Name: Modellierung Spontane metastasiertem Nierenzellkarzinom (mRCC) in Mäusen nach Nephrektomie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Lernen Sie die orthotope Implantation von Nierentumorzellen und Nephrektomie zur Erzeugung eines spontan metastasierenden Nierenkarzinom-Modells bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die standardisierte Bewertung experimenteller Therapien.

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Wir sind dankbar, dass das Labor von Dr. Robert S. Kerbel (University of Toronto, Sunnybrook Research Institute, Toronto, Kanada) für die technische Hilfe und Expertise in der Entwicklung dieses Verfahrens. Wir möchten auch Dr. Sandra Sexton und der Roswell Park Cancer Institute Institut für Labortier Ressourcen danken. Diese Arbeit wurde von einem preis vom Roswell Park Alliance Foundation (bis JMLE) unterstützt.

1. Orthotopische Nierentumorimplantation <ol><li> Zellkultur <ol><li> Vor orthotopen Implantation wachsen Maus RENCA LUC-Zellen als Monolayer bis 75% Konfluenz. </li><li> Nach Trypsinierung und Resuspension in 5% FBS enthaltendem Medium, Zellen Zentrifuge bei 1000 Upm, 4 ° C für 5 min, wiederholen 3 mal in PBS waschen. Anschließend hat ein Resuspendieren der Zellen in serumfreiem Medium auf eine Konzentration von 5 x 10 4 RENCA LUC / 5 &amp;mgr; l Serum-freien Medien. Hinweis: Je nach Variante oder Zelllinie verwendet wird, können Zellen in einem 1:1-Verhältnis von Matrigel und Serum-freie Medien zu hoch aggressive Maus Zellwachstum und die Verbreitung nach der Implantation langsam resuspendiert werden. </li></ol></li><li> Chirurgie und Zellimplantation Hinweis: Alle darin beschriebenen Tierstudien, einschließlich Wartung und experimentelle Bestimmung der Endpunkte wurden nach einem Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) p durchgeführtrotocol von Roswell Park Cancer Institute genehmigt. <ol><li> Anesthetize ein Balb / C-Maus mit Isofluran (2-3%). Pinch Fuß und überprüfen Reflex, um eine ausreichende Betäubung gewährleisten. Bewerben Tierarzt Salbe für die Augen, um ein Austrocknen zu verhindern. Zeigen Maus in der rechten Seitenlage und rasieren linken Seite zwischen Vorder-und Hintergliedmassen. Bewerben Alkohol und Jod zusammen dorsalen lumbalen Bereich zu Bereich für Schnitt aseptisch vorbereiten. </li><li> Verwenden chirurgische Schere, eine 1 cm Hautschnitt in Längsrichtung zwischen der letzten Rippe und dem Hüftgelenk zu initiieren. Lösen Bindegewebe unter der Haut mit einem stumpfen Dissektion Schere. Verwenden chirurgische Schere, um eine 0,5 cm lange Inzision in Längsrichtung in der Bauchdecke zu machen. Verwenden gebogenen Pinzette vorsichtig nach unten drücken, um offene Wunde - das wird die Niere exteriorisieren und vor der Injektion zu ermöglichen für die schonende Immobilisierung der Orgel. </li><li> Laden Sie die Hamilton-Spritze mit 5 ul der vorbereiteten Zellgemisch. Für Unterkapsel Implantologietungen können zwei Implantationsverfahren eingesetzt werden: <ol><li> Oberflächliche: parallele Laufen zum längsorientierte Niere, Einsatz Nadel unter die Nierenkapsel (aber über dem Parenchym) mit der abgeschrägten Kante nach oben. Sobald Nadel ist vorhanden, spritzen alle Zellen bis kleine weiße Blase bildet. Entfernen Sie langsam Nadel aus Kapsel und sofort über Injektion tupfen mit einem sterilen Wattestäbchen, um ein Auslaufen zu absorbieren und verhindern Zell Verbreitung. </li><li> Intern: Mit abgeschrägten Kanten und ausgehend von der Seite der Niere gegenüber endgültige Implantationsstelle, legen Nadel durch Innere der