Mess Spinal Präsynaptische Hemmung bei Mäusen durch Spinalgan Mögliche Aufnahme

Die präsynaptische Hemmung ist einer der stärksten hemmenden Mechanismen im Rückenmark. Pathologische Veränderungen der präsynaptischen Hemmung spielen eine wichtige Rolle bei mehreren Krankheitsmechanismen. Zum Beispiel bei neuropathischen und entzündlichen Schmerzzuständen sowie bei einer abnormalen zentralen Schmerzverarbeitung.

Die präsynaptische Hemmung ist bei Rückenmarkverletzungen und bei Erkrankungen des zentralen Nervensystems mit motorischer Hypererregbarkeit von Bedeutung. Daher liefert die Kenntnis der Stärke der präsynaptischen Hemmung wichtige Informationen, wenn tierische Modelle für diese Erkrankungen untersucht werden. Hier stellen wir eine Methode vor, mit der die präsynaptische Hemmung in einem Mausmodell beurteilt werden kann.

Die präsynaptische Hemmung in vivo wird durch eine Depolarisation der primären Afferenzen vermittelt, die durch GABAerge axo-axonalen Synapsen auf sensorische präsynaptische Fasern hervorgerufen wird. Die Aktivität des GABAA-Rezeptors führt zu einer Erhöhung der Chlorid-Leitfähigkeit, wodurch aufgrund der lokalen Ionenverteilung eine primäre Afferenzen-Depolarisation ausgelöst wird. Diese Depolarisation blockiert die Weiterleitung von Aktionspotentialen in die Axonendigungen und verringert deren Amplitude, was zu einem verminderten Kalziumeinstrom und einer Reduktion der Transmitterfreisetzung führt.

Die erregenden postsynaptischen Potentiale in Mono-, synaptisch exzi, modernen Neuronen können gehemmt werden, ohne das postsynaptische Membranpotential und die Erregbarkeit der modernen Neuronen zu verändern. Das volumenkonduzierte Potential dieser primären ENT-Depolarisation liefert eine direkte Messung der präsynaptischen Hemmung im Rückenmark, und diese Potentiale können nach Stimulation am Rückenmark und an den dorsalen Wurzeln gemessen werden. Sie werden als dorsale Wurzelpotentiale bezeichnet. Die Messung dorsaler Wurzelpotentiale ist gut etabliert und wurde umfassend bei Katzen, Ratten und Fröschen angewandt. Bei Mäusen wurden die Ableitungen jedoch nahezu ausschließlich an ex vivo isolierten Rückenmarkpräparaten durchgeführt. Hier beschreiben wir eine Methode, um diese Wurzelpotentiale bei anästhesierten Mäusen in vivo zu registrieren, was eine direkte Messung der präsynaptischen Hemmung im intakten Organismus ermöglicht.

Für die DRP-Aufzeichnung bei Mäusen in vivo werden folgende Geräte benötigt: Standard-Zuckerinstrumente, ein Stereomikroskop, drei manuelle Mikromanipulatoren zur Positionierung der Stimulations-, Aufzeichnungs- und Referenzelektrode sowie ein Maus-Halterungsrahmen und ein Heizsystem zur Kontrolle der Körpertemperatur der Maus während der Stimulation und Aufzeichnung oder des Stimulators.

Ein Standardverstärker und eine Datensammlung ist erforderlich, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Während der Aufnahme der DRP werden speziell angefertigte Abschnittselektroden für deren Herstellung benötigt. Ziehen Sie herkömmliches Glasrohr mit einem Standard-Mikropipettenzieher.

Zerbrechen Sie die Spitze der Elektrode mit einer Diamantfeile, um die Öffnung der Spitze zu vergrößern. Glätten Sie die Spitze mit einem handelsüblichen Laborbrenner, um die Spitze zu polieren. Vor Beginn der Vorbereitung betäuben Sie das Tier durch eine intraperitoneale Injektion von Ketamin und fixieren den Kopf der Maus im stereotaktischen Rahmen.

Überprüfen Sie dann die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die hintere Extremität der Maus einklemmen. Beginnen Sie die Vorbereitung erst, wenn keine Rückzugsreaktion der Extremität sichtbar ist. Die Tiefe der Anästhesie sollte während des gesamten Eingriffs wiederholt überprüft werden. Wiederholte Injektionen von Ketamin erfolgen im hinteren Oberschenkelmuskel.

Verlängern Sie die Anästhesie und überwachen Sie die Körpertemperatur des Tieres mit dem Rektalsonde. Zur Präparation der Dorsalsäule. Öffnen Sie die Haut entlang der dorsalen Mittellinie.

Lösen Sie die Haut vom darunterliegenden Gewebe, um die Wirbel vom umgebenden Bindegewebe zu trennen. Führen Sie zwei Schnitte auf beiden Seiten der Wirbelsäule durch und verbreitern Sie diese, indem Sie das Gewebe mit dem Skalpell auseinanderdrücken. Entfernen Sie anschließend die Dornfortsätze der Lendenwirbel mithilfe eines kleinen Knochenhakens.

