Name: Transiente Expression von Proteinen durch Hydrodynamische Gentransfer in Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Lernen Sie den hydrodynamischen Gentransfer in Mäusen für die transiente Genexpression mit minimaler Entzündungsreaktion. Diese Methode ermöglicht die effiziente Analyse von Genfunktion und Proteinstruktur in vivo.

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Wir danken Xia Liu (Neron Pharmaceuticals) für zunächst lehrt uns die HGD Technik und Dr. Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) für seine kontinuierliche Führung in verschiedenen Aspekten der Technologie. Diese Arbeit wurde vom Hunter College finanziert CUNY Startkapital und NSF Brot Auszeichnung IOS-1249166. Wir danken der NYULMC Histopathologie Kern NYUCI Center Support Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 für die Histologie auf Mäuselebern.

Alle hier beschriebenen Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Hunter College, City University of New York zugelassen. 1. Vorbereitung der Endotoxin-freiem Plasmid-DNA <ol><li> Wählen Sie eine einzelne Kolonie von Bakterien, die das Gen von Interesse in einer Säugetier-Expressionsvektor von einer frisch ausgestrichenen selektive Platte. </li><li> Folgen Sie den Empfehlungen im Handbuch eines handelsüblichen Endotoxin-freie Plasmid-Reinigungs-Kits für den Anbau und die Ernte Bakterien gefunden. </li><li> Reinige den Endotoxin-freie Plasmid-DNA aus Bakterienzellen durch nach dem Protokoll von einem kommerziell erhältlichen Endotoxin-freiem Plasmid-Reinigungskits. </li><li> Verwenden Endotoxin-freiem Kunststoff-ware und Griff-DNA mit darauf, dass Endotoxin wird nicht in der DNA-Probe nach dem Entfernen Schritt wieder eingeführt. </li><li> Messung der Konzentration von Endotoxin-freiem Plasmid-DNA durch Bestimmung seiner Absorption bei 260 nm unter Verwendung eines MICRo-Volumen UV-Spektrophotometer wie unten beschrieben, oder ein Standard-Küvetten-basierte Spektralphotometer. <ol><li> Reinigen der unteren und oberen optischen Oberflächen der Mikro Spektrophotometer Probenhaltesystem wie folgt. Je 1 ul sauber VE-Wasser auf die untere optischen Systems. Schließen Sie den Hebelarm und tippen Sie es ein paar Mal, um die obere optische System zu baden, dann den Hebel zum Öffnen und wischen Sie mit einem Gewebe. </li><li> Öffnen Sie die Software von der Mikro-Spektralphotometer und wählen Sie die Nukleinsäuren-Modul. </li><li> Platz 1 ul sauber VE-Wasser auf der unteren optischen System, senken Sie den Hebelarm und wählen Sie &quot;initialisieren&quot; aus dem Programm-Software. Sobald die Initialisierung abgeschlossen ist, reinigen Sie beide optischen Flächen mit einem Tuch .. </li><li> Führen Sie Blindmessung durch Laden von 1 ul der Endotoxin-freiem TE-Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA) und wählen Sie &quot;blank&quot; aus dem Programm-Software. Sobald Leermessung durchgeführt wird, sauber sowohl optischen Oberflächen mit einemGewebe. </li><li> Führen Probenmessung durch Laden 1 Mikroliter Endotoxin-freie DNA-Probe und wählen Sie &quot;Maßnahme&quot; aus der Programm-Software. Notieren Sie sich die DNA-Konzentration. Bewerten DNA Reinheit durch die Aufnahme der Absorptionsverhältnis 260/280 nm, die auf dem Bildschirm erscheint. Da die Verwendung von reiner DNA (260/280 Verhältnis von 1,8) für HGD ist sehr wünschenswert, zu vermeiden, mit einer DNA-Probe mit einem Verhältnis von 260/280 unter 1,7. Nach Messung durchgeführt wird, reinigen Sie beide optischen Flächen mit einem Tuch. </li></ol></li></ol> 2. Wiegen der Mäuse <ol><li> Mark Mäuse in einer angemessenen Art und Weise für den Stamm. Hinweis: Kennzeichnung der Schwanz wird für dieses Verfahren nicht empfohlen. <ol><li> Mark Mausarten, die weißes Fell (z. B. Swiss Webster) auf dem Rücken mit einem schwarzen Marker zu haben. Wenden Marken im Laufe der Zeit wie nötig. </li><li> Mark Mausarten, die schwarzes Fell (zB C57BL / 6) mit dem Ohr haben Stanzen mehrere Tage im Voraus. </li></ol></li><li> Wiegen Mäuse individually vorsichtig, indem sie in einem Tier Waagschale oder Eimer auf einem digitalen Laborwaage gelegt. Das Gewicht jeder Maus in dem Experiment verwendet, am Tag des Experiments. </li></ol> 3. Vorbereitung von Spritzen <ol><li> Herstellung der Injektionsmischung <ol><li> Berechnen der Menge an DNA unter der Annahme, 5 erforderlich - 50 ug Endotoxin-freie Plasmid-DNA für die Injektion von jeder Maus. <ol><li> Bestimmung der optimalen Menge an Plasmid-DNA experimentell. </li><li> Bei der Bestimmung der Menge an DNA benötigt wird, übernehmen Injektion einer zusätzlichen Maus pro Gruppe, wie eine ordnungsgemäße Ladung der Spritzen einige zusätzliche