Niere, bis die Nadel sichtbar (aber nicht Punktion) ist die Sub-Kapselraum. Spritzen Sie alle Zellen, bis weiße Blase bildet und Tupfer Injektionsstelle, um ein Auslaufen zu verhindern. </li></ol></li><li> Sie vorsichtig die Niere in die Körperhöhle zurück. Schließen Sie die Bauchkörperwand mit 5-0 resorbierbaren Vicryl Naht. Wenn Sie fertig sind, ziehen Sie den Hautschicht zusammen und legen Sie 2-3 wound Clips. Stellen Sie sicher, Clips sind fest und gleichmäßig verteilt, keine Wunde Belichtung ein. Vor der Verwertung verabreichen 500 &amp;mgr; l 0,9% NaCl und 100 ul Buprenorphin (0,01 mg / ml) subkutan unter Verwendung einer 25 G-Nadel. Clip Platzierung und Stabilität routinemäßig zu überwachen, und nach 10 Tagen zu entfernen. </li></ol></li></ol> 2. Nephrektomie / Primärtumorentfernung <ol><li> Folgen identisches Protokoll für Maus Betäubung, Ruhigstellung, Schnitt und Belichtung von Nieren wie in den Abschnitten 1.2.1 und 1.2.2 (oben) beschrieben. </li><li> Verwenden eines zweiten Paars von Zangen, um die Niere durch vorsichtiges Entfernen des Verbindungs ​​Fettgewebe vom kaudalen Ende und die Nebenniere von kranialen Ende der Niere isolieren. Während sanft Greifen der Niere, verwenden resorbierbaren 5-0 Vicrylnaht einen Doppelknoten um den Harnleiter, Nierenarterie und Vene zu machen. Langsam sichere und dann über den Knoten zu zerschlagen, um die Niere zu entfernen. Bei Anzeichen von Blutverlust sofort, oder es besteht die Gefahr der unzureichenden HaltNaht auf Harnleiter, Arterie und Vene, dann verwenden cauterizer statt Schere, über Knoten zu zerschlagen. </li><li> Sobald Niere entfernt wird, sorgfältig zu prüfen, für jede Blutung aus der Arterie und gebunden cauterizer verwenden, wenn nötig. Schließen Sie die Bauchkörperwand mit 5-0 Vicryl. Ziehen Sie die Hautschicht zusammen und legen Sie 2-3 Wundklammern folgenden gleichen Vorsichtsmaßnahmen wie in 1.2.4 beschrieben. Tier täglich genau beobachten, nach der Operation für Anzeichen von Leiden, Blutungen oder eingeschränkter Mobilität. Folgen Sie den Richtlinien des Instituts für Tier sicher. </li></ol> 3. Überwachung Metastatische Progression und Lokalisierung bei Endpoint <ol><li> Quantifizierung Metastasen: Biolumineszenz-Überwachung <ol><li> Siehe zuvor in JOVE für die Überwachung von Metastasen unter Verwendung von Zellen mit Luciferase transfiziert und quantifiziert mit der Xenogen IVIS Imaging-System 11,12 beschriebenen Methodik. </li></ol></li><li> Visuelle Obduktion Führung für die vergleichende Bewertung von metastasierendem Verteilungtion <ol><li> Sacrifice Tiere nach den Richtlinien des Instituts mit Endpunkten einschließlich Anzeichen von Leiden, Atemnot, Gewichtsverlust, usw. Hinweis: Eine genaue Überwachung der Tiere ist kritisch, da spontane metastatischen Progression kann sehr variabel und schnell. </li><li> Verwenden chirurgische Schere, um einen Schnitt über der Harnröhre, die weiterhin die Brusthöhle zu Unterkiefer zu initiieren. Verwenden stumpfendig Schere, um die Haut von der Muskulatur der Bauchwand zu trennen. </li><li> Initiieren Einschnitte entlang Arme und Beine. Haut entfernt. Untersuchen Sie die Haut Faszie und Bauchwand für Knoten, dann die oberflächlichen Lymphknoten: Leisten-, Arm-, Achsel-und oberflächliche Gebärmutterhalskrebs. </li><li> Einen Einschnitt in der Bauchwand und entlang der linken und rechten Seitenflächen bis zu der Membran geschnitten. Mit einem horizontalen Schnitt entfernen Sie den vorderen Teil der Bauchwand, um die Eingeweide entblössen. </li><li> Untersuchen Sie den ungestörten Auftritt der Eingeweide foder