In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine optogenetische Stimulation des Zentralnervensystems von Nagetieren in vivo bei einem wachen, sich frei bewegenden Tier erfolgreich durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst das geeignete Lasersystem für die optogenetische Stimulation eingerichtet und konfiguriert wird. Als nächstes werden Faseroptiken eingerichtet, die mit Verhaltenstests kompatibel sind, um Laserlicht auf eine implantierte Faseroptik und in die Opsin-exprimierende Gehirnregion von Interesse abzugeben.

Dann wird das Tier zur optogenetischen Stimulation an das Lasersystem gebunden und in ein Verhaltenstestgerät gelegt. Schließlich wurden vom Experimentator definierte Parameter der Lichtstimulation zum Ein- oder Ausschalten von Neuronen abgegeben, während das Tier eine Verhaltensaufgabe ausführt. Letztendlich wird in vivo optogenetische Stimulation verwendet, um die Echtzeitkontrolle definierter Populationen von Neuronen oder neuronalen Schaltkreisen bei wachen, sich verhaltenden Tieren zu ermöglichen, um ihre funktionelle Rolle in einem bestimmten Verhalten von Interesse zu bestimmen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sie die Echtzeitkontrolle von genetisch und räumlich definierten Populationen von Neuronen in wachen, sich verhaltenden Tieren mit der zeitlichen Auflösung ermöglicht, die erforderlich ist, um neuronale Aktivitätsmuster mit komplexen Verhaltenszuständen zu verknüpfen. Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von Lasern der Klasse drei B und erfordert, dass angemessene Schulungen und Sicherheitsrichtlinien befolgt werden. Beim Betrieb von Lasern mit Ausrichtungsverfahren, die nach der Einrichtung des Lasergeräts gemäß dem Textprotokoll ein besonders hohes Risiko darstellen, muss jederzeit eine Schutzbrille getragen werden. Führen Sie die berührungslose Laserkopplung des inneren blauen Lasers durch, indem Sie zuerst die Schalter auf der Rückseite des Lasers auf cur für den Strom und TTL für den Transistor-Logikmodus für konstante Beleuchtung an der Vorderseite des Treibers stellen. Stellen Sie sicher, dass der Ein-/Aus-Knopf auf Null steht.

Schalten Sie dann den Laser ein, indem Sie zuerst den Treiber und dann den Laserschlüssel einschalten. Um die Sicherheit der Augen zu gewährleisten, stellen Sie den Ein-/Aus-Knopf langsam so ein, dass etwa ein Milliwatt Laserlicht abgestrahlt wird. Lassen Sie dann 10 bis 15 Minuten warten, bis sich der Laser aufgewärmt hat.

Schließen Sie als Nächstes den Glasfaserkabeltester direkt an das freie Ende des Koppler-Patchkabels an und schalten Sie den Kabeltester ein. Stellen Sie dann den Winkel des Kopplers so ein, dass der rote Strahl gerade zurück zur Mitte des dichroitischen Spiegels verläuft. Der Strahlengang des vom Kabeltester emittierten roten Lichts ist genau der Weg, dem das einfallende Laserlicht folgen muss, um in den Laser eingekoppelt zu werden.

Um eine Kursausrichtung durchzuführen, verwenden Sie die seitlichen und horizontalen Knöpfe an den kinematischen Spiegeln, um den Laserlichtstrahl in den Koppler zu lenken. Machen Sie sich keine Sorgen, wenn zu diesem Zeitpunkt kein blaues Licht aus dem an der Koppler befestigten Patchkabel ausgeht. Lege nun ein einzelnes Stück halbdurchscheinendes Papier direkt vor den dichroitischen Spiegel zwischen dichroitischem und koppler.

Auf der gleichen Seite dieses Papiers befindet sich sowohl ein blauer als auch ein roter Punkt, der vom Laser bzw. vom Kabeltester stammt. Nehmen Sie Feineinstellungen am ersten Lenkspiegel vor, indem Sie die seitlichen und horizontalen Knöpfe vorsichtig so einstellen, dass die Mitte des roten Punktes mit dem blauen Punkt ausgerichtet ist. Bewegen Sie das Papier zurück in Richtung des Kupplers, so dass es sich direkt davor befindet, und stellen Sie die Knöpfe am zweiten dichroitischen Spiegel ein, um den Laserstrahl mit dem roten Strahl auszurichten.

Nehmen Sie weitere Feineinstellungen an den beiden Spiegeln vor, bis die Mitte des blauen und des roten Balkens genau ausgerichtet ist. Coline, entfernen Sie den Kabeltester von der Kupplungsleitung. Laserlicht sollte nun vom Ende des Koppler-Patchkabels eingelassen werden.