Injektion Mix erforderlich. Um Berechnungen zu helfen, sollten Sie das folgende Beispiel: injizieren 4 Versuchs und 4 Kontroll-Mäusen, einem Gewicht von jeweils 25 g, mit 50 ug Plasmid-DNA pro Maus. Um die Menge an DNA in diesem Fall notwendig zu bestimmen, berechnet mit 5 Mäusen pro Gruppe: 5 x 50 = 250 &amp;mgr; g pro &amp;mgr; g DNA Gruppe benötigt. </li></ol></li><li> Bestimmung der Menge an Salzlösung (0,9% Natriumchlorid) unter der Annahme von 10% des Körpergewichts für die Injektion von jeder Maus erforderlich. <ol><li> Gemäß dem obigen Beispiel injizieren je 25 g Maus mit 50 ug Plasmid-DNA in 2,5 ml Kochsalzlösung (2,5 g Flüssigkeit). </li><li> Bei der Bestimmung der Menge an Kochsalzlösung für eine ganze Gruppe von Mäusen erforderlich, übernehmen Injektion einer zusätzlichen Maus pro Gruppe, um eine ordnungsgemäße Beladung der Spritzen zu ermöglichen. Berücksichtigung des Experiments gegeben, die Berechnung der Menge an Kochsalzlösung für 5 Mäuse in jeder Gruppe benötigt: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml Kochsalzlösung für jede Gruppe (oder 25 ml insgesamt). Hinweis: Wenn Mäusen innerhalb der gleichen Gruppe sind nicht das gleiche Gewicht (mehr als 10% Unterschied im Körpergewicht), bereiten Injektion vermischt sich getrennt. </li></ol></li><li> Verwenden Konservierungsmittel-und Endotoxin-frei, steriler Kochsalzlösung, die für den menschlichen Gebrauch zugelassen wurde, in 10 ml, Mehrfachnutzung Fläschchen. </li><li> Verwendung einer 20-Gauge-Nadel (0,9 mm x 25 mm) mit einem Luer-Lock-Spitze einer 20 ml-Spritze angebracht ist,ziehen Sie die Flüssigkeit aus Salzfläschchen und leeren die Spritzen in einen 50 ml konischen Röhrchen. Um genaue Pipettieren von Salz während der Herstellung der DNA-Kochsalzinjektion Mischungen helfen, sammeln mehr als Salzlösung für die Injektion von allen Mäusen in dem Experiment benötigt. Für das Experiment oben zurückzuziehen Kochsalzlösung aus 3, 10 ml Vials (insgesamt etwa 30 ml), selbst wenn die berechnete Menge von Kochsalzlösung für das Experiment erforderlich ist, ist nur 25 ml. </li><li> Pipettieren die berechnete Menge an DNA in einen anderen 50 ml konischen Röhrchen. Achten Sie darauf, nicht auf die Seite der Röhre mit der Pipette Körper zu berühren, um die Einführung von Endotoxin zu vermeiden. Gemäß dem Beispiel, pipettieren 250 ug und 250 ug Steuer experimenteller Plasmid-DNA in separaten konischen Röhrchen. </li><li> Die erforderliche Menge an Salzlösung mit der DNA unter Verwendung einer serologischen Pipette. In Anbetracht der Proben Experiment Pipette 12,5 ml Kochsalzlösung zu jeder der Master-Mixe (Versuchs-und Kontroll). </li><li> Lassen Sie alle Lösungen zu erreichen,Raumtemperatur vor der Injektion. </li></ol></li><li> Vorbereitung von Spritzen <ol><li> Für jede Maus Füllen eines sterilen 3 ml, Luer-Lock-Spritze mit der DNA-Kochsalzmischung mit einer sterilen 20-Gauge-Nadel (0,9 mm x 25 mm). Achten Sie darauf, um Luftblasen zu vermeiden. Vermeiden, mit höheren Volumen Spritzen als die Strömungsgeschwindigkeit der Injektion kann nicht sehr gut gesteuert werden und es schwierig ist, größere Spritzen in einer Hand manipulieren. Werfen Sie überschüssiges DNA-Salzmischung zurück in den konischen Rohr dies auch sein mag wieder verwendet werden. </li><li> Wechseln Sie die Nadel in einem sterilen, 27-Gauge-Nadel. Füllen Sie die Nadel mit der Flüssigkeit vollständig, ohne dabei Luftblasen. Stellen Sie die Lautstärke der DNA-Kochsalzmischung als bezogen auf das Gewicht der Maus berechnet. </li><li> Lassen Sie das nicht begrenzten Nadel nicht mit einer nicht-sterilen Oberfläche berühren. Falls erforderlich, können Nadeln wieder verschlossen mit der Ein-Hand-Technik werden: Legen Sie den Deckel auf eine ebene Fläche, die Nadel legen, ohne das Festhalten an der Kappe mit der anderen Hand und drücken Sie die bedeckten Nadelgegen einen festen Gegenstand, den Deckel auf die Nadel zu sichern. Die Spritzen sind nun bereit für Schwanzvene Injektionen. </li></ol></li></ol> 4. Hydrodynamische DNA-Abgabe <ol><li> Beachten Sie, dass Anästhesie Mäuse können Lebensfähigkeit zu reduzieren. Vermeiden Sie es, HGD in einem Raum, der zu kalt ist, da dies auch zu einer Verminderung Lebensfähigkeit. Wenn der Raum hat eine Umgebungstemperatur von 20 ° C oder bei Verwendung von Anästhesie, legen die Mäuse auf einem Heizkissen bei 37 ° C nach dem Eingriff festgelegt, um den Verlust von Tieren zu vermeiden. Bei der Verwendung von Anästhesie, sicherzustellen, dass der Mund und Zunge des Maus frei sind, während auf dem Heizkissen und beobachten Sie die Maus, bis es vollständig erholt. Keine Lebensmittel oder Wasser zurückzuhalten, nicht von den Mäusen vor