Komplette Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protokoll für spätere Wholemount In-situ Hybridisierung in Larven Seeneunauge
14. Oktober 2014
Neunaugen erholen Fortbewegung nach einer kompletten Rückenmarksverletzungen. Jedoch einige Rücken ragenden Neuronen sind gut Regeneratoren sind und andere nicht. Dieses Papier zeigt die Techniken für den Wohnungsbau Meerneunauge Larven (und vor kurzem umgewandelt Erwachsene), Herstellung vollständiger Rückenmarksquerschnitten erhalten und Vorbereitung wholemount Gehirn und Rückenmark für die in situ-Hybridisierung.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Durchführung einer vollständigen Rückenmarks-, Durchtrennungs- und Hirndissektion zur Untersuchung der Axonführung nach einer Verletzung. Dies wird erreicht, indem zuerst ein Lampre-Rückenmark auf Höhe der fünften Kieme durchtrennt wird. Dann wird das Gehirn präpariert und an den Syl Guard geheftet.
Nach der Fixierung des Gehirns kann es in Methanol gelagert oder sofort für die In-situ-Hybridisierung verwendet werden, die letztendlich die Expression von axonalen verändert. Leitrezeptoren sind in einem sich regenerierenden Wirbel nach einer Rückenmarksverletzung zu sehen. Der Vorteil der Technik, die wir heute demonstrieren werden, gegenüber herkömmlichen Paraffinschnitten oder Kryostatenschnitten besteht darin, dass Sie das gesamte Gehirn sehen können, einschließlich der Neuronen, die zum Rückenmark projizieren, groß und identifiziert sind.
Dr. Kathy Zang, eine Forscherin in unserem Labor, demonstriert das Verfahren aus den Bächen, die die Zuflüsse des Michigansees in den Delaware River in Pennsylvania speisen, oder von Bächen in Maine. Wildtyp-Larve der Art. Pet mize auf Marus wurden erhalten.
Vier bis 7 Jahre alte Larven sind 10 bis 14 Zentimeter lang und groß genug für die Verletzung und Zerlegung. Halten Sie sie in Gruppen von 52, hundert. In 50-Gallonen-Frischwassertanks bei 16 Grad Celsius.
Das Aquarium benötigt ein 1-Zoll-Kiessubstrat, damit sich das Neunauge ausleihen kann. Das gesamte Wasser, das dem Tank zugeführt wird, sollte mindestens 48 Stunden lang mit Holzkohlefilterung und Belüftung konditioniert werden, bevor es in das Aquarium gegeben wird. Sofern die Tiere innerhalb eines Jahres verwendet werden, ist es nicht erforderlich, sie für dieses Verfahren zu füttern. Halten Sie frisch zubereitete Ringerlösung bereit.
Übertragen Sie zuerst eine Lampe in gesättigte wässrige Benzocainlösung. Sobald es betäubt ist, geben Sie es in eine Schüssel, die zur Hälfte mit Sil Guard gefüllt ist. Stellen Sie die Schüssel auf Eis und garnieren Sie die Schüssel mit Eis.
Kalte Klingeltöne. Sichern Sie das Tier mit drei Insektennadeln mit einem Durchmesser von 0,15, eine an der Schnauze und zwei an der fünften Kieme. Positionieren Sie es dann für die Operation unter einem Stereomikroskop
.Beginnen Sie damit, mit einem Skalpell mit der Nummer 11 einen Längsschnitt entlang der dorsalen Mittellinie auf Höhe der fünften Kieme zu machen. Dadurch wird das Rückenmark freigelegt, während dieser Schnitt gemacht wird. Verwende zwei Haken aus Insektenstecknadeln, um die Körperwände mit der Castro-Laibung Nummer acht, einer Schere, zu befestigen.
Machen Sie einen senkrechten Schnitt quer durch das freiliegende Rückenmark. Untersuchen Sie die abgeschnittenen Enden des Rückenmarks, um sicherzustellen, dass die Durchtrennung abgeschlossen ist. Richten Sie dann mit einer Pinzette die abgeschnittenen Enden neu aus und schließen Sie die Wunde.
Übertragen Sie die Lampre-Lava auf ein in Ringerlösung getränktes Stück Filterpapier. Schieben Sie das Präparat für eine Stunde auf ein Eisbett, damit die Wunde nach einer Stunde trocknen kann. Füllen Sie die Lava in einen eigenen kleinen Tank mit eiskaltem Wasser.
Lass es dort 24 Stunden lang heilen. Nach 24 Stunden auf Bewegung cordal zur Durchtrennung prüfen. Wenn es Bewegungen gibt, war die Durchtrennung unvollständig.
Wenn dies nicht der Fall ist, dann war das Transekt in Ordnung und das Tier kann zur Genesung in einen Tank mit Raumtemperatur gebracht werden, während sich das Tier erholt. Wechsle das Wasser alle zwei bis drei Tage. Sobald das durchtrennte Tier ausreichend geborgen ist, betäuben Sie es und bereiten Sie es für die Sektion vor, wie zuvor beschrieben.