Um die Kopplungseffizienz zu bestimmen, verwenden Sie einen Lichtleistungsmesser, um die Lichtleistung, die in den Koppler eintritt, mit der vom Faserende abgegebenen Lichtleistung zu vergleichen. Ein Kopplungswirkungsgrad von mehr als 80% wird bei Beibehaltung der Position des dichroitischen Spiegels als sehr gut angesehen. Verwenden Sie die beiden Lenkspiegel für den äußeren gelben Laser und befolgen Sie das gerade gezeigte Ausrichtungsverfahren zum Koppeln des gelben Lasers, um eine optische Faser für die Stimulation einer einzelnen Maus einzurichten.

Beginnen Sie mit der Verwendung des F-C-F-C-L-Halterungsadapters, der direkt an das Steckbrett angeschlossen wird, um das Koppler-Patchkabel mit einem dicken, ummantelten Patchkabel zu verbinden. Befestigen Sie ein Kommutator-Drehgelenk an den freien Enden des dicken, ummantelten Patchkabels. Befestigen Sie dann das Tier-Patchkabel am Kommutator.

Befestigen Sie eine verbindende geteilte Hülle an dem freien metallverwilderten Ende des Tier-Patchkabels, ohne die Hülle ganz nach oben zu drücken. Die Verwilderung lässt etwa 0,5 Zentimeter der Hülle frei, da diese mit der Glasfaser verbunden ist, die mit einem BNC-Kabel am Tier befestigt ist. Schließen Sie den blauen Lasertreiber an den Impulsgenerator an und schalten Sie den Impulsgenerator ein.

Setzen Sie nun eine entsprechende Schutzbrille auf. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass der Ein-/Aus-Knopf an der Vorderseite des Treibers auf Null steht, schalten Sie den Laser ein, indem Sie zuerst den Treiber einschalten, und dann die Lasertaste, während der Laser auf den positiven Modus TT L eingestellt ist. Stellen Sie langsam den Knopf an der Vorderseite des Lasers ein und stellen Sie mit einem Lichtleistungsmesser eine Lichtleistung von fünf bis 10 Milliwatt von der Spitze des Tier-Patchkabels ein.

Weitere Informationen zu dieser Einstellung finden Sie im Textprotokoll. Schalten Sie den blauen Laser für die In-vivo-Stimulation in den analogen Modus und warten Sie 10 bis 15 Minuten, bis sich der Laser aufgewärmt hat. Halten Sie dann die Maus vorsichtig fest und verbinden Sie die geteilte Hülle am tierischen Patchkabel mit der chronischen implantierbaren Faser.

Stellen Sie sicher, dass die Enden beider Fasern physischen Kontakt miteinander herstellen, indem Sie den Spalt an der Verbindungshülse als Fenster verwenden, um den direkten Kontakt zwischen den beiden zu visualisieren. Lassen Sie die Maus einige Minuten lang erholen, bevor Sie mit dem Verhaltenstest beginnen. Legen Sie dann das Tier in das Verhaltenstestgerät und stellen Sie sicher, dass das Anschlusskabel frei von Haken ist.

Verwenden Sie den Pulsgenerator, um einen blauen Laser mit einer vorgegebenen Frequenz zu pulsieren, die die gewünschte Option aktiviert. Nach Abschluss des Experiments bestätigen Sie histologisch die Virus- und Faserplatzierung, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, um eine genaue Interpretation der Verhaltensergebnisse zu gewährleisten. Überprüfen Sie unter einem Mikroskop die Stelle der Opsin-Expression und des Faserimplantats und bestätigen Sie visuell die geeignete Platzierung der Virusinjektion und des Implantats anhand der gewählten Koordinaten.

In diesem Beispiel für Verhaltensergebnisse, die durch optogenetische Stimulation in vivo erzielt wurden, wurden Dopamin-Neuronen im ventralen Bereich oder VTA von Tyrosin-Hydroxylase-Creme-Mäusen entweder mit einer stabilen Schrittfunktion OPSIN oder EYFP als kontrolliertes Virus transduziert und ein Faserimplantat wurde chronisch implantiert. Gruppen von Mäusen wurden gleichzeitig stimuliert und das Bewegungsverhalten wurde eine Stunde lang aufgezeichnet, wie hier gezeigt. Die wiederholte Stimulation der Ops und der transduzierten Maus auf der linken Seite führte zu einem hyperaktiven Phänotyp, der während der gesamten Stimulation bestehen blieb.

Während bei der Kontrollmaus auf der rechten Seite nach Verhaltenstests keine Veränderung des Bewegungsverhaltens festgestellt wurde, wurde eine Immunhistochemie durchgeführt, um das genaue virale Targeting auf VTA-Dopamin-Neuronen zu überprüfen, und die Faserplatzierung wurde visuell bestätigt, wie in dieser Abbildung gezeigt. Diese Technik kann verwendet werden, um die neuronale Aktivität in jeder gegebenen Gehirnregion von Interesse zu manipulieren, in Kombination mit einer Vielzahl von Verhaltenstests als funktionelle Auslesung der Modulation neuronaler Schaltkreise.