der HGD. </li><li> Wärmen Sie die Maus, um die Blutgefäße erweitern. <ol><li> Platzieren Sie die Maus Käfig (mit Einstreu) auf einem Heizkissen für 5 Minuten, so dass die Temperatur der Betten beträgt ca. 38-39 ° C. Die Temperatur sollte niedrig genug, um die Mäuse auf dem Heizkissen für eine haltenZeitraum verlängert. </li><li> Alternativ legen Sie mit der Maus in einen dorsalen Zugang Rainer mit minimaler Zurückhaltung. Wärmen Sie den Schwanz der Maus für 1 min durch leichtes Halten Sie es mit einem Stück Gaze in warmem Wasser benetzt. Ermöglichen Maus neu zu positionieren, wenn nötig. Wischen Sie den Schwanz mit einem Tuch zu trocknen. </li><li> Alternativ warme Maus, indem der Käfig unter einer Wärmelampe für nicht mehr als 2 min. Bei Verwendung einer Wärmelampe, Vorsicht walten lassen, um eine Überhitzung der Maus zu vermeiden. </li></ol></li><li> Large-Volume-Injektion in die Schwanzvene <ol><li> Immobilisieren einen dorsalen Zugang Rainer auf einer ebenen Fläche durch Labor Band. </li><li> Halten am Schwanz, die Maus sanft in den Restrainer und den Stecker. Verwenden Sie so wenig Zurückhaltung wie nötig, um den Schwanz zu halten immobilisiert. Stellen Sie sicher, dass die Maus frei zu atmen. </li><li> Wenn die Maus ist in schwere Bedrängnis zu jedem Zeitpunkt während des Verfahrens, entfernen Sie die Maus aus dem Restrainer sofort und lassen Sie es ruhen. </li><li> Bewegen Sie die Maus soeiner der lateralen Schwanzvenen sichtbar ist. Suchen Sie die seitlichen Schwanzvenen suchen Sie gerade nach unten an der Rückseite der Maus: Die rote Linie in der Mitte des Schwanzes läuft eine Arterie, während die blauen Linien auf beiden Seiten der Schwanz sind die seitlichen Schwanzvenen. </li><li> Wischen Sie den Schwanz der Maus gründlich mit einem Alkoholtupfer. </li><li> Verwendung der Nicht-Einspritz Hand den Schwanz fest zwischen Zeigefinger und Mittelfinger, so dass der Schwanz tritt unter dem Zeigefinger über den mittleren und dritten Finger und unter dem kleinen Finger. Lassen Sie den Daumen frei beweglich zu bleiben. (1A) </li><li> Mit der anderen Hand, wischen Sie die Fläche wieder mit einem Alkoholtupfer eingespritzt werden. Ermöglichen Bereich zu trocknen. </li><li> Nehmen Sie den geladenen Spritze mit der Injektions Hand und halten Sie sie durch den Lauf zwischen Daumen und den anderen vier Ziffern. Nicht auf die Kolben nicht festhalten. </li><li> Positionieren der Spritze parallel zum Heck mit der Nadel in Richtung des Körpers der Maus unddie Schräge (schräge Kante) der Nadel nach oben zeigt. </li><li> Führen Sie die Nadel in die Schwanzvene. Weiter mit der Injektion, wenn die Vene vollständig entfernt, was sich von der Nadel Einschieben ohne Widerstand. Beachten Sie, dass die Tiefe der Nadelung ist eine Frage des persönlichen Geschmacks jedoch das vollständige Einführen aufgrund eines erhöhten Risikos für das Scheren der Vene empfohlen. Vermeiden Bewegen der Nadel. </li><li> Mit dem Daumen der Schwanz an der Hand, und schließen Sie auf der Nabe der Nadel und drücken Nabe gegen den Schwanz, um die Nadel in Position zu halten. Extremen Druck nicht und sind nicht auf Nadelschaft zu halten, da diese die Strömung der Flüssigkeit in die Vene behindern. Halten Sie den Schwanz mit dem Zeigefinger locker an dieser Stelle, um nicht zu behindern Injektion (Abbildung 1A). </li><li> Re-Positionierung des Spritzenhalte Hand, so dass der Zeigefinger und Mittelfinger sind auf den Flansch Halten und der Daumen auf das Ende des Kolbens (FigurE 1A). </li><li> Drücken Sie auf Kolben in einem, kontinuierliche Bewegung und injizieren das volle Volumen der Flüssigkeit in 6-8 sek. </li><li> Entfernen Sie die Nadel aus der Vene und die Blutung zu stoppen durch leichten Druck auf den Schwanz mit einem Gewebe. </li><li> Entfernen Sie mit der Maus aus dem Restrainer und Ort der Maus in eine Erholungskäfig auf einem Heizkissen platziert (Bettwäsche sollte 37-38 ° C sein). Wenn der Injektionsraum kalt ist, ist dieser Schritt nicht entscheidend für das Überleben der Mäuse. Halten Sie auf den Schwanz der Maus, bis Blutung stoppt vollständig. </li><li> Beachten Sie die Maus für 1 h folgende hydrodynamischen DNA Lieferung. Eine erste Frist von Keuchen und Unbeweglichkeit ist normal aufgrund der temporären Herzrhythmusstörungen verursacht durch HGD aber stellen Sie sicher, dass die Maus zeigt Anzeichen der Erholung in ca. 5 min. Wenn das Atmen der Maus wird überaus flach, sanft massieren den Bauch der Maus, um die Atmung zu erleichtern. Beachten Sie, dass Verwertungsquote kann etwas von der Mausstamm verwendet, beeinflusst werden. </li><li> Zurück Mausbis Gehäusekäfig und sicherzustellen, dass Maus hat ein reichhaltiges