedingungen sind für den Phänotyp Schalter von Osteoblasten Osteozyten erhalten.

<table><tbody><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche Applied Science</td><td>11213857001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14175129</td><td>Vorwärmen bei 37 &Grad; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>22571038</td><td>Vorwärmen bei 37 °; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin/Penicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin 2-phosphat Dinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>ATRA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>ATRA vor Licht schützen</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td> Vor <td>Gebrauch in PBS auflösen und filtrieren. Arbeiten Sie immer unter einer chemischen Haube.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32670</td><td>Kann dem Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Alizarinrot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Janusgrün</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201677</td><td></td></tr><tr><td>Perchlorsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td> zugesetzt werden <td>176745</td> Mit <td>Vorsicht anwenden (Haut- und Augenschutz wird empfohlen)</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Mit Vorsicht verwenden (Haut- und Augenschutz werden empfohlen)</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsave</td><td>Calbiochem - Merck</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Economy Pinzette #7, 0,40 x 0,5 mm Spitzen</td><td>World Precision Instruments</td><td>501981</td><td></td></tr><tr><td>Economy Pinzette #4, 0,40 x 0,45 mm Spitzen</td><td>World Precision Instruments</td><td>501978</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere, gerade, 10 cm gebogen</td><td>World Precision Instruments</td><td>14394</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere, 14 cm, gerade, S/S</td><td>World Precision Instruments</td><td>501218</td><td></td></tr><tr><td>Kulturflaschen</td><td>Corning</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3335</td><td></td></tr><tr><td>Thermanox Deckgläser</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>12-565-27</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss Apotome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrometer</td><td>Safas Xenius</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

anwendung von retinsäure zu osteozyten kulturen aus primären maus-osteoblasten erhalten

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

<html> Die Notwendigkeit für osteocyte Kulturen ist gut für die Gemeinschaft der Knochenforscher bekannt; Isolierung von primären Knochenzellen ist schwierig und produziert niedrigen Zellzahlen. Daher ist die am meisten verwendete Zellsystem die Osteozyten-ähnliche MLO-Y4-Zelllinie. Das hier beschriebene Verfahren bezieht sich auf die Verwendung von Retinsäure, um eine homogene Population von Zellen, die mit verzweigten morphologischen und molekularen osteocyte Eigenschaften zu erzeugen. Nach Isolierung von Maus-Calvaria Osteoblasten, ist all-trans-Retinsäure (ATRA) zur Zellmedium zugegeben und Zellenüberwachung wird täglich unter einem Umkehrmikroskop durchgeführt. Erste morphologische Veränderungen nach 2 Tagen der Behandlung und Differenzierung nachweisbar ist im allgemeinen innerhalb von 5 Tagen vollständig, mit fortschreitenden Entwicklung von Dendriten, Verlust der Fähigkeit, die extrazelluläre Matrix zu erzeugen, die Herunterregulierung der Osteoblastenmarkern und Hochregulierung von Osteozyten-spezifischen Molekülen. Inhalt &quot;&gt; Tägliche Zellenüberwachung ist wegen der inhärenten Variabilität der Primärzellen benötigt werden, und das Protokoll kann mit minimaler Variation, um Zellen von verschiedenen Mausstämmen erhalten und transgene Modelle angewendet angepasst werden. Das Verfahren ist einfach durchzuführen und erfordert keine spezielle Instrumentierung erforderlich, es in hohem Maße reproduzierbar ist, und erzeugt schnell eine ausgereifte Osteozyten Bevölkerung in vollständiger Abwesenheit von extrazellulären Matrix, was die Verwendung dieser Zellen für unbegrenzte biologische Anwendungen.

Ergebnisse wurden zwischen 5 und 10 unabhängigen Experimenten erhalten. Zellmorphologie AA / GP behandelt Primärzellen haben meist Kopfsteinpflaster-ähnliche Funktionen, die charakteristisch für reife Osteoblasten. Dazwischen verzweigten Zellen (wie durch die roten Pfeile in 1A angegeben) gefunden werden kann, die wahrscheinlich einige Osteozyten stellen. Mit ATRA-Behandlung, Zellen beginnen rasch Anzeige Verzweigungen, die...

