Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine vollständige Quersektion des Rückenmarks bei larvalen Zebrafischen mithilfe einer relativ hohen Durchsatzleistung und reproduzierbaren Methode sicherzustellen, wobei die Überlebensrate maximiert wird. Dies wird erreicht, indem zunächst erwachsene Tiere des geeigneten Genotyps verpaart und gegebenenfalls selektiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Embryonen bis fünf Tage nach der Befruchtung aufzuziehen.

Anschließend wird die Durchtrennung mit einer abgeschrägten Mikroinjektionspipette durchgeführt. Schließlich dürfen die verletzten Fische in antibiotikahaltigem Medium regenerieren, bis das Experiment beendet ist. Letztendlich wird mittels Immunfluoreszenzmikroskopie die Reaktion der neuronalen Vorläuferzellen auf die Verletzung dargestellt.

Die Hauptvorteile dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie jenen, die von den Laboren Becker und Fetcher entwickelt wurden, umfassen eine größere Anzahl von Versuchstieren, eine kürzere Erholungszeit sowie die Nutzung genetischer Werkzeuge, die im adulten Zebrafisch sonst nicht verfügbar sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Regeneration zu beantworten, beispielsweise die Reaktion neuronaler Vorläuferzellen auf Verletzungen. Beginnen Sie mit den Vorbereitungen, indem Sie Operationsplatten aus 60-Millimeter-Petri-Schalen und dem Kit für Zellkulturschutz 180 4 Silikonelastomer herstellen.

Gemäß den Herstelleranweisungen die Schalen füllen, maximal zur Hälfte, und polymerisieren lassen. Anschließend die Schalen abgedeckt bei Raumtemperatur lagern.

Als Nächstes stellen Sie Mikropipetten her, indem Sie dünne Borosilikat-Kapillarrohre in einer Mikropipettenzugvorrichtung erhitzen und ziehen, und verwenden dabei dieselben Einstellungen wie für die Herstellung von Mikroinjektionsnadeln unter einem Stereomikroskop. Brechen Sie mit einer Pinzette die Spitze der Mikropipette auf einen Durchmesser von etwa 200 Mikrometern ab. Danach schleifen Sie die gebrochene Kante zunächst mit einer Mikroschleifvorrichtung auf 35 Grad, gefolgt von einem zweiten Schleifvorgang auf 25 Grad, sobald das Schleifgeräusch verstummt.

Überprüfen Sie unter einem Stereomikroskop, ob die Spitze scharf und glatt ist. Eine zu breite Spitze führt häufiger zu höheren Sterblichkeitsraten, da die Wahrscheinlichkeit, die Aorta dorsalis zu verletzen, erhöht ist. Eine zu schmale Spitze hingegen neigt dazu, von der Haut abzugleiten, anstatt das Gewebe zu schneiden. Bewahren Sie die korrekt abgeschrägten Mikropipetten sieben Tage vor der Operation in einer Petrischale auf einer kleinen Menge Ton auf.

Richten Sie Paarungstanks mit männlichen und weiblichen spr-Fischen ein. Die Fische sammeln die befruchteten Embryonen am folgenden Morgen, drei Stunden nach dem Einschalten des Lichts. Um die maximale Ausbeute sicherzustellen.

Wenn eine transgene Reporterkonstruktion mit gemischten Genotypen verwendet wird, 100 Embryonen pro Platte geben und die Platten bei 28,5 Grad Celsius inkubieren. Wenn eine Reporterkonstruktion verwendet wird, die Embryonen nach fluoreszierender Expression 48 Stunden nach der Befruchtung screenen.

Lassen Sie die fluoreszierenden Embryonen bei 28,5 Grad Celsius bis zur Larvenentwicklung oder fünf Tage nach der Befruchtung reifen. Bereiten Sie die Operationsplatte vor, indem Sie die Zellabdeckung mit E2 und 10 Milligramm pro Liter Gentaminsulfat und Trica bedecken. Außerdem bereiten Sie eine Erholungsschale vor, indem Sie 25 Milliliter E2 und Gentaminsulfat einer 100 Millimeter großen Petrischale hinzufügen.