Angebot an Essen und Wasser. </li></ol></li><li> Großvolumige Schwanzveneninjektion mit einer alternativen Handposition <ol><li> Zeigen Maus in den Restrainer und die Vorbereitungen für Einspritzung durch folgende Schritte 4.3.1 bis 4.3.5, wie zuvor beschrieben. </li><li> Legen Sie das nicht injizierenden Hand auf einer ebenen Fläche mit vier Fingern an einer Neunzig-Grad-Winkel gebogen. Die Finger (alle außer Daumen) sollte auf der jeweils anderen ruhen, die Schaffung einer Plattform. Halten Sie den Schwanz der Maus zwischen Daumen und Zeigefinger (Abbildung 1B). </li><li> Mit der anderen Hand, wischen Sie die Fläche wieder mit einem Alkoholtupfer eingespritzt werden. Ermöglichen Bereich zu trocknen. </li><li> Schnappen Spritze mit der Injektions-Hand und halten Sie es an dem Flansch und dem Ende des Kolbens, bereit zur Injektion. </li><li> Füllen Sie das folgende Verfahren durch dieses Protokoll von Schritt 4.3.9 bis 4.3.17 Schritt, wie zuvor beschrieben. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wenn richtig ausgeführt, ist HGD ein bemerkenswert sicheres und wirksames Mittel der Trans Lieferung. Die kritischen Schritte zur erfolgreichen HGD sind: 1) Bereitstellung der richtigen Menge von DNA in einem großen Volumen an Kochsalzträger 2) in die Schwanzvene der Maus, 3) in weniger als 8 Sekunden. Obwohl der Prozess der Injektion selbst erfordert zweifellos etwas Fingerfertigkeit, der Erfolg dieser sechs zweite Verfahren liegt oft in der sorgfältigen Vorbereitung des Experiments. Die Me...

Seit der ersten Beschreibung von Liu et al. Und Zhang et al., Hydrodynamische Gentransfer (HGD) hat sich ein unschätzbares Werkzeug für die Untersuchung der Genfunktion in Nagetier-Modellsysteme 1, 2. Die Technik beinhaltet die schnelle Injektion (5-7 sec) von einem großen Volumen (8-12% des Körpergewichts) der Lösung in die Schwanzvene von Mäusen, die Aufnahme von Plasmid-DNA durch die Zellen des Zielorganen 1, 2 zu erleichtern. Diese Bedingungen führen zu robusten Genexpression in der Leber und weniger Gen-Expression in der Niere, Milz, Lunge und Herz. Injektion von 10 ug pCMV-LacZ-Plasmid kann so viel wie 40% der Leberzellen zu transfizieren, so dass HGD die effizienteste, nicht-viralen, in vivo Genübertragung Verfahren Beginn 1. Anders als Virusträger, ist pDNA einfach zuzubereiten, ist eine Immunantwort in der Nagetier-Host 3 nicht zu entlocken ist und nicht ein Gesundheitsrisiko darstellen durch Rekombination mit Endeexogenen Viren. Zusätzlich kann, da die DNA-Moleküle durch HGD geliefert brauchen nicht Verpackung, eignet sich dieses Verfahren für die Bereitstellung von künstlichen Bakterienchromosomen (BAC) so groß wie 150 4 kb. Andere Arten von Molekülen, die durch ein hydrodynamisches Verfahren geliefert worden sind, umfassen RNA 5-10, 11 Morpholinos, Proteine ​​12, 13 und andere kleine Moleküle 12, 14. Die Vor-und Nachteile der HGD gegenüber anderen Versandmethoden sind in sehr guten Bewertungen in der Literatur 15-20 diskutiert und eine Reihe von Autoren haben eine detaillierte Beschreibung der Vorgehensweise 21 bis 23 vorgesehen. Einführen von Transgenen in Mäusen durch HGD ist sicher und wirksam 1-3, 24 und das Verfahren wurde bei Ratten mit vergleichbarem Erfolg 25 verwendet. Mit gewissen Modifikationen, Proof-of-Concept-Experimente wurden in 26 Hühner, Kaninchen durchgeführtBits 27 und 28 Schweine, obwohl die in vivo Anwendung dieser Technik bei größeren Tieren bleibt eine Herausforderung. Bei Verwendung dieses Verfahrens ist eine weitere gemeinsame Einschränkung, dass viele der verfügbaren Säugetierexpressionsvektoren nicht über die Komponenten, um eine anhaltende, hohe Genexpression zu erreichen. Mit einem pCMV-Luc-Plasmid, die Genexpression in den Zielorganen ist offensichtlich so früh wie zehn Minuten nach HGD fällt jedoch die anfängliche, hohe Expressionsniveau stark in der ersten Woche nach der Injektion ein. Langzeit-Expression des Transgens ist möglich, je nach dem Promotor und Intron in Plasmid-Design 3, 24 jedoch, Wartung von High-Level-Genexpression erfordert häufig wiederholte Injektionen verwendet. Aus diesem Grund könnte HGD weniger geeignet, um chronische Krankheiten, die eine Folge der langfristigen Exposition gegenüber schädlichen Proteine ​​oder Proteinprodukte sind zu studieren. Mit diesen Einschränkungen ist HGD ein außergewöhnlich leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der pozial Rolle des Gens und die Wirkung davon Mutanten in vivo, als auch die therapeutischen Wirkungen und Regulation von Proteinen und für die Festlegung von Tiermodellen der Erkrankung (für eine Übersicht siehe 15). Zum Beispiel kann verwendet werden, um Funktion HGD, Domains und Aminosäuren