grob bemerkenswerte Tumoren. Beachten Sie auch den Inhalt von Magen und Darm; wenn sie leer sind, kann die Maus nicht in der Lage zu essen haben. Wenn die Inhalte sind dunkel, kann dieser Nachweis der oberen / unteren Magen-Darm-Blutung hinweisen. </li><li> Visuell gäste jedes Organ für die Tumor-oder Abwesenheit, die Zuweisung einer Gesamtpunktzahl für jede Maus Gruppe (4 Tiere pro Gruppe ist als beispielsweise in 1D-i verwendet wird). Anmerkungen: 1) Die Erweiterung der Lymphknoten bedeutet nicht unbedingt, dass es ein Tumorwachstum; wenn es sehr große, sehr fest, und eine weißliche Farbe ist, ist es wahrscheinlich eine metastatische Knötchen. 2) Übermäßiger oder milchig trübe Flüssigkeit in der Bauchhöhle zeigt Aszites. Aszites kann fest Ansammlungen auf der Bauchorgane, insbesondere zwischen den Lappen der Leber und des Magens sind. 3) für Organe wie die Lunge, können mehrere Knoten vorhanden ist und für Vergleiche zwischen einzelnen Tieren gezählt werden (siehe zum Beispiel 13). </li><li> Identifizieren Brutto Tumoren oder Fehlbildungen der einzelnen Bauchorgane: Leber, Milz, Nieren und Bauchspeicheldrüse durch vorsichtiges Entfernen und Waschen mit PBS aus einer Spritzflasche. </li><li> Nach dem Entfernen der Bauchorgane, untersuchen die Bauch Lymphknoten, einschließlich der Lenden-, Kreuzbein-, Nieren-und mesenterialen Lymphknoten. </li><li> Bewerten Membran zum Nachweis von Metastasierung. Hinweis: Umfangreiche Verbreitung auf der Membran, kann sie seine Kontraktilität verlieren, was zu schwer oder Verlust der Atmung. </li><li> Entfernen Membran und machen zwei seitliche Schnitte in die Brusthöhle, das Entfernen der Frontbereich, um die Lungen und das Herz freizulegen. </li><li> Lunge und Herz entfernen, indem Sie vorsichtig Greifen und Anheben der Speiseröhre und Schneiden der Luftröhre über dem Herzen. Bewerten Gewebe für Knötchen. Squeeze Herzen. Mangel an Konsistenz kann darauf hindeuten, feder vorliegenden Tumor. </li><li> Verwenden chirurgische Schere, um linear durch Schädel geschnitten. Entfernen Sie vorsichtig kleine Stücke des Schädels bis ter ganze Gehirn ausgesetzt ist. Schauen gesamten Gehirn für Knötchen oder sichtbaren Anomalien Verfärbungen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).</li>
<li>Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endostatin+neoadjuvant+gene+therapy+extends+survival+in+an+orthotopic+metastatic+mouse+model+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma.</a> Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).</li>
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<li>Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+model+of+serous+ovarian+cancer+in+immunocompetent+mice+for+in+vivo+tumor+imaging+and+monitoring+of+tumor+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ebos, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+metastasis+after+short-term+treatment+with+a+potent+inhibitor+of+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis.</a> Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der Zweck dieses Protokolls ist es, klinisch relevante spontane Metastasen beurteilen mit einem syngenen Tumor-Mausmodell der Implantation / Resektion Techniken zu beschreiben. Derzeit ist die Mehrheit der präklinischen Studien, die neue experimentelle Therapien nicht enthalten Studie von Metastasen und nur wenige rekapitulieren die Phasen der Primärtumorwachstum, chirurgische Resektion, und eventuelle spontane Metastasierung. Bis heute gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMS) erzeugt werden, um spontane Nierenzellfo...