Die Behandlung der primären Maus Osteoblasten mit Retinsäure erzeugt eine homogene Population von verzweigten Zellen, die morphologischen und molekularen Merkmalen des Osteozyten. Das Verfahren überwindet die Schwierigkeiten bei der Erlangung und Aufrechterhaltung der primären Knochenzellen in Kultur, und kann vorteilhaft sein, Zellen aus transgenen Modellen abgeleitet studieren.

Anwendung von Retinsäure zu Osteozyten Kulturen aus primären Maus-Osteoblasten erhalten

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, reife verzweigte Osteozyten aus primären Osteoblasten zu gewinnen. Dies wird zunächst erreicht, indem primäre Osteoblasten aus den Knochen neugeborener Mäuse isoliert und kultiviert werden, um die Reifung der Osteoblasten zu ermöglichen. Anschließend werden konfluente Osteoblasten tryps. Anschließend wurden sie gezählt und bei definierter Dichte erneut ausplattiert, um den Erfolg sicherzustellen. Danach wird all-trans-Retinsäure oder ATRA dem Zellmedium zugesetzt, um die Zellproliferation zu verringern und eine vollständige Differenzierung hin zur Osteozyten-Morphologie zu induzieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zellen in Gegenwart von ATRA rasch eine verzweigte Morphologie annehmen, die Produktion der extrazellulären Matrix einstellen und sich zu einem reifen Osteozyten-Phänotyp differenzieren, wie durch die Expression von Osteozyten-Markern belegt wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Isolierung primärer Osteozyten oder der Differenzierung von Osteoblasten in einer dreidimensionalen Matrix, liegt darin, dass sie innerhalb weniger Tage ausreichende Zellzahlen an Osteozyten erzeugt.Die Abwesenheit umgebender Metriken erleichtert die Verwendung dieser Zellen in N-Zellbiologie- und Molekularbiologie-Assays. Darüber hinaus kann die Methode auf transgene Mäuse angewendet werden, was funktionelle Untersuchungen an Molekülen des Interesses ermöglicht. Die Durchführung der Prozedur wird Deborah, eine Doktorandin aus meinem Labor, demonstrieren.Zur Vorbereitung bereiten Sie das Verdauungsmedium vor, indem Sie 0,1 % Collagenase P und 0,05 % Tryin zu Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) hinzufügen. Nachdem Sie drei- bis vier Tage alte Mäuse getötet und deren Köpfe abgetrennt haben, besprühen Sie den Kopf mit 70 % Ethanol und legen ihn auf Eis. Anschließend entfernen Sie mit Pinzette und Präparierschere die Haut- und Muskelschichten.Entfernen Sie vorsichtig die Parietalknochen und trennen Sie sie entlang der Sagittalsymphese in zwei Hälften. Nach dem Entfernen sämtlicher Nähte und anhaftenden Gewebe legen Sie die einzelnen Knochenstücke in HBSS-Medium. Danach entsorgen Sie das HBSS und geben das Verdauungsmedium zu jedem Stück hinzu.Anschließend 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach dem Verwerfen des Überstandes frisches Verdauungsmedium hinzufügen und die Inkubation wiederholen. Nach der zweiten Inkubation den Überstand sammeln und mit Alpha-Mam ergänzt durch FBS sowie Pen/Strep kombinieren.Wiederholen Sie die Verdauung noch zweimal. Vereinigen Sie das Überstand mit dem Medium und zentrifugieren Sie die vereinigten Fraktionen bei 425 G für fünf Minuten, entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in supplementiertem Alpha-MEM, bevor Sie die Zellsuspension in einen 25 Quadratzentimeter-Flaschenkolben überführen. Nach einer Inkubation bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden entfernen Sie Ablagerungen und tote