von Proteinen durch Einbringen individuell verschiedene Genkonstrukte in Mäusen, wurden die entsprechenden Gene ausgeknockt zuzuweisen. Darüber hinaus kann diese Technik in jedem Mausstamm verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt HGD bei Mäusen mit einem Fokus auf die technischen Aspekte notwendig, um eine erfolgreiche Transfektion zu erreichen: Die richtige Nadeleinführung in die Vene, Einspritzmenge und die Geschwindigkeit der Lieferung. Die Anwendung dieses Verfahrens ist in einem Mausmodell der afrikanischen Trypanosomiasis, einer tödlichen Erkrankung von Mensch und Vieh 29, 30 gezeigt. Während einige Arten der Trypanosomen verursachen Krankheit in Nutztiere, können die meisten nicht-Krankheit beim Menschen durch Immunkomplexe in b angeborenen verursachenlood genannt Trypanosomen lytische Faktoren (Tlfs) 29, 31, 32. Diese porenbildenden, hochdichten Lipoproteinen (HDL) enthält zwei einzigartige, Primaten-spezifischen Proteinen:. HPR, die Liganden, die die Aufnahme von Tlfs in Trypanosomen erleichtert und APOL-I, die lytische Komponente 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense der Lage ist, Menschen aufgrund der Expression eines mit Serumresistenz assoziierten Proteins (SRA), das bindet und neutralisiert menschliche APOL-I 34, 39 zu infizieren. Baboon TLF wird nicht von SRA aufgrund ihrer divergierenden APOL-I-Protein 40 neutralisiert. Wie bereits berichtet, mit einem Säugetier-Expressionsvektor (pRG977), transgenen Expression von Pavian TLF-Komponenten in Mäusen einen Schutz gegen die Menscheninfektiösen Trypanosomen 40. Die hier präsentierten Daten demonstrieren, wie repräsentativ hydrodynamischen Genübertragung angewendet werden, um die therapeutischen Wirkungen des Proteins zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Alkohol-Vorbereitungstuch</td><td>Webcol</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>AST-Kit, Amplite Kolorimetrisches</td><td>AAT Bioquest</td><td>13801</td><td></td></tr><tr><td>Konisches Röhrchen, 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>KIMTECH</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Mausschwanz-Illuminator</td><td>Braintree Scientific</td><td>MTI RST</td><td>oder gleichwertige</td></tr><tr><td>Nadel, 20 Gx 1 (0,9 mm x 25 mm)</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Nadel, 27 Gx 1/2 (0,9 mm x 25 mm)</td> <td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>pRG977 (Säugetier-Expressionsvektor)</td><td>Regeneron Pharmaceuticals</td><td></td><td>Materialübertragungsvereinbarung erforderlich</td></tr><tr><td>Natriumchlorid, 0,9 % INJ USP 10 ml, Hospira&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>NC9054335</td><td></td></tr><tr><td>Spritze, 3ml, Luer-Lok Spitze</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Luer-Lock notwendig, um dem Druck von HGD standzuhalten</td></tr></tbody></table>

transiente expression von proteinen durch hydrodynamische gentransfer in mäusen

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Effiziente Expression von Transgenen in vivo ist von entscheidender Bedeutung bei der Untersuchung der Genfunktion und der Entwicklung von Behandlungen für Krankheiten. In den letzten Jahren hat hydrodynamische Gentransfer (HGD) als eine einfache, schnelle, sichere und effektive Methode für die Bereitstellung von Transgenen in Nagetiere entstanden. Diese Technik beruht auf der von der schnellen Injektion einer großen Menge einer physiologischen Lösung, um die Durchlässigkeit der Zellmembranen des perfundierten Organen erhöhen erzeugte Kraft und liefern somit DNA in Zellen. Einer der Hauptvorteile der HGD ist die Fähigkeit, Transgene in Säugerzellen unter Verwendung nackter Plasmid-DNA (pDNA) einzuführen. Einführen eines exogenen Gens unter Verwendung eines Plasmids ist minimal aufwendig, sehr leistungsfähig und im Gegensatz zu viralen Träger, bemerkenswert sicher. HGD wurde ursprünglich verwendet, um Gene in Mäuse zu liefern, wird nun verwendet, um eine Vielzahl von Stoffen, einschließlich Oligonukleotide, künstliche Chromosomen, RNA, Proteine ​​und kleine Moleküle in Mäuse, Ratten liefernund bis zu einem begrenzten Grad, andere Tiere. Dieses Protokoll beschreibt HGD bei Mäusen und konzentriert sich auf drei zentrale Aspekte der Methode, die entscheidend für den erfolgreichen Durchführung des Verfahrens sind: richtige Einführen der Nadel in die Vene, das Injektionsvolumen und die Geschwindigkeit der Lieferung. Beispiele werden gegeben, um die Anwendung dieser Methode auf die transiente Expression von zwei Genen, die abgesondert wird, Primaten-spezifische Proteine ​​kodieren zeigen, Apolipoprotein LI (APOL-I) und Haptoglobin-related protein (HPR).

