Super-Resolution Imaging der zytokinetischen Z-Ring im Live-Bakterien mit Schnelle 3D-Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die dynamischen Veränderungen des Proteins FTSZ während der Zellteilung in Bakterien zu beobachten. Dies wird durch das Auftragen von Bazillus-Subtles-Zellen, die die FTS-besagte GFP-Fusion exprimieren, auf die Oberfläche eines kleinen Aros-Pads erreicht. Das Pad wird dann umgedreht und in eine Petrischale mit einem Glasdeckel überführt.

Der zweite Schritt besteht darin, Zeitrafferbilder der Bakterien während der Zellteilung mit Hilfe eines 3D-Strukturbeleuchtungsmikroskops oder eines 3D-SIM-Bildgebungssystems zu erfassen. Als nächstes wird die Qualität der Rohdaten bewertet und Bilder mit einer Abnahme der Intensität um mehr als 30 % aufgrund von Photobleaching verworfen. Der letzte Schritt besteht darin, die Veränderungen in der Proteinlokalisation während der Zellteilung quantitativ zu analysieren, indem die Fluoreszenzintensitätsverteilung des F-T-S-Z-G-F-P-Proteins über die Zeit gemessen wird.

Mit der letztlich schnellen 3D-SIM wird gezeigt, wie dynamisch die Dionproteine bei der Zellteilung in Bakterien sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der konfokalen Mikroskopie besteht darin, dass wir dreidimensionale Informationen über die Veränderungen erhalten, die bei der Zellteilung in lebenden Zellen auftreten. Obwohl diese Methode Einblicke in die bakterielle Zytokinese bietet, könnte sie auch auf andere Systeme angewendet werden, bei denen wir dynamische Proteinveränderungen untersuchen wollen, wie z. B. M-Säugetierzellen.

Die Idee dazu hatten wir erstmals, als wir sahen, dass herkömmliche 3D-Sim-Bilder von fixierten Bakterienzellen zeigten, dass das FDZ-Protein nicht homogen um den zed-Ring verteilt war. Wir wollten weiter untersuchen, ob diese Verteilung mit Veränderungen zusammenhängt, die während der Zed-Ringverengung auftraten. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, weil es nicht gelingt, den Brechungsindex ihres Öls mit ihrer Probe abzugleichen, was zu einer schlechten Bildqualität führt.

Um die feinsten Zellen des Bazillus für die Bildgebung vorzubereiten, züchten Sie die Zellen bis zur mittleren exponentiellen Phase, wie im Textprotokoll beschrieben. Befestigen Sie anschließend einen Kleberahmen an einem Standard-Glasobjektträger, indem Sie zuerst die dünne Polyesterfolie entfernen. Tragen Sie dann die freiliegende Klebefläche des Rahmens auf die Oberfläche des Objektträgers auf, um effektiv eine quadratische Vertiefung auf dem Objektträger zu erzeugen, und lassen Sie die dicke Polyesterplatte am Rahmen befestigt, um ein Verkleben des Deckglases in den nachfolgenden Schritten zu verhindern.

Als nächstes schmelzen Sie eine Aro-Lösung in der Mikrowelle, bis sie 67 Mikroliter des geschmolzenen Aros in den Kleberahmen pipettiert. Legen Sie sofort einen Deckglas auf die aros, um eine ebene Oberfläche zu schaffen, und lassen Sie sie fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Entfernen Sie den Deckglas für ein bis zwei Minuten, während die Probe entnommen wird.

Nach der Zentrifugation bei 8.000 U/min wird ein Aliquot von einem Milliliter der Probe für die Sekunden des Dekantierens des Überstands entnommen und das Pellet in 200 Mikrolitern frischem Medium resuspendiert. Nehmen Sie 2,5 Mikroliter der konzentrierten Probe und pipettieren Sie sie auf das vorbereitete aros Pad. Verteilen Sie die Probe gleichmäßig auf der ebenen Oberfläche des aros Pads.

Entfernen Sie dann den Kleberahmen mit einer Pinzette vom Objektträger, ohne das aros pad zu berühren. Übertragen Sie das aros pad vom Mikroskop. Schieben Sie es in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 35 Millimetern und einer Glasabdeckung.

Für hochauflösende Bildgebung. Drehen Sie das Aros-Pad so um, dass die Zellsuspension mit dem Deckglas der Petrischale in Kontakt kommt. Schalten Sie am Tag des Experiments das OMX 3D-SIM-Bildgebungssystem mindestens eine Stunde vor der Bildgebung ein, damit sich das System und die Laser vollständig stabilisieren können.