Die Hauptursache der Sterblichkeit bei Patienten mit Nierenzellkarzinom (RCC) ist eine systemische Metastasen, die typischerweise auftritt, nach chirurgischer Entfernung eines Primärtumors wächst in der Niere. Sehr wenige präklinischen Tumormodellen Auswertung experimenteller Therapeutik in Mäusen sind jedoch Metastasen, und noch weniger treu die klinischen Phasen der lokalisierten Wachstum, Chirurgie und spontane Mikro-Metastasen Initiierung und Progression 1-3 rekapitulieren. Diese Lücke im Test hat sich bei der Bewertung neuer Therapien wie manchmal auffällig Anti-Tumor-Wirkung in Tiermodellen gesehen, nicht immer in ähnlich erfolgreiche Behandlung von Patienten 4 setzten immer wichtiger. Solche Unterschiede in den Ergebnisse können von Differentialdrogenwirkungsgrade zwischen lokalisierten oder Eileiter orthotopen Primärtumormodellen und späten Stadium Metastasen 5-7 einzudämmen. Im Fall des RCC, haben nur wenige Studien beschäftigt etabliert einenimal-Protokolle, die spontan wiederkehrende Krankheit, die Patienten, die imitiert haben typischerweise tumortragenden Nieren hatte ganz oder teilweise entfernt, 2,3 enthalten. Die Gründe für diesen Mangel in Maus-Modelltests variieren. Erstens gibt es die hohe Tier Kosten und der inhärenten Variabilität der Tumorzellenauswahl und metastatischen Potential. Zum Beispiel, menschliche Nierenzelllinien sind in der Regel selten metastasieren und müssen über mehrere Runden orthotopen primären und metastatischen Implantation Auswahl an Varianten, die konsequent zu verbreiten und bilden entfernten Läsionen ableiten gewählt werden (siehe Beschreibung eines solchen menschlichen Zelllinie Ableitung 8-10) . Umgekehrt, bei immunkompetenten Zellen der Maus Modelle neigen dazu, aggressiv zu verhalten und geringe Zellzahlen müssen mit Matrigel sofortige systemische Ausbreitung 3 reduzieren injiziert werden. Zweitens, technische Schwierigkeiten bei der Durchführung richtige Implantation, chirurgische Resektion (Nephrektomie) und Tracking (und Quantifizierung) spontane metastatic Wachstum kann eine Herausforderung sein und mehrere kritische Variablen müssen berücksichtigen, wenn diese Technik verwenden (siehe Diskussion für Details). Der Zweck dieses Protokolls ist es, die wesentlichen Schritte (wie auch mögliche Fallstricke) des orthotopen Implantation Resektion (Nephrektomie) und die Überwachung der spontanen metastasierendem RCC Krankheit zu beschreiben und eine Leitlinie für standardisierte (und verbreitet) bieten unter den wissenschaftlichen Labors nutzen beurteilen, dass die Wirksamkeit der experimentellen Therapeutika.