Korrekte Positionierung der Nadel in die Schwanzvene der Maus (wie in Fig. 1 dargestellt) ist eine Voraussetzung für eine erfolgreiche Abgabe eines Transgens durch die Hydrodynamik basierende Transfektion. Oft der schwierigste Teil der Technik ist jedoch die Beibehaltung der Nadel in die Schwanzvene ohne Bewegung, so daß das gesamte Volumen der Injektion innerhalb 6-8 s geliefert werden. Kleinere Fehler beim Einspritzvorgang kann in beträchtlichem Ausmaß verringert Transfektionseffizienz und Protein-Exp...

In-vivo-Transfektion von nackter DNA durch hydrodynamische Genübertragung führt Gene in das Gewebe eines Tieres mit minimalen Entzündungsreaktion. Ausreichende Mengen an Genprodukt erzeugt werden, so dass Genfunktionen und Regelung sowie die Proteinstruktur und Funktion untersucht werden.

Transiente Expression von Proteinen durch Hydrodynamische Gentransfer in Mäusen

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Gene mittels hydrodynamischer Gentransferlieferung oder HGD vorübergehend in Mäuse zu exprimieren. Die Mäuse werden gewogen, und ein geeignetes Volumen an Kochsalzlösung, das Plasmid-DNA enthält, wird vorbereitet und in eine Spritze gefüllt.Die Maus wird anschließend erwärmt, um die Blutgefäße im Schwanz zu weiten, und mit der dorsalen Arterie in einem Fixierungsgerät platziert. Als Referenz werden die seitlichen Schwanzvenen lokalisiert, und die DNA-Saline-Mischung wird in eine der Schwanzvenen injiziert. Schließlich wird die Maus aus dem Fixierungsgerät entfernt und zur Erholung auf eine Wärmematte gelegt.Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die Transgenexpressionen durch die Überwachung von Blutproteinspiegeln mittels Western Blot zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden, wie der viralen Transfektionsexpression, besteht darin, dass die hydrodynamische Gendosierung die Verwendung von nackter Plasmid-DNA ermöglicht, die einfach herzustellen, sicher in der Anwendung ist und weniger Größenbeschränkungen aufweist. Ich bin Daniela Kovacic.Ich bin Postdoktorand im Labor von Dr. Jane Raper und werde diese Methode demonstrieren. Beginnen Sie das Verfahren damit, die Rücken der weißen Mäuse mit einem Edding zu markieren, um ihre Versuchsgruppe anzugeben; erneuern Sie die Markierungen bei Bedarf im Laufe der Zeit. Am Tag des Experiments wiegen Sie jede einzelne Maus in einer Tierwaagschale oder einem Eimer, die bzw. der auf einer digitalen Laborwaage platziert ist.Notieren Sie das Gewicht jeder Maus gemäß den Anweisungen im beigefügten Dokument. Bereiten Sie ausreichend Injektionslösung für jede zu injizierende Maus vor, plus eine zusätzliche Menge, da das korrekte Befüllen der Spritzen etwas zusätzliche Injektionslösung erfordert. Verwenden Sie konservierungs- und endotoxinfreie sterile Kochsalzlösung, die für die Anwendung am Menschen zugelassen ist.Nachdem alle Lösungen Raumtemperatur erreicht haben, befestigen Sie eine sterile Kanüle mit 20 Gauge an einer Dreimilliliter-Spritze mit Luer-Lock-Verschluss und saugen Sie die DNA-Saline-Mischung x auf. Bereiten Sie pro Injektion eine Spritze vor. Achten Sie darauf, keine Luftblasen zu erzeugen.Verwenden Sie keine größeren Spritzen, da die Injektionsflüssigkeit mit Fluorid nicht gut kontrolliert werden kann und größere Spritzen mit einer Hand schwer zu handhaben sind. Wechseln Sie danach zu einer sterilen Nadel mit 27 Gauge. Stellen Sie das Volumen der DNA-Saline-Mischung gemäß der Berechnung ein. Überschüssige Lösung zurück in das kegelförmige Reagenzglas ausstoßen, um sie später erneut zu verwenden. Dadurch wird die Nadel gefüllt, ohne Luftblasen einzuführen.Lassen Sie die ungeschützte Nadel nicht mit keimfreien Oberflächen in Kontakt kommen, um die Nadel vor Injektionen zu schützen. Setzen Sie die Kappe mit einer Einhandtechnik wieder auf. Legen Sie die Kappe auf eine ebene Fläche und führen Sie die Nadel ein, ohne die Kappe mit der anderen Hand zu halten; drücken Sie die gekappte Nadel anschließend gegen einen festen Gegenstand.Um die Kappe zu sichern, bereiten Sie alle benötigten Spritzen auf dieselbe Weise