Schalten Sie dann die verschiedenen Komponenten ein, die im Textprotokoll auf der Master-Controller-Workstation aufgeführt sind. Öffnen Sie die OMX-Software, indem Sie auf das Symbol klicken. Legen Sie den Dateipfad für die Datenspeicherung in einen entsprechenden Datenordner fest.

Starten Sie als Nächstes die Softwork-Software. Schalten Sie die für die Experimente erforderlichen Laser auf dem Hauptbildschirm im Bereich Lichtparameter ein. Aktivieren Sie die FITC-Kamera über die Kanalauswahl und fahren Sie mit der Überprüfung der Parameter fort, die im Textprotokoll aufgeführt sind.

Tragen Sie einen Tropfen Öl auf die Oberseite des Objektivs auf. Stellen Sie die Proben-Petrischale mit den vorbereiteten Zellen in den Tischeinsatz und decken Sie sie mit dem runden Heizdeckel ab. Senken Sie den Tisch ab, bis das Öl den Boden der Petrischale der Probe berührt.

Lassen Sie die Schale 15 Minuten lang im Gleichgewicht erhitzen Konzentrieren Sie sich in der Stufe mit niedriger Belichtungseinstellung mit den Reglern des Nano-Positionierungstisches auf die Probe. Fokussieren Sie die Probe nach oben und unten, um festzustellen, ob das Licht gleichmäßig über und unter der Fokusebene der Probe verteilt wird. Verwenden Sie dann Schrittweiten von 0,5 Mikrometern und markieren Sie den oberen und unteren Rand des Bildstapels, bevor Sie zur Mitte der Probe zurückkehren. Klicken Sie auf der Registerkarte "Experiment" auf die Schaltfläche "Dicke abrufen", um die Dicke der Probenaufnahme festzulegen.

Bestimmen Sie den maximalen Intensitätswert des Beispielbildes mit den Einstellungen für die aktuelle Belichtung und den Prozentsatz des durchgelassenen Lichts. Dieser Wert befindet sich unterhalb des Bildfensters. Passen Sie für Zeitrafferaufnahmen die Belichtung und den Prozentsatz des übertragenen Lichts an, um eine maximale Intensität von 1100 bis 1400 zu erhalten.

Über dem Hintergrund. Aktivieren Sie für das Bild den Zeitraffer-Bereich auf der Registerkarte Experiment. Legen Sie die erforderliche Bildrate und die Gesamtzeit in der Datendatei fest.

Geben Sie einen geeigneten Dateinamen ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Bildaufnahme am Anfang der Bildaufnahme zu starten. Notieren Sie sich den maximalen Intensitätswert des Bildes zu Beginn der Bildaufnahme für das erste Bild der Zeitreihe.

Überprüfen Sie am Ende der Erfassung des ersten Frames, ob die Signalintensität durch den Zack für diesen ersten Frame um nicht mehr als 10 % abgenommen hat. Öffnen Sie am Ende der Erfassung der Zeitreihe die resultierende Rohbilddatei mit einem DV-Suffix und ermitteln Sie die Abnahme der maximalen Signalintensität vom Beginn der Zeitreihe bis zum endgültigen Bild. Verwerfen Sie alle Zeitpunkte, zu denen mehr als 30 % Photobleiche aufgetreten sind, aus dem Prozessmenü und aktivieren Sie das SI-Rekonstruktionsfenster.

Verwenden Sie die bereits vorhandenen Einstellungen für alle Parameter. Aktivieren Sie die verwendete kanalspezifische OTF-Taste und stellen Sie sie auf das Standard-Filterset ein. Aktivieren Sie die Schaltfläche für die verwendeten kanalspezifischen KO-Winkel und stellen Sie auf das Standard-Filterset ein.

Ziehen Sie die Rohdatei per Drag & Drop in den Eingabedateibereich. Klicken Sie auf Ausführen. Untersuchen Sie die Verteilung von FTSZ um den Z-Ring, um 3D-Intensitätsdiagramme zu erstellen.

Öffnen Sie dann eine 3D-Bilddatei. So zeigen Sie die einzelnen Z-Ausschnitte an. Verwenden Sie das Lautstärkeanzeige-Tool, das sich auf der Registerkarte "Ansichtsmenü" befindet.

Um einen Bereich von Interesse zu beschneiden, geben Sie die Fensternummer für dieses 3D-Bild in das Eingabefenster ein und geben Sie eine neue und unbenutzte Fensternummer in das Ausgabefenster ein. Die Schaltfläche "Region auswählen" wird verfügbar, um einen einzelnen Z-Ring von Interesse aus dem ursprünglichen Sichtfeld von 40 x 40 Mikrometern zuzuschneiden. Passen Sie die gewünschte Achse und den Grad der Drehung auf der Registerkarte Drehung an.

