Modellierung Spontane metastasiertem Nierenzellkarzinom (mRCC) in Mäusen nach Nephrektomie

Modelle der spontanen metastasiertem Nierenzellkarzinom (RCC) den Krankheitsverlauf kann für die Bewertung Behandlungen in einer klinisch relevanten Einstellung verwendet werden. Dieses Protokoll zeigt verschiedene Verfahren für orthotope Nierentumorzellimplantation, richtige Nephrektomie und schließlich skizziert eine Obduktion Führer für visuelle und Biolumineszenz-Scoring von metastasierendem Belastung und Lokalisierung.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein spontanes metastasiertes Nierenzellkarzinom zu erzeugen, das klinisch relevant ist. Dazu werden zunächst Reka-Luke-Zellen für die Implantation vorbereitet. Der zweite Schritt besteht darin, eine orthotope Implantation von Nierentumorzellen durchzuführen.

Nachdem der Tumor gewachsen ist, wird der Primärtumor durch eine Nephrektomie entfernt. Der letzte Schritt besteht darin, das Fortschreiten der spontanen Metastasierung nach der Nephrektomie zu überwachen und die Krankheitsverteilung an verschiedenen Stellen zu beurteilen. Letztendlich ermöglicht dieses Protokoll die Überwachung der spontanen metastasierten Nierenzellkarzinomerkrankung und bietet eine Richtlinie zur Standardisierung der Bewertung der Wirksamkeit experimenteller Therapeutika.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie ektopischen, oft oberflächlichen oder subkutanen Tumorzellimplantationsmethoden besteht darin, dass sie das Nierenzellkarzinom oder RCC, wie es bei Patienten auftritt, rekapituliert, was die Fähigkeit von Tumorzellen einschließt, sich auf den Rest des Körpers auszubreiten. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Behandlung des Nierenzellkarzinoms, da es die systematische dismetastasierende Erkrankung ist, die die Hauptursache für die Sterblichkeit bei Patienten ist. Mausmodelle behandeln in der Regel keine spontanen metastasierenden Erkrankungen, die manchmal auf eine Nephrektomie folgen können.

Diese Methode kann jedoch Einblicke in die spontane metastasierende RCC-Erkrankung geben. Es kann auch bei anderen Krebsarten angewendet werden, bei denen die Entfernung von Primärtumoren typisch ist und die Haupttodesursache das Wiederauftreten der portchirurgischen metastasierenden Erkrankung ist. Dazu gehören unter anderem Modelle von Brust- und Melanommodellen.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, erstens die Niere zu finden und sicherzustellen, dass die Tumorzellen bei der Implantation lokalisiert bleiben und nicht auslaufen. Und zweitens wird die Wirksamkeit effizient durchgeführt und ermöglicht eine postoperative Genesung. Vor der orthotopen Implantation wachsen Maus-Luziferase-markierte Reca-Zellen oder Reka-Luke-Zellen als Monoschicht auf 75%co-Fluenz nach Trypsin-, Ization- und Reanimationssuspension in 5%FBS-haltiger Medienzentrifuge, wobei die Zellen dreimal mit einer Wäsche in PBS wiederholt werden und dann die Zellen in serumfreien Medien bis zu einer Konzentration von fünfmal 10 bis zum vierten Renco Luke pro fünf Mikrolitern serumfreiem Medium resuspendieren.

Nachdem Sie eine Darmmaus mit zwei bis 3 % Fluor betäubt haben, kneifen Sie einen Fuß ein, um eine ausreichende Betäubung zu überprüfen, nachdem Sie Tierarztsalbe auf die Augen aufgetragen haben, um ein Austrocknen zu verhindern, legen Sie die Maus in das rechte seitliche Liegerad und rasieren Sie die linke Seite zwischen den vier und den hinteren Gliedmaßen. Tragen Sie dann Alkohol und Jod entlang der dorsalen Lendenwirbelsäule auf. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen einen Zentimeter großen Hautschnitt in Längsrichtung zwischen der letzten Rippe und dem Hüftgelenk.