vor. Führen Sie dies vor Beginn der Injektionen durch. Stellen Sie den Mäusekäfig mit der darin enthaltenen Einstreu für fünf Minuten auf eine Heizplatte, sodass die Temperatur der Einstreu etwa 38 bis 39 Grad Celsius beträgt.Dies führt zur Dilatation der Blutgefäße bei Mäusen. Beachten Sie, dass eine Anästhesie während des Aufwärmens der Mäuse für dieses Verfahren nicht empfohlen wird. Verwenden Sie Laborklebeband, um einen dorsalen Fixierhalter auf einer flachen Oberfläche zu befestigen. Nach fünf Minuten entfernen Sie die Kappe der Spritze, die für die erste Mausinjektion verwendet werden soll.Stellen Sie die Spritze auf die Kappe, um zu verhindern, dass die entkapselte Nadel mit unreinen Oberflächen in Kontakt kommt. Aus Gründen der Sicherheit und Sauberkeit. Halten Sie jeweils nur eine Nadel entkapselt.Heben Sie als Nächstes eine Maus am Schwanz auf. Setzen Sie sie vorsichtig in die Fixiervorrichtung und stecken Sie den Stopfen ein. Wenden Sie die geringstmögliche Fixierung an, um den Schwanz bewegungslos zu halten.Stellen Sie sicher, dass die Maus frei atmet. Suchen Sie danach die seitlichen Schwanzvenen, indem Sie senkrecht auf den Rücken der Maus blicken. Die rote Linie, die in der Mitte des Schwanzes verläuft, ist eine Arterie.Während die blauen Linien an beiden Seiten des Schwanzes die seitlichen Venen darstellen, positionieren Sie die Maus so, dass eine der seitlichen Venen sichtbar ist. Wischen Sie anschließend den Schwanz der Maus gründlich mit einem Alkohltupfer ab. Halten Sie mit der Hand, die nicht injiziert, den Schwanz fest zwischen Zeige- und Mittelfinger, sodass der Schwanz unter dem Zeigefinger, über dem Mittel- und Ringfinger und unter dem kleinen Finger verläuft.Lassen Sie den Daumen frei beweglich. Benutzen Sie mit der anderen Hand einen Alkoholtupfer, um die Injektionsstelle abzuwischen. Lassen Sie die Stelle erneut trocknen. Greifen Sie nun mit der injizierenden Hand die beladene Spritze und halten Sie sie am Zylinder zwischen Daumen und den anderen vier Fingern. Halten Sie nicht den Kolben fest. Positionieren Sie die Spritze parallel zum Schwanz, wobei die Nadel in Richtung des Körpers der Maus zeigt und die Schräge oder abgeschrägte Kante der Nadel nach oben weist.Führen Sie die Nadel in die Schwanzvene ein. Wenn die Vene korrekt lokalisiert wurde, gleitet die Nadel widerstandsfrei hinein. Halten Sie die Nadel dabei stabil und verwenden Sie den Daumen der Hand, die den Schwanz hält, um auf den Nadelaufsatz zu drücken und diesen gegen den Schwanz zu pressen, um die Nadel in Position zu fixieren. Üben Sie keinen starken Druck aus, und fassen Sie nicht den Nadelstift an, da dies den Fluss der Flüssigkeit in die Vene behindern würde.Als Nächstes positionieren Sie die Hand, die die Spritze hält, so um, dass Zeige- und Mittelfinger den Flansch umfassen und der Daumen am Ende des Kolbens liegt. Drücken Sie den Kolben in einer kontinuierlichen Bewegung herunter und injizieren Sie die gesamte Flüssigkeitsmenge innerhalb von sechs bis acht Sekunden. Ziehen Sie die Nadel aus der Vene und üben Sie mit einem Tuch sanften Druck auf den Schwanz aus, um eventuelle Blutungen zu stoppen.Hier wird der Injektionsvorgang in Echtzeit gezeigt. Beachten Sie, dass eine vollständige Einführung der Nadel nicht empfohlen wird, da dies das Risiko einer Abspaltung der Vene erhöht. Nach der Injektion entfernen Sie die Maus aus dem Fixiergerät und legen sie in einen Erholungskäfig, der auf einer Heizplatte steht. Falls der Injektionsraum kalt ist, ist dieser Schritt für das Überleben der Maus entscheidend.Halten Sie den Schwanz der Maus fest, bis die Blutung vollständig gestoppt hat. Beobachten Sie die Maus eine Stunde lang nach der hydrodynamischen DNA-Übertragung.Ein anfänglicher Zeitraum von Hecheln und Bewegungslosigkeit ist normal, aber stellen Sie sicher, dass die Maus Anzeichen der Erholung zeigt. Etwa fünf Minuten nach der Erholung der Maus sollte diese in den Aufzuchtkäfig zurückgebracht werden, wobei ausreichend Futter und Wasser bereitzustellen sind. Als Nächstes demonstrieren wir eine Schwanzinjektion unter