Der nächste Schritt besteht darin, einen Skalpellgriff vorzubereiten, indem drei Tupfer miteinander verklebt werden. Dadurch entsteht ein dreieckiges Werkzeug mit drei Rillen. Anschließend wird die vorbereitete Mikropipette auf den Tupfern befestigt, indem sie mit Klebeband in einer der Rillen befestigt wird, um den Skalpell zu vervollständigen. Legen Sie die Mikropipette beiseite, bis sie benötigt wird.

Beginnen Sie die Operation, indem Sie jeweils eine Platte mit 25 Larven anästhesieren. Mit Trica sind die Fische ausreichend anästhesiert, wenn sie nicht mehr auf Berührung reagieren. Überführen Sie die Larven in eine Operationsplatte und stellen Sie die Platte unter ein Stereomikroskop.

Unter maximaler Vergrößerung drehen Sie eine Larve so, dass sie auf der Seite liegt und ihr Rücken der Hand am nächsten ist, die das Skalpell hält. Positionieren Sie die Pinzette so, dass sie auf der Zellabdeckung aufliegt. Halten Sie das Glasskalpell im Winkel über die Breite der Larve hinweg und stützen Sie es gegen einen der Arme der Pinzette.

Schneiden Sie an der dorsolateralen Seite der Larven auf Höhe der Analöffnung. Achten Sie darauf, nicht über den ventralen Rand des Rückenmarks hinauszuschneiden. Drehen Sie dann das Skalpell, um das Rückenmark zu durchtrennen.

Die erforderliche Drehung beträgt gewöhnlich deutlich weniger als 90 Grad. Wiederholen Sie die Rückenmarksquerschneidung mit den verbleibenden Larven. Sobald die Operation an der Charge von Larven abgeschlossen ist, verwenden Sie eine hintere Pipette und eine Pipettenpumpe, um die verletzten Tiere in die Erholungsplatte zu überführen.

Um die Anästhesie abklingen zu lassen, sammeln Sie während des Transfers zuerst den Kopf oder Schwanz der Larve. Vermeiden Sie es, die Verletzungsstelle zu belasten, indem Sie die Larven verbiegen, nachdem die Anästhesie nachgelassen hat. Überführen Sie die verletzten Larven von der Erholungsplatte in 100 Millimeter-Platten, die mit 25 Milliliter E2 und Gentamycinsulfat mit einer Dichte von 25 Larven pro Platte gefüllt sind.

Dann legen Sie sie in einen Inkubator bei 28,5 Grad Celsius, während die Wunde verheilt. Überprüfen Sie die Platten täglich und entfernen Sie kranke oder tote Tiere.

Ändern Sie das Medium nicht, bis die Brutkästen der Süßwasserprotozoen im Medium sichtbar sind. Wenn das Medium gewechselt wird, überführen Sie die Fische nicht in eine neue Platte. Entfernen Sie stattdessen so viel Medium wie möglich und überspülen Sie dieselbe Platte mit frischem Medium.

Wiederholen Sie den Mediumwechsel nach Bedarf, um die Population der Coops zu reduzieren. Füttern Sie die Larven täglich mit einer kleinen Menge pulverförmigem Futter für Jungfische. Ein Zebrafisch mit vollständig durchtrenntem Rückenmark wird hier am ersten Tag gezeigt.

Nach der Verletzung wird GFP in allen Neuronen exprimiert, und der gelbe Pfeil markiert die Verletzungsstelle. Hier ist ein Zebrafisch mit vollständig durchtrenntem Rückenmark drei Tage nach der Verletzung dargestellt. Dieser fixierte, mit UCD markierte Zebrafisch zeigt ein vollständig durchtrenntes Rückenmark.

Der gelbe Pfeil kennzeichnet erneut die Verletzungsstelle. Im Gegensatz dazu befindet sich der zusammenhängende Bereich der Neuronenmarkierung entlang der ventralen Kante des Rückenmarks. Bei diesem drei Tage nach der Verletzung fixierten Zebrafisch zeigt sich ein inkompletter Querschnitt.

Nach Beherrschung der Technik können 300 Larven pro Stunde bearbeitet werden.