Lösen Sie dann mit einer stumpfen Präparierschere das Bindegewebe unter der Haut. Als nächstes machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen 0,5 Zentimeter großen Schnitt in Längsrichtung in der Bauchdecke. Drücken Sie nun mit einer gebogenen Pinzette sanft um die offene Wunde herum.

Dadurch wird die Niere nach außen gestärkt und das Organ vor der Injektion sanft ruhiggestellt. Füllen Sie eine Hamilton-Spritze mit fünf Mikrolitern der vorbereiteten Zellmischung für eine oberflächliche subkapsuläre Implantation. Halten Sie die Nadel parallel zur längsorientierten Niere mit der abgeschrägten Kante nach oben und führen Sie die Nadel unter die Nierenkapsel, aber oberhalb des Parenchyms ein.

Sobald die Nadel an Ort und Stelle ist, injizieren Sie alle Zellen, bis sich eine kleine weiße Blase bildet. Entfernen Sie langsam die Nadel aus der Kapsel und verwenden Sie sofort einen sterilen Applikator mit Wattespitze, um die Injektionsstelle für eine interne subkapsuläre Implantation zu blockieren. Beginnend mit der Seite der Niere, die der gewünschten Implantationsstelle gegenüberliegt.

Halten Sie die Nadel mit der abgeschrägten Kante nach oben und innen. Führen Sie es durch das Innere der Niere ein, bis die Nadel sichtbar ist, aber stechen Sie nicht in den subkapsulären Raum auf der anderen Seite. Injizieren Sie die Zellen, bis sich eine weiße Blase bildet, und tupfen Sie die Injektionsstelle ab, um ein Auslaufen zu verhindern.

Bringen Sie die Niere vorsichtig in die Körperhöhle zurück. Verschließen Sie die Bauchdecke mit einem resorbierbaren 5.0 Vicryl-Nahtmaterial. Wenn Sie fertig sind, halten Sie die Hautschicht zusammen und platzieren Sie zwei bis drei Wundclips, bevor Sie sich erholen.

Verabreichen Sie 500 Mikroliter 0,9% Natriumchlorid und 100 Mikroliter Buprenorphin subkutan. 26 bis 30 Tage nach der Implantation das Tier betäuben und die Niere wie zuvor freilegen. Entfernen Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig das verbindende Fettgewebe vom verwöhnten Ende der Niere und entfernen Sie die Nebenniere vom Schädelende.

Fassen Sie die Niere mit einer Pinzette vorsichtig an und schieben Sie dann eine resorbierbare 5.0 Vicryl-Naht um den Harnleiter, die Nierenarterie und die Nierenvene. Als nächstes binden Sie langsam einen Doppelknoten, nachdem Sie die Fäden mit Hämostaten festgeklemmt haben. Schneide mit einer Schere oberhalb des Knotens und entferne die Niere.

Sobald die Niere entfernt wurde, überprüfen Sie sorgfältig auf Blutungen durch die Flut, die Arterie und kauterisieren Sie sie, falls erforderlich. Nach dem Nähen der Bauchkörperwand mit 5.0 Vicryl verwenden Sie Wundclips, um die Haut zu schließen. Überwachen Sie das Tier täglich auf Anzeichen von Stress, Blutungen oder eingeschränkter Mobilität.

Nachdem Sie das Tier eingeschläfert haben, verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen Schnitt zu machen, der oberhalb der Harnröhre beginnt und sich über die Brusthöhle bis zum unteren Unterkiefer fortsetzt. Verwenden Sie eine stumpfe Schere, um die Haut vom Muskel der Bauchdecke zu trennen. Schneiden Sie dann die Haut entlang der Arme und Beine ein und schälen Sie die Haut langsam ab.

