Nicht-invasive Bildgebung und Analyse der zerebralen Ischämie in lebenden Ratten mit Hilfe der Positronen-Emissions-Tomographie mit

Das übergeordnete Ziel dieses kollaborativen Projekts besteht darin, Veränderungen in der Verteilung einer radioaktiven Glukose-Sonde im Gehirn von Ratten vor und nach einem Schlaganfall abzubilden. Dies wird erreicht, indem bei Ratten eine zerebrale Ischämie mittels Okklusion der Arteria cerebri media ausgelöst wird. Im nächsten Schritt wird der Fluordesoxyglukose-Radiotracer injiziert und Positronenemissionstomographie-Aufnahmen gewonnen.

Der letzte Schritt besteht darin, die Daten mithilfe einer auf das Rattenhirn anatomisch koregistrierten zerebralen Volumenvorlage zu analysieren. Letztendlich kann die PET-Bildgebung bei Ratten, die eine zerebrale Ischämie durchlaufen, verwendet werden, um regionale Unterschiede in der Aufnahme von Radioaktivitätsmarkern wie Fluor-Desoxyglukose während longitudinaler Studien zum Krankheitsverlauf zu messen. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie Sektion und Histologie liegt darin, dass die PET-Bildgebung nichtinvasiv ist und in longitudinaler Weise eingesetzt werden kann, um Behandlungen und den zeitlichen Verlauf eines Schlaganfalls zu untersuchen.

Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten, das Tier-Stroke-Modell zu etablieren. Die Verwendung anatomischer Orientierungspunkte wie der Arteria carotis interna und externa erleichtert das Vorgehen erheblich. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um die VOI-Analyse durchzuführen, die durch die Fusion des PMOD-Hirn-Atlas-Templates mit den zerebralen PET-Daten der untersuchten Probe ermöglicht wird.

Der Chirurg sollte nach der Vorbereitung des Bereichs in saubere sterile Handschuhe wechseln und sterile Instrumente verwenden. Verwenden Sie für diese Studie männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 220 und 270 Gramm und beginnen Sie mit der Durchführung einer PET- und CT-Aufnahme vor der Operation. Um eine Basislinie für die F-18-FDG-Aufnahme zu erhalten, werden die Ratten mit 2,5 % Isofluran über eine Nasenkappe anästhesiert.

Danach das Tier in Rückenlage auf eine Heizplatte legen und mithilfe eines Zehenzwickens sicherstellen, dass es vollständig anästhesiert ist. Anschließend die Vorderbeine fixieren. Danach die dorsale Halsregion des Tieres rasieren und die rasierte Fläche mit 70 % Ethanol und danach mit einer 10 %igen Povidon-Iodin-Lösung vorbereiten.

Jetzt mit einer Schere einen zwei bis 2,5 cm langen Schnitt 0,5 cm rechts neben und parallel zur Luftröhre anlegen. Anschließend mittels stumpfer Dissektion die Arteria carotis communis lokalisieren und Retraktoren verwenden, um die Darstellung des Gefäßes zu erleichtern. Sobald identifiziert, einen Mikroclips auf die Arteria carotis communis setzen. Danach den ersten Abzweigpunkt finden, der aus der Arteria carotis externa (ECA) sowie der Arteria carotis interna (ICA) besteht, und kleinere an der A. carotis externa anhängende Äste wie die Arteria occipitalis unter Zuhilfenahme von Elektrokoagulation abtrennen.

Danach die A. carotis externa nahe der Abzweigung zur Schilddrüsenarterie mit einer 4-0-seidenen Naht ligieren, wobei ausreichend Länge belassen wird, damit die Naht mit Hämostatten fixiert werden kann. Um die Nähte mit den Hämostatten zu klemmen, die A. carotis externa leicht ziehen, sodass sie parallel zur Arteria carotis communis liegt. Anschließend die A. carotis externa oberhalb der Naht elektrisch koagulieren.

Als Nächstes die A. carotis interna lokalisieren und mit einer weiteren Mikroklammer verschließen. Anschließend mit kleinen Feder-Scheren ein kleines Loch in die A. carotis externa schneiden. Den Okkluder einführen und eine Naht darum anlegen, um den Blutfluss zu unterbinden.

Entfernen Sie nun die Mikroklemme an der Arteria carotis interna und schieben Sie den Okkluder vorwärts, bis ein Widerstand spürbar ist. Achten Sie darauf, dass der Okkluder in die Arteria carotis interna und nicht in die Arteria palatina descendens vorrutscht. Entfernen Sie anschließend die Mikroklemme an der Arteria carotis communis und schneiden Sie überschüssigen Okkluder oder Faden ab.

Verwenden Sie dann Wundklammern mit neun Millimeter, um den Hautschnitt zu schließen. Entfernen Sie das Tier von der Narkose und lassen Sie es aufwachen. Führen Sie anschließend 1,5 Stunden nach dem Schlaganfallverfahren nach zwei Stunden eine PET-CT-Untersuchung durch.

Betäuben Sie die Ratte erneut vollständig mit Isofluran und entfernen Sie die Wundhaken. Suchen Sie dann das Ende des Okkluders und ziehen Sie ihn vorsichtig aus der Arteria cerebri media, bis die weiße Spitze des Okkluders mit den Nähten in Kontakt kommt. Ziehen Sie ihn jedoch nicht vollständig heraus, da dies zu Blutungen führen würde.

Entfernen Sie abschließend die Wundklammern. Danach entfernen Sie das Tier aus der Narkose und lassen es aufwachen. Scannen Sie das Tier anschließend erneut, 24 Stunden nach der Reperfusion.