<table><tbody><tr><td>DMEM-hoher Glukosegehalt mit Pyr. und L-Glutamin</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS ohne Calcium & Magnesium</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>muss auf Eis gehalten werden</td></tr><tr><td>Künstliches Tränen-Gleitmittel Augensalbe</td><td>Akorn Animal Health</td><td>17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Pocket Pro Haustiertrimmer</td><td>Braintree wissenschaftliche</td><td>CLP9931B</td><td></td></tr><tr><td>Alkoholtupfer</td><td>VWR</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Betadine-Lösungstupfer</td><td>VWR</td><td>67618-152-01</td><td></td></tr><tr><td>MICRO DISSECTING Schere gerade, stumpf - 25 mm Klingen - 4,5" &nbsp;</td><td>Southpointe chirurgische</td><td>RS-5982</td><td></td></tr><tr><td>Irispinzette, gezahnt, gebogen, 10 cm lang</td><td>Kent wissenschaftliche</td><td>INS15915</td><td>benötigen zwei dieser</td></tr><tr><td>10 & Mikro; l Hamilton Spritze</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>30 G, 45 Grad, RN-Nadel</td><td>Hamilton</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Appikator aus Baumwolle</td><td>VWR</td><td>10805-144</td><td></td></tr><tr><td>Hochtemperatur-Kauterset</td><td>Kent Scientific</td><td>INS500392</td><td></td></tr><tr><td>5-0 beschichtetes Vicryl, konventionelle Schneidenadel&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>J834</td><td></td></tr><tr><td>Reflex Clip Applier für 7 mm Clips</td><td>Kent scientific</td><td>INS500343</td><td></td></tr><tr><td>Reflex Clips, 7 mm, unsteril</td><td>Kent scientific</td><td>INS500344</td><td></td></tr><tr><td>Entnahmezange, 12 cm lang</td><td>Kent scientific</td><td>INS500347</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Natriumchlorid</td><td>Baxter Healthcare</td><td>2B1322</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin 0,01 mg/ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 G 5/8" Nadel</td><td>VWR</td><td>BD305122</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritze ohne Nadel</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Gold Bio-Technologie</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

modellierung spontane metastasiertem nierenzellkarzinom (mrcc) in mäusen nach nephrektomie

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

Eine der wichtigsten Herausforderungen für die verbesserte Prüfung von neuen experimentellen Therapie beim Nierenzellkarzinom (RCC) ist die Entwicklung von Modellen, die treu zu rekapitulieren Früh-und Spätstadium metastasierendem Krankheitsprogression. Typische Tumorimplantation Modelle verwenden oder Eileiter orthotopen Primärtumorimplantation, aber nur wenige sind spontane systemische Metastasen, die den klinischen Umgebung nachahmt. Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte zur Entwicklung RCC Fortschreiten der Krankheit ähnlich inszeniert für die Patienten. Zuerst, verwendet es eine stark metastasierenden Maus-Tumor-Zelllinie in einem syngenen Modell orthotope Tumorzellimplantation zu zeigen. Zu den Methoden gehören oberflächlich und interne Implantation in den Kapselunter Raum mit Zellen kombiniert mit Matrigel, um ein Auslaufen und frühen Ausbreitung zu verhindern. Weiter ist das Verfahren zur Entfernung der tumortragenden Niere (Nephrektomie) beschreibt, mit kritischen prä-und postoperative Versorgung der Maus. Schließlich beschreibt die notwendigen Schritte, um sie zu überwachen und zu bewertenMikro-und Makro-metastatischen Progression der Erkrankung, einschließlich Biolumineszenz-Bildgebung sowie eine detaillierte visuelle Obduktion Leitfaden für systemische Erkrankung Verteilung punkten. Das Ziel dieser Protokollbeschreibung ist es, die weit verbreitete Verwendung von klinisch relevanten metastasierendem RCC Modelle, um die Vorhersagewert von Tests zukünftige therapeutische Verbesserung zu erleichtern.

1A zeigt eine schematische umreißt die Verfahren in diesem Protokoll Zusammenfassung aufgeführt. Mehrere wichtige Faktoren muss für jede Stufe. Zum Beispiel in Schritt 1 zeigt zwei Verfahren zur Unterkapsel Implantation der Tumorzellen in der Niere. Tumorzellen können in den Sub-Kapsel-Raum mit einem kleinen weißen Blase Bestätigung der lokalisierten Platzierung der Zellen mit Leckage durch sorgfältige Entfernung der Nadel und Abtupfen überschüssigen austretende Flüssigkeit (Abbildung 1B-i)</str...