Um das Gehirn zu präparieren, beginnen Sie mit einem Querschnitt zwischen dem Nasenloch und der Zirbeldrüse. Beim Castro-Kalbfleisch schneidet man dann mit einer Schere das Gewebe, das das Gehirn umgibt, und sichert das Tier. Mit Pinzette.
Die weißen ovalen Strukturen auf beiden Seiten des Hirnstamms sind die otischen Kapseln. Sobald das Gehirn freigelegt ist, verwenden Sie eine Pinzette, um den Aderhautplexus zu entfernen. Verwenden Sie anschließend die modifizierten Stifthaken, um den Kopf des Tieres zu spreizen und die Hirnnerven freizulegen.
Schneiden Sie dann das Rückenmark mit der Schere quer durch, während Sie das Rückenmark mit einer Pinzette sichern. Durchtrennen Sie die Hirnnerven, um das Gehirn zu präparieren. Übertragen Sie dann das Gehirn auf ein kleines Stück Silikon und befestigen Sie es dort.
Mit einem Insektenstift im Rückenmark und einem Stift durch einen der Riechkolben. Schneiden Sie dann mit der Schere die Kommissur des Riechkolbens, die zerebrale Protektorkommissur und die Oex des Hirnstamms entlang der dorsalen Mittellinie ab. Sobald die Kommissuren und Oex geschnitten sind, lenken Sie die A LR-Platten seitlich ab und stecken Sie sie mit insgesamt sieben Insektenstiften, zwei in den Riechkolben, zwei in den Schnittkanten, zerebraler Schutzkommissur, zwei in der verlängerten Oex und eine in der Mittellinie des Rückenmarks flach auf das Silikon
.Fixieren Sie nun das Präparat unter Verwendung von RNA-freien Reagenzien drei Stunden lang unter leichtem Rühren in 4%-para-Formaldehyd bei Raumtemperatur. Die Gehirne können dann durch in situ zwei Hybridisierungen mit der beschriebenen Methode analysiert werden. Die Expression von Neogen in Transkripten wurde im Rückenmark, projizierenden Neuronen der Kontrolle, bei Tieren und bei Tieren identifiziert. Zwei Wochen nach der Läsion, hier ist eine repräsentative unverletzte Kontrolle zu sehen.
Nach der vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks kam es zu Veränderungen in der Expression des Neogenrezeptors. Nach zwei Wochen wurde der Neogenrezeptor in der Nicht-Kontrolle bevorzugt in schlechten Regeneratoren wie den M1 I eins I zwei I vier oder MTH Neuronen exprimiert. Die Entwicklung dieser Technik ebnete den Weg für unsere Fähigkeit, die Expression von Leitrezeptoren, Rezeptoren für Chondroitinsulfat, Protio, Glykane und die Aktivierung von gegossenen Basen im selben Gehirn zu erforschen.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie demonstriert Techniken zur Durchführung vollständiger Quersektionen des Rückenmarks und zur Gehirndissektion bei Meeresneunaugen. Sie zeigt die Wiederherstellung der Lokomotion nach einer Rückenmarksverletzung sowie die Regenerationsfähigkeit spezifischer, das Rückenmark projizierender Neuronen auf.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Regenerative Biologie
- Verletzungsreaktion
Hintergrund
- Meeresneunaugen können die Fortbewegung nach einer vollständigen Rückenmarkverletzung wiedererlangen.
- Einige spinale Projektionsneurone weisen gute regenerative Eigenschaften auf.
- Das Verständnis der Axonführung nach Verletzung ist entscheidend, um Einblicke in die Regeneration des Rückenmarks zu gewinnen.
- Diese Studie nutzt In-situ-Hybridisierungstechniken zur Analyse.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Mechanismen der Axonführung nach einer Verletzung des Rückenmarks.
- Veranschaulichung von Techniken zur Durchtrennung des Rückenmarks und zur Gehirndissektion.
- Analyse von Veränderungen in der Expression axonaler Führungsrezeptoren.
Verwendete Methoden
- Vollständige Quersektion des Rückenmarks auf der Höhe des fünften Kiemens.
- Präparation des Gehirns und Fixierung zur Analyse.
- Lagerung der Gehirnproben in Methanol oder unmittelbare Verwendung für die In-situ-Hybridisierung.
- Ganzpräparat-Herstellung zur Visualisierung großer identifizierter Neurone, die zum Rückenmark projizieren.
Hauptergebnisse
- Nachgewiesene Wiederherstellung der Lokomotion bei Lampreten nach Verletzung.
- Identifizierung von Unterschieden in der Regenerationsfähigkeit bei spinal projizierenden Neuronen.
- Belegte Veränderungen in der Expression von axonalen Leitungsrezeptoren bei regenerierenden Wirbeltieren.