Klicken Sie auf die Schaltfläche "Do it". Scrollen Sie durch das Volumen, um die gewünschte Perspektive, den Z-Ring, zu erhalten. Verwenden Sie das Dateninspektor-Tool, um die Abmessungen der Spaltenzeilen anzupassen und einen neuen Interessenbereich um einen einzelnen Z-Ring zu erstellen.

Klicken Sie auf die Mitte des Bildes, um diesen neuen Interessenbereich zu positionieren. Bei den Textbilddaten handelt es sich um eine automatisch generierte Tabelle, in der die Fluoreszenzintensität jedes Pixels innerhalb des interessierenden Bereichs angezeigt wird. Klicken Sie auf die Schaltfläche 3D-Diagramm, um das Intensitätsdiagramm zunächst anzuzeigen.

Alternativ können die Textbilddaten exportiert werden, indem Sie auf die Schaltfläche Tabellendaten speichern klicken. Kopieren Sie im Dateimenü die Bilddaten aus der gespeicherten Textdatei in eine neue Tabelle. Wählen Sie alle Zellen in der Tabelle aus, und erstellen Sie ein neues 3D-Oberflächendiagramm

Formatieren Sie das 3D-Intensitätsdiagramm für die Veröffentlichung von Zeitrafferdaten. Wiederholen Sie diese Schritte für jeden der verschiedenen Zeitpunkte aus der 3D-Bilddatei. Bei der Darstellung durch konventionelle Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie erscheint der Z-Ring als ein einzelnes transversales Fluoreszenzband in Bacillus subtles.

Die Fluoreszenzintensität in diesem Band ist gleichmäßig. Das Lokalisationsmuster bietet wenig Einblick in die strukturelle Organisation und Verteilung von FTS-Polymeren, wobei hier die gleichen Zellen untersucht werden. Mit der FAST 3D-Sim-Methode.

Die Drehung des 3D-Simulationsbildes um die Z-Achse ermöglicht die Visualisierung des Z-Rings als echte Ringstruktur im dreidimensionalen Raum. Die Verbesserung der Auflösung ermöglicht die Visualisierung der heterogenen Verteilung von FTSZ innerhalb des Rings. Weitere Beispiele von Bacillus Z-Ringen, die mit dieser Technik sichtbar gemacht wurden, verdeutlichen, dass die Fluoreszenzintensität um den Z-Ring herum nie gleich ist.

Darüber hinaus werden Bereiche mit sehr geringer Fluoreszenzintensität oder Lücken beobachtet. Um diese Beobachtungen zu quantifizieren, wurden 3D-Intensitätsdiagramme des Z-Rings erstellt. Die Intensitätsdiagramme zeigen, dass die Menge der Fluoreszenz in verschiedenen Regionen des subtilsten Z-Rings des Bazillus bis zu vierfach variieren kann.

Die 3D-Intensitätsdiagramme zeigen, dass die Lücken fast die Basiswerte der Hintergrundfluoreszenz anzeigen, um die dynamischen Änderungen zu analysieren, die innerhalb des Z-Rings auftreten. Im Laufe der Zeit wird ein 3D-Sim-Zeitraffer durchgeführt. Dieser Film zeigt, wie sich die FTSZ innerhalb des feinstofflichen Z-Rings des Bazillus ständig verändert und mit einem Intensitätsdiagramm gemessen wird, das für jedes Bild generiert wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Bakterienzellen züchtet und vorbereitet, wie man sie mit 3D Sim abbildet, wie man sie analysiert, um quantitative Daten zu erhalten, und schließlich, wie man Bilder in Präsentationsqualität bereitstellt. Es ist sehr wichtig, während der Bildaufnahme die Gesundheit Ihrer Zellen zu überwachen und auch das Niveau der Expression des fluoreszierenden Proteins während der Aufnahme nach seiner Entwicklung zu überwachen. Diese Technik ebnete anderen Personen auf dem Gebiet der bakteriellen Zellbiologie den Weg, andere Methoden der hochauflösenden Mikroskopie zu verwenden und andere bakterielle Proteine in verschiedenen Organismen zu lokalisieren.

Nach diesem Verfahren könnten andere Formen der hochauflösenden Mikroskopie durchgeführt werden, wie z. B. die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie, um einen Blick auf dynamische Veränderungen im FDS-Protein im Laufe der Zeit zu werfen.