Modelle der spontanen metastasiertem Nierenzellkarzinom (RCC) den Krankheitsverlauf kann für die Bewertung Behandlungen in einer klinisch relevanten Einstellung verwendet werden. Dieses Protokoll zeigt verschiedene Verfahren für orthotope Nierentumorzellimplantation, richtige Nephrektomie und schließlich skizziert eine Obduktion Führer für visuelle und Biolumineszenz-Scoring von metastasierendem Belastung und Lokalisierung.

Modellierung Spontane metastasiertem Nierenzellkarzinom (mRCC) in Mäusen nach Nephrektomie

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein klinisch relevantes, spontan metastasierendes Nierenzellkarzinom zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst Reka-Luke-Zellen für die Implantation vorbereitet werden. Der zweite Schritt ist die orthotopische Implantation von Tumorzellen in die Niere.Anschließend wird, nachdem der Tumor gewachsen ist, der Primärtumor durch eine Nephrektomie entfernt. Der letzte Schritt besteht darin, das Fortschreiten der spontanen Metastasierung nach der Nephrektomie zu überwachen und die Verteilung der Erkrankung an verschiedenen Lokalisationen zu bewerten. Letztendlich ermöglicht dieses Protokoll die Überwachung einer spontan metastasierenden Nierenzellkarzinom-Erkrankung und bietet eine Anleitung zur Standardisierung der Wirksamkeitsbewertung experimenteller Therapeutika.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie ektopischen, oft oberflächlichen oder subkutanen Tumorzell-Implantationsmethoden liegt darin, dass sie das Nierenzellkarzinom oder RCC so nachbildet, wie es bei Patienten auftritt, einschließlich der Fähigkeit der Tumorzellen, sich im gesamten Körper auszubreiten. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Behandlung des Nierenzellkarzinoms hinein, da gerade die systemische dissemierte Metastasierung die eigentliche Hauptursache für die Mortalität bei Patienten darstellt. Mausmodelle behandeln typischerweise keine spontan auftretende metastatische Erkrankung, die manchmal einer Nephrektomie folgen kann.Obwohl diese Methode Einblicke in die spontane metastasierende Nierenzellkarzinom-Erkrankung ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Krebsarten anwendbar, bei denen die Entfernung des Primärtumors üblich ist und die hauptsächliche Todesursache eine postoperative Rezidivierung der metastasierten Erkrankung darstellt. Dazu gehören unter anderem Modelle des Mammakarzinoms und des Melanoms.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, und zwar erstens aufgrund der Herausforderung, die Niere zu finden, und sicherzustellen, dass die Tumorzellen nach der Implantation lokal begrenzt bleiben und nicht austritt. Zweitens hängt die Wirksamkeit davon ab, dass der Eingriff effizient durchgeführt wird und eine postoperative Erholung ermöglicht wird. Vor der orthotopen Implantation sollten Maus-Luciferase-markierte ReCa-Zellen oder ReKa-Luke-Zellen als Monolayer bis zu einer Konfluenz von 75 % kultiviert werden; anschließend werden sie durch Trypsinierung abgelöst, in einem Medium mit 5 % FBS resuspendiert, zentrifugiert und dreimal mit PBS gewaschen; danach werden die Zellen in serumfreiem Medium auf eine Konzentration von 5 × 10⁴ RenCo-Luke pro 5 µL serumfreiem Medium resuspendiert.Nach der Anästhesierung einer Darm-Seemaus mit zwei bis 3 % Isofluran den Fuß anpinzeln, um nach Auftragen einer Augensalbe auf die Augen zur Verhinderung von Austrocknung die ausreichende Anästhesie zu überprüfen, danach die Maus in rechte Seitenlage