Untersuchen Sie die Hautfaszie und die Bauchdecke genau auf Knötchen. Untersuchen Sie dann die oberflächlichen Lymphknoten. Machen Sie einen Schnitt in der Bauchdecke und schneiden Sie entlang der linken und rechten Seitenseite bis zum Zwerchfell.

Mit einem horizontalen Schnitt. Entferne den vorderen Teil der Bauchdecke, um die Eingeweide freizulegen. Untersuchen Sie das ungestörte Erscheinungsbild der Eingeweide auf grob auffällige Tumoren.

Notieren Sie auch den Inhalt des Magens und des Darms auf Anzeichen von Nahrung oder Blutungen. Bewerten Sie jedes Organ visuell auf das Vorhandensein oder Fehlen von Tumoren Anhand einer Checkliste von 22 Stellen werden die Ergebnisse für die Tiere in einer bestimmten Gruppe tabellarisch dargestellt, um die Krankheitsverteilung zu vergleichen. Entferne nun vorsichtig die Leber und wasche sie mit PBS.

Untersuchen Sie es dann auf grobe Tumore oder Anomalien und bewerten Sie es wie zuvor. Fahren Sie dann fort, die Milz, die Niere und die Bauchspeicheldrüse zu entfernen und einzuritzen. Untersuchen Sie als Nächstes die abdominalen Lymphknoten, einschließlich der lumbalen Sakral-, Nieren- und Mesenteriallymphknoten.

Nachdem Sie das Zwerchfell auf Anzeichen einer Metastasierung untersucht haben, entfernen Sie das Zwerchfell und machen Sie zwei seitliche Schnitte in der Brusthöhle, entfernen Sie den vorderen Teil, um die Lunge und das Herz freizulegen, heben Sie die Speiseröhre vorsichtig an und schneiden Sie die Luftröhre über dem Herzen. Untersuchen Sie nach der Entfernung der Lunge und des Herzens das Gewebe auf Knötchen. Drücken Sie als Nächstes mit einer Pinzette das Herz zusammen.

Ein Mangel an Federkonsistenz kann auf das Vorhandensein eines Tumors hinweisen. Verwenden Sie zum Schluss eine chirurgische Schere, um den Schädel linear zu durchschneiden. Entfernen Sie vorsichtig kleine Schädelstücke, bis das gesamte Gehirn freigelegt ist.

Ein visuelles Bewertungssystem wurde verwendet, um die Krankheit, die Verteilung und den Schweregrad der Erkrankung in fünf verschiedenen Tiergruppen zu beurteilen. Diese Gruppen zeigten ein unterschiedliches Ausmaß und eine unterschiedliche Schwere der Erkrankung. Eine zusätzliche Messung, bestehend aus biolumineszierender Bildgebung unmittelbar nach der Opferung, wurde verwendet, um mikro- und makrummetastasierende Läsionen quantitativ zu beurteilen.

Sobald beide Implantationen, Nephrektomien oder Autopsien gemeistert sind, können sie in fünf bis 10 Minuten pro Tier durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt werden. Es sollte untersucht werden, ob sich das Ansprechen auf die Behandlung zwischen den Arten von metastasierten Tumorzellen unterscheidet. Zellen aus metastasiertem Nierenzellkarzinom.

Derzeit werden Patienten verwendet, um direkt in Tiere zu implantieren, um das lokale und metastasierende Krankheitswachstum nach seiner Entwicklung zu beurteilen. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet des RCC, um klinisch relevante Krankheitsverläufe und das Ansprechen auf die Therapie zu erforschen. Insbesondere, ob sich diese Reaktionen je nach primärer lokalisierter Erkrankung oder spontanem Metastasierungswachstum unterscheiden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit winzigen Tieren, die sich mehreren Operationen unterziehen, die strikte Einhaltung der Richtlinien des institutionellen Tierprotokolls und sterile Bedingungen erfordert. Der Komfort und die Genesung der Tiere sind entscheidende Variablen, um dieses Verfahren ordnungsgemäß durchzuführen.