Ausgehend von den Lendenwirbeln. Fortfahren auf mittlerer Brustwirbelebene, um das Austrocknen dieser Operationswunde zu verhindern. Kleine Mullstücke um die Wunde herum platzieren und mit 0,9% Natriumchlorid befeuchten.

Begonnen wird dann mit der Vorbereitung des Rückenmarks, ausgehend von der Lendenregion. Drücken Sie die Spitze des Knochenmeißels vorsichtig in den Zwischenraum zwischen zwei benachbarten Wirbeln. Achten Sie besonders darauf, den auf das Rückenmark ausgeübten Druck so gering wie möglich zu halten.

Fahren Sie fort, die thorakalen Ebenen im Rückenmark mit künstlichem zerebrospinalen Liquor feucht zu halten. Wiederholen Sie dies schrittweise während aller nachfolgenden Schritte. Öffnen Sie das Durometer vorsichtig mit einer 30-Gauge-Nadel.

Danach lockern und trennen Sie zwei benachbarte ipsilaterale Wurzeln von der Wirbelsäule. Anschließend schneiden Sie die Wurzeln so distal wie möglich ab. Während des Eingriffs.

Vermeiden Sie übermäßiges Ziehen an den Wurzeln, da dies letztendlich eine erfolgreiche Ableitung von DRP beeinträchtigen wird. Nachdem die Referenzelektrode in der Nähe des Rückenmarks positioniert wurde, bewegen Sie die Spitze einer Abschnittelektrode in unmittelbare Nähe zum proximalen Ende einer dorsalen Wurzel. Positionieren Sie dann die dorsale Wurzel über die Öffnung der Saug­elektrode.

Anschließend saugen Sie die Rückenwurzel durch Anlegen eines kurzen Unterdrucks über eine mit der Elektrode verbundene Spritze in die Elektrode ein. Danach füllen Sie die Elektrode mit ACSF, während Sie weiterhin einen schwachen kontinuierlichen Unterdruck anwenden, bis die Lösung sowohl die Hinterwurzel als auch den Silberchlorid-Draht innerhalb der Elektrode umgibt. Heben Sie anschließend die Spitze der Elektrode vom Rückenmark ab, damit keine Flüssigkeitsbrücke die Elektrode kurzschließt.

Wiederholen Sie die Schritte für die zweite ipsilateral benachbarte Wurzel. Sobald beide Elektroden positioniert sind, beginnen Sie die Aufzeichnung der DRP, indem Sie eine Bahn stimulieren und gleichzeitig von der anderen aufzeichnen. Erhöhen Sie die Stimulierungsspannung auf supramaximale Werte. Typische Aufzeichnungen dorsaler Wurzelpotentiale sehen wie diejenige im linken Panel dargestellt aus.

Ein kurzer Stimulationsartefakt wird gefolgt von einer kurzen positiven Abweichung und einer anhaltenden negativen Abweichung. Die letzte Abweichung stellt das eigentliche dorsale Wurzelpotential dar. Seine Amplitude kann in Bezug auf die Basislinie berechnet werden, die direkt vor der Aufzeichnung des Stimulus registriert wurde.

Mehrere Spuren aus einem Wurzelpaar können als Artefakte durch Atembewegungen und/oder EKG-Störungen die aufgezeichnete DRP beeinträchtigen. Nach einer erfolgreichen Aufzeichnung ist es möglich, die Stimulations- und Ableitstelle zu wechseln und eine zweite Aufzeichnung durchzuführen. Die dargestellte Methode der Aufzeichnung.

Die Aufzeichnung von Wurzelpotentialen in meinem In-vivo-Modell ermöglicht die Beurteilung primärer afferenter Aktivität, anti-physiologischer Polarisation sowie die Untersuchung des intakten Tieres, insbesondere in Kombination mit genetisch modifizierten Mäusen. Diese Methode kann ein leistungsfähiges Werkzeug zur Erforschung der Mechanismen hinter spinaler Hemmung darstellen. Eine spinale Integration ist entscheidend für die motorische Funktion und die multimodale sensorische Wahrnehmung.

Diese Methode ist nützlich für die Forschung zu Schmerz, Rückenmarkverletzung, peripherer Nervenverletzung und Entzündung. Die Aufzeichnung des DRP in vivo ermöglicht die Analyse der Wechselwirkungen zwischen supraspinaler Aktivität und dem pad. Dies ist bei isolierten Rückenmarkpräparationen, die üblicherweise zur Messung des DRP bei Mäusen verwendet werden, nicht möglich.

Im Prinzip ist eine Applikation von Wirkstoffen auf das Rückenmark während der Ableitung möglich. Eine lokale Applikation über zusätzliche Pipetten könnte die Kontrolle über die lokale Wirkstoffkonzentration verbessern und beschleunigen.