bringen und die linke Seite zwischen den Vorder- und Hintergliedmaßen rasieren. Anschließend den dorsolumbalen Bereich mit Alkohol und Jod behandeln. Mit einer chirurgischen Schere einen ein Zentimeter langen Hautschnitt in longitudinaler Richtung zwischen dem letzten Rippenbogen und dem Hüftgelenk anlegen.Verwenden Sie dann stumpfe Dissektionscheren, um das Bindegewebe unter der Haut zu lösen. Anschließend machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen 0,5 cm langen Längsschnitt in der Bauchwand. Benutzen Sie nun eine gebogene Pinzette, um vorsichtig um die offene Wunde herum nach unten zu drücken.Dieser Schritt bringt die Niere nach außen und ermöglicht eine schonende Immobilisierung des Organs vor der Injektion. Füllen Sie eine Hamilton-Spritze mit fünf Mikrolitern der hergestellten Zellmischung für eine oberflächliche subkapsuläre Implantation. Halten Sie die Nadel parallel zur längs ausgerichteten Niere mit der abgeschrägten Kante nach oben und führen Sie die Nadel unter die Nierenkapsel, jedoch über dem Parenchym, ein.Nachdem die Nadel korrekt positioniert ist, injizieren Sie alle Zellen, bis sich eine kleine weiße Blase bildet. Entfernen Sie die Nadel langsam aus der Kapsel und verschließen Sie unverzüglich die Einstichstelle mit einem sterilen Wattestäbchen, um eine interne subkapsuläre Implantation zu gewährleisten. Beginnen Sie dabei auf der dem gewünschten Implantationsort gegenüberliegenden Seite der Niere.Halten Sie die Nadel mit der abgeschrägten Kante nach oben und nach innen. Führen Sie sie durch das Innere der Niere, bis die Nadel sichtbar ist, jedoch die subkapsuläre Raum auf der gegenüberliegenden Seite nicht durchsticht. Injizieren Sie die Zellen, bis sich eine weiße Blase bildet, und tupfen Sie die Injektionsstelle ab, um ein Austreten zu verhindern.Setzen Sie die Niere vorsichtig in die Körperhöhle zurück. Schließen Sie die Bauchdecke mit einer resorbierbaren Vicryl-Naht 5.0. Sobald dies abgeschlossen ist, halten Sie die Hautschicht zusammen und setzen Sie zwei bis drei Wundklammern, bevor die Wiedererholung beginnt.Verabreichen Sie 500 µL 0,9 %iger Natriumchloridlösung und 100 µL Buprenorphin subkutan. 26 bis 30 Tage nach der Implantation das Tier anästhesieren und die Niere wie zuvor freilegen. Anschließend mit einer Pinzette vorsichtig das verbindende Fettgewebe vom kaudalen Ende der Niere entfernen und die Nebenniere vom kranialen Ende abtrennen.Verwenden Sie eine Pinzette, um die Niere vorsichtig zu fassen, und führen Sie dann einen resorbierbaren 5.0-Vicryl-Faden um Harnleiter, Nierenarterie und Nierenvene. Danach knüpfen Sie langsam einen doppelten Knoten, nachdem Sie die Fäden mit einer Hämostaseklemme fixiert haben. Schneiden Sie mit einer Schere oberhalb des Knotens ab und entfernen Sie die Niere.Nach der Entfernung der Niere sorgfältig auf Blutungen aus der Arterie überprüfen und gegebenenfalls kauterisieren. Nach der Naht der Bauchdecke mit 5.0 Vicryl die Haut mit Wundclips verschließen. Das Tier täglich auf Anzeichen von Belastung, Blutungen oder eingeschränkte Mobilität überwachen.Nach der Tötung des Tieres einen Schnitt mit einer Schere oberhalb der Harnröhre beginnen und entlang der Brusthöhle bis zum unteren Unterkiefer fortsetzen. Mit stumpfen Scheren die Haut von der Bauchwandmuskulatur lösen. Anschließend die Haut entlang der Arme und Beine einschneiden und die Haut langsam ablösen.Untersuchen Sie die Hautfascia und die Bauchwand sorgfältig auf Knoten. Danach untersuchen Sie die