- Hervorhebung der Vorteile von Ganzpräparat-Methoden gegenüber traditionellen Schnitttechniken.
Schlussfolgerungen
- Die vorgestellten Techniken liefern wertvolle Erkenntnisse zur Regeneration des Rückenmarks.
- Das Verständnis der Neuronenregeneration kann zukünftige therapeutische Strategien maßgeblich beeinflussen.
- Ganzpräparate ermöglichen eine umfassende Analyse neuronaler Verbindungen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die mechanistische Entschärfung von Zielstrukturen für die Axonregeneration, indem es ein krankheitsbezogenes System zur Untersuchung intrinsischer neuronaler Reaktionen auf eine Rückenmarksverletzung bereitstellt. Die Ganzpräparat-Präparation unterstützt die Zielstruktur-Validierung durch direkte Visualisierung großer, identifizierbarer, ins Rückenmark projizierender Neuronen und erleichtert somit die vergleichende Genexpressionsanalyse zwischen guten und schlechten Regeneratoren. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem molekulare Phänotypen mit funktionellen Regenerationsresultaten in einem Wirbeltier-CNS-Modell verknüpft werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch den Vergleich von Genexpressionsprofilen zwischen funktionell unterschiedlichen Neuronenpopulationen.
- Operationaler Wert: Bietet ein reproduzierbares Verfahren zur Isolierung und Analyse spezifischer neuronaler Subtypen, die mit dem Scheitern oder Gelingen der Regeneration assoziiert sind.
- Strategischer Wert: Unterstützt die Priorisierung von Zielstrukturen durch die Identifizierung molekularer Signaturmuster, die mit regenerativer Kapazität verknüpft sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme zur quantitativen Beurteilung von Veränderungen der axonalen Leitungsrezeptor-Expression nach Verletzung vor.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Ganzpräparat-Herstellung des ZNS für konsistente In-situ-Hybridisierungsergebnisse über verschiedene experimentelle Bedingungen hinweg.
- Strategischer Wert: Ermöglicht die skalierbare Untersuchung von Leitungsrezeptoren, Chondroitinsulfat-Rezeptoren und verwandten Zielstrukturen auf einer einzigen Plattform.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Etabliert die Krankheitsrelevanz, indem die Dynamik von Verletzungen und Regeneration im zentralen Nervensystem von Wirbeltieren am Beispiel des Meeresneunauges modelliert wird.
- Operationaler Wert: Gewährleistet eine translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch eine konsistente Ganzpräparat-Herstellung.
- Strategischer Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem die Mechanismen von Axonleitpfaden entrisikot werden können.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung, indem sie molekulare Messgrößen bereitstellt, die Aufschluss über Strategien zur Modulation von Signalwegen geben.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen, indem sie einen direkten Vergleich der Genexpression in identifizierten regenerierenden und nicht-regenerierenden Neuronen ermöglicht.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays durch standardisierte Ganzpräparat-Präparation, die mit multiplex in situ Hybridisierung für axonale Leitungsrezeptoren kompatibel ist.
- Analytik: Erzeugt quantitative, räumliche Aussagen über Veränderungen in der Rezeptorexpression, die es Teams ermöglichen, molekulare Verschiebungen mit phänotypischen Regenerationsergebnissen zu korrelieren.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität durch ein Wirbeltier-CNS-Verletzungsmodell, das funktionelle Erholung und proximale Axonregeneration aufweist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung mehrerer Familien von Leitungsrezeptoren (z. B. Neogen, Chondroitinsulfat, Proteoglykane) im selben neuronalen Kontext.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unklarheiten in den Wegen der Axonregeneration durch direkte Auflösung auf neuronaler Ebene reduziert werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit der neuronalen Dissektion und Fixierung für nachgeschaltete molekularbiologische Analysen.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch frühzeitige biomolekulare Hinweise auf Targetbindung in regenerationsfähigen Neuronen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Axonleitungszielen basierend auf Expressionsdynamiken in validierten neuronalen Populationen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in mikrochirurgischen Techniken für die Quersektion des Rückenmarks und die Gehirndissektion bei larvalen Meeresneunaugen.
- Setzt den Zugang zu Stereomikroskopie, Insektennadeln, Silikonuntergründen und RNase-freien Reagenzien für die Ganzpräparat-Herstellung und -Fixierung voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei Anästhesie, Erholung und Fixierungsprotokollen, um eine gleichbleibende Gewebequalität sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Übertragen der Protokolle auf verschiedene Entwicklungsstadien oder Arten aufgrund von Unterschieden in der Anatomie und Größe des zentralen Nervensystems.
- Ist durch das 24-Stunden-Fenster nach der Verletzung begrenzt, das zur Bestätigung einer vollständigen Durchtrennung vor Fortsetzung mit Erholung und Dissektion erforderlich ist.