Zellen.Gegeben Sie dann Alpha-MEM zu, gefolgt von 50 Mikrogramm pro Milliliter Ascorbinsäure oder AA und drei Millimolar Glycerol-2-phosphat, Dinatriumsalz, Hydrat, oder GP, bevor die Kultur in den Inkubator zurückgebracht wird. Nachdem das Medium von subkonfluenten Zellen entfernt und die Zellen mit HBSS gewaschen wurden, geben Sie frisch zubereiteten Trypsin zu und inkubieren für drei Minuten. Bei 37 Grad Celsius, sobald die Zellen sich gelöst haben, geben Sie drei Milliliter Alpha-MEM-Medium zu, um den Trypsin zu inaktivieren.Die Zellen gewinnen und 15 Minuten bei 425 G zentrifugieren, bevor die Zellpellets in frischem Medium resuspendiert werden. Einen Tropfen der Suspension in ein Hämozytometer geben. Einige Minuten ruhen lassen und die Zellen mit Alpha Men Plus A A GP zählen. Die Zellen in 25 cm²-Flaschen mit einer Dichte von 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter überführen. Eine höhere Zelldichte beeinträchtigt die ordnungsgemäße Entwicklung der Zellfortsätze, während zu geringe Zellzahlen zum Zelltod aufgrund fehlender interzellulärer Kontakte führen können. Während der Inkubation ATRA alle 24 Stunden in einer Konzentration von fünf Mikromolar dem Medium hinzufügen.Morphologische Veränderungen werden im Allgemeinen nach 48 Stunden beobachtet. Nach vier bis fünf Tagen sollte eine homogene Population reifer Osteozyten vorliegen. Die Zellen können wie hier gezeigt bis zu 12 bis 15 Tage lang verwendet werden.GP-behandelte Primärzellen weisen überwiegend kieselsteinartige Merkmale auf. Zwischen diesen sind Merkmale reifer Osteoblasten erkennbar. Verzweigte Zellen, die durch rote Pfeile markiert sind, stellen vermutlich einige Osteozyten dar.Nach zwei Tagen der ATRA-Behandlung beginnen die Zellen rasch, Fortsätze auszubilden, wie in dieser Abbildung zu sehen ist. Verzweigte Zellen benötigen Platz, um ihre Dendriten auszustrecken, und im Verlauf der Behandlung mit ARA nehmen Anzahl und Komplexität der Fortsätze kontinuierlich zu. Die Färbung von filamentösem Aktin mittels rho-Domäne-markiertem Phalloidin hebt die zellulären Fortsätze hervor.Primäre Osteoblasten produzieren große Mengen an kalzifizierter Matrix, die sich über und zwischen den Zellen anreichert und mittels Alizarinrot-Färbung sichtbar gemacht werden kann. Im Gegensatz dazu produzieren Osteozyten keine kalzifizierte extrazelluläre Matrix, und die Alizarinrot-Färbung ist in mit ATRA inkubierten Zellen vollständig negativ. Entsprechend können nach dem Extraktionsverfahren keine oder nur minimale Mengen an Alizarinrot nachgewiesen werden.Wie hier gezeigt, zeigt die Immunfärbung für Sklerostin einen intensiven zytoplasmatischen Ausdruck und das Vorhandensein positiver Punkte entlang der Zellfortsätze. Zusätzlich ist FGF 23 in ATRA-behandelten Zellen sowohl im Zellkörper als auch entlang der Zellfortsätze stark nachweisbar.Während dieser Prozedur ist es wichtig zu beachten, dass Sie mit Primärzellen arbeiten, daher müssen Anpassungen der Aro-Konzentration und ein Zellwechsel vorgenommen werden. Falls die Proliferation nach einer Passage weiterhin erhöht bleibt, müssen besondere Maßnahmen in Betracht gezogen werden, insbesondere bei der Arbeit mit transgenen Tieren. Denken Sie daran, dass die Zellmorphologie entscheidend ist, um alle Schritte dieser Methode zu leiten.Überprüfen Sie die Zelle täglich unter dem umgekehrten Mikroskop.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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