oberflächlichen Lymphknoten. Führen Sie einen Schnitt in der Bauchwand durch und schneiden Sie entlang der linken und rechten Seiten bis zum Zwerchfell. Mit einem horizontalen Schnitt. Entfernen Sie den vorderen Teil der Bauchwand, um die Eingeweide freizulegen. Untersuchen Sie das ungestörte Erscheinungsbild der Eingeweide auf auffällige Tumoren. Beachten Sie außerdem den Inhalt von Magen und Darm auf Hinweise für Nahrungsaufnahme oder Blutungen. Bewerten Sie jedes Organ visuell hinsichtlich des Vorhandenseins oder Fehlens von Tumoren, ausgehend von einer Checkliste mit 22 Stellen; die Bewertungen werden für die Tiere einer bestimmten Gruppe zusammengefasst, um die Verteilung der Erkrankung zu vergleichen. Entfernen Sie nun vorsichtig die Leber und waschen Sie sie mit PBS.Danach auf grobe Tumore oder Auffälligkeiten untersuchen und wie zuvor bewerten. Anschließend fortfahren mit der Entfernung und Bewertung der Milz, der Niere und der Bauchspeicheldrüse. Danach die Lymphknoten der Bauchhöhle untersuchen, einschließlich der lumbosakralen, renalen und mesenterialen Lymphknoten.Nach der Beurteilung des Zwerchfells auf Hinweise einer metastatischen Ausbreitung entfernen Sie das Zwerchfell und führen zwei seitliche Einschnitte in der Brusthöhle durch, wobei der vordere Bereich entfernt wird, um Herz und Lunge freizulegen. Heben Sie die Speiseröhre vorsichtig an und durchtrennen Sie die Luftröhre oberhalb des Herzens. Nach der Entfernung von Herz und Lunge untersuchen Sie das Gewebe auf Knoten. Anschließend quetschen Sie das Herz mit einer Pinzette.Ein Mangel an Federspannkraft kann auf das Vorhandensein eines Tumors hinweisen. Zuletzt schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere linear durch den Schädel. Entfernen Sie vorsichtig kleine Teile des Schädels, bis das gesamte Gehirn freigelegt ist.Ein visuelles Bewertungssystem wurde verwendet, um Krankheit, Verteilung und Schwere der Erkrankung in fünf verschiedenen Tiergruppen zu beurteilen. Diese Gruppen wiesen unterschiedlichen Umfang und Schweregrad der Erkrankung auf. Eine zusätzliche Messung mittels biolumineszenzbasierter Bildgebung unmittelbar nach der Tötung diente zur quantitativen Beurteilung mikro- und makroskopischer metastatischer Läsionen.Wenn die Techniken beherrscht sind, können Implantation, Nephrektomie oder Sektion bei korrekter Durchführung pro Tier innerhalb von fünf bis zehn Minuten durchgeführt werden. Um zu untersuchen, ob die Behandlungsreaktionen zwischen verschiedenen Typen metastasierender Tumorzellen variieren. Zellen aus metastasierendem Nierenzellkarzinom.Derzeit werden Patienten verwendet, um direkt in Tiere zu implantieren, um das Wachstum von lokalen und metastatischen Erkrankungen nach ihrer Entstehung zu bewerten. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet des Nierenzellkarzinoms (RCC) den Weg, klinisch relevante Krankheitsverläufe sowie Therapieansprechen zu untersuchen. Insbesondere, ob sich diese Ansprechen abhängig von der primären lokalisierten Erkrankung oder vom spontanen metastatischen Wachstum unterscheiden.Es darf nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit kleinen Tieren, die mehrere Eingriffe durchlaufen, die strikte Einhaltung der institutionellen Tierversuchsrichtlinien und sterile Bedingungen erfordert. Das Wohlbefinden und die Erholung der Tiere sind entscheidende Faktoren, die für die korrekte Durchführung dieses Verfahrens von großer Bedeutung sind.

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