Verwendung einer alternativen Handposition.Diese Methode ist besonders nützlich, wenn Mäuse näher an der Basis des Schwanzes injiziert werden müssen. Zum Beispiel bei der Korrektur einer fehlgeschlagenen Injektion am selben Tag oder bei der Injektion von Mäusen mit kürzeren Schwänzen. Bereiten Sie die Maus für die Injektion vor und positionieren Sie sie in einer Fixiervorrichtung. Wie zuvor legen Sie die nicht injizierende Hand auf eine ebene Fläche, wobei die vier Finger in einem 90-Grad-Winkel gebeugt sind; die Finger sollten übereinander liegen.Um eine Plattform zu schaffen, halten Sie den Schwanz der Maus zwischen Daumen und Zeigefinger. Wischen Sie mit der anderen Hand die zu injizierende Stelle mit einem Alkoholtupfer ab. Lassen Sie die Stelle trocknen.Greifen Sie die Injektionsspritze mit der injizierenden Hand und halten Sie sie am Flansch und am Ende des Kolbens fest, bereit zur Injektion. Positionieren Sie dann die Spritze parallel zum Schwanz, wobei die Nadel in Richtung des Körpers der Maus zeigt und die Schräge der Nadel nach oben weist. Führen Sie die Injektion wie zuvor durch, um zu überprüfen, ob das Hinzufügen eines Hiss-Tags an bestimmten Sequenzpositionen die korrekte Verarbeitung und Sekretion des Baboon-APO beeinträchtigt.L ein Protein Mäuse erhielten eine Injektion mit einem Plasmid, das eines von drei unterschiedlich hist-markierten baboon APO L ein -Genen trägt, sowie ein weiteres Plasmid, das baboon HPR trägt. Der Erfolg der Injektionen wurde durch eine Western-Blutanalyse der zirkulierenden HPR-Spiegel im Mausblut zwei Tage nach der Injektion bewertet. Wie hier gezeigt, wurde baboon HPR im Plasma aller bis auf eine der transfizierten Mäuse stark exprimiert, was darauf hinweist, dass die HGD erfolgreich war.Kleine Abnahmen der Expressionsniveaus, wie sie bei einem der beiden Mäuse in B APO L eins, seiner Gruppe eins, beobachtet wurden, sind im Allgemeinen auf eine sehr kurze Verringerung der Injektionsgeschwindigkeit um ein bis zwei Sekunden zurückzuführen. Hier zeigt die Plasmprobe in Lane eins einen vollständigen Ausfall der Proteinsynthese. Dies weist auf ein Versagen von HGD hin, vermutlich bedingt durch eine unvollständige Injektion des gesamten Volumens des Applikationsmittels. Um die Wirkung des His-Taggings auf die Sekretion von B APO L eins zu beurteilen, wurde die Expression des His-Tags ebenfalls evaluiert, wie hier dargestellt.Es zeigte sich eine vollständige Abwesenheit nachweisbaren his-markierten Proteins in den Gruppen eins und zwei. Die einzige Gruppe von Mäusen, die nachweisbare Mengen des Proteins in ihrem Plasma aufwies, war Gruppe drei. Insgesamt deutet diese Daten darauf hin, dass die Abwesenheit des his-markierten Proteins in den Gruppen eins und zwei auf Unterschieden in der Genexpression oder der Proteinverarbeitung beruht und nicht auf einem Versagen der Injektionen.Es unterstreicht außerdem die Bedeutung, ein Markereiweiß in die Injektionslösung einzuschließen, um den Erfolg der hydrodynamischen Genabgabe zu überwachen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Mäuse und die Spritzen vorbereitet und wie man die Nadel in die Schwanzvene einführt, um schnell temid-DNA zur Genexpression in Mäusen mittels hydrodynamischer Gendotierung zu verabreichen. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, die Nadel während der gesamten Injektion in der richtigen Position zu halten.Die korrekt eingeführte Nadel kann durch zufällige Bewegungen entweder der injizierenden Person oder der nicht anesthesierten Maus aus ihrer Position verrutschen, was die Erfolgschance verringert. Wir vermeiden Injektionen bei Mäusen, die ein Gewicht von über 27 Gramm haben, da das Handling einer Spritze, die mit drei ml befüllt wurde, schwieriger ist.Wir stellen fest, dass Mäuse mit einem Gewicht von 23 bis 27 Gramm am praktischsten zu injizieren sind. Die Venen von Mäusen mit einem Gewicht unter 20 Gramm können zu klein sein, um eine Injektion durchzuführen.

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Forschung

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