Um die Schädigung des Gehirngewebes aufgrund eines Schlaganfalls zu quantifizieren. Wie bereits erwähnt, sollte das Tier vor der Induktion des Schlaganfalls gescannt werden. Anschließend 1,5 Stunden nach dem Schlaganfall und schließlich 26 Stunden nach dem Schlaganfall.

Um Schädigungen des Hirngewebes aufgrund eines Schlaganfalls vor der Bildgebung zu quantifizieren, betäuben Sie die Ratte unter 2,5 % Isofluran-Gas in einer Narkosekammer. Injizieren Sie anschließend etwa 500 Mikrocurie Fluordesoxyglukose in die Schwanzvene. Lassen Sie die Ratte nach einer Stunde aus der Narkose aufwachen.

Dann zur Bildgebung erneut anästhesieren. Legen Sie die anästhesierte Ratte auf ein Standard-Rattenbett mit einer Nasenkappe für die ISO-Fluoranästhesie. Messen Sie den Abstand in Millimetern zwischen der Nase der Ratte und der Kante des Bettes und notieren Sie diesen als horizontalen Versatz.

Als Nächstes bringen Sie das Tier in den Scanner und richten Sie die Studie ein, einschließlich horizontaler Offset-Tierwichtinjektion, Verbindungsdosis, Zeit und Datum. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche „Studie starten“, um den Scan zu beginnen, und rekonstruieren Sie die Daten, sobald der Scan abgeschlossen ist. Führen Sie die hier beschriebene Bildanalyse mit der PMOD-Analyse-Software in Verbindung mit dem W-Schiffer-Hirn-Atlas durch.

Beginnen Sie damit, zum manuellen Co-Registrierungs-Tab oben auf dem Bildschirm zu navigieren. Wählen Sie anschließend den Schnitt-Tab aus. Verwenden Sie dann das offene weiße Rechteck, um die Mikro-PET-Scans und das ausgefüllte weiße Rechteck zu drehen.

Um die Mikro-PET-Aufnahmen zu verschieben, richten Sie die beiden Aufnahmen aus, indem Sie markante Merkmale wie die harten Drüsen sowie die oberen und hinteren zerebralen Strukturen lokalisieren, die verwendet werden können, um die Mikro-PET-Aufnahme mit dem Gehirnmodell zu vergleichen. Anschließend passen Sie die Mikro-PET-Aufnahme so an, dass sie mit dem Gehirn-Atlas übereinstimmt. Falls erforderlich, drehen Sie die Mikro-PET-Aufnahme in der koronalen Ansicht um 180 Grad und heben Sie die Aufnahme in der sagittalen Ansicht deutlich an, zusammen mit weiteren geringfügigen Orientierungsanpassungen.

Navigieren Sie anschließend zum Vollbild-Fusion-Tab. Wählen Sie oben rechts auf dem Bildschirm Quelle A aus. Danach navigieren Sie zum Vorlagen-Atlas.

Ganz unten auf der Seite Ratte im Dropdown-Menü auswählen. Optional kann man zur manuellen Ko-Registrierungs-Registerkarte zurückkehren, wo der Atlas überlagert auf einem Gehirn-Atlas erscheinen sollte. Der Atlas kann helfen, den Mikro-PET-Scan und den Gehirn-Atlas nach der Ausrichtung zu justieren.

Zurück zum Vollbild-Fusion-Tab. Eine Vorlage erscheint auf dem Gehirn, die anzeigt, welche Bereiche des Gehirns für die VOI-Statistiken gemessen werden. Wählen Sie nun oben rechts auf dem Bildschirm Quelle B aus.

Danach die Schaltfläche „VOI-Statistik“ auswählen. Die angezeigte Tabelle speichern, indem man „Speichern“ und dann „Speichern im Dateisystem“ auswählt. Im Feld Dateiname den gewünschten Dateinamen eingeben.

Die anschließende Bildanalyse kann mithilfe dieser Daten durchgeführt werden, um die Daten zu visualisieren und Bildsequenzen mit der Vol-View-Bildgebungssoftware zu erstellen. Weitere Einzelheiten zu den Analysen und Visualisierungsschritten finden Sie im Manuskript, das diesem Video beiliegt. Repräsentative Bildgebungsdaten von PET- und Röntgen-CT-Aufnahmen werden hier für eine Ratte zu den Zeitpunkten 24 Stunden vor und 24 Stunden nach der Reperfusion gezeigt. Zu dem Zeitpunkt von 24 Stunden zeigte sich ein dramatischer Rückgang der Glukoseaufnahme in der ipsilateralen Hemisphäre, was auf umfassende Gewebeschäden aufgrund des induzierten ischämischen Schlaganfalls hindeutet.

Weiße Pfeile zeigen die Lokalisation einer verminderten FDG-Aufnahme aufgrund von Schlaganfallschäden an. Hier sehen wir die FDG-PET-Daten einer Ratte 24 Stunden nach der Perfusionsunterbrechung, die mit dem VOI-Gehirn-Template-Atlas fusioniert wurden. Zur Analyse deuten schraffierte Farben die einzelnen VOIs des Gehirn-Template-Atlanten an.

Abschließend sehen wir hier die Verhältnisse der FDG-PET-Signale der rechten zur linken Hemisphäre sowie die standardisierten Aufnahme-Einheiten aus den einzelnen Regionen des W-Schiffer-Rattenhirn-Atlas, angegeben für Scans vor dem ischämischen Schlaganfallereignis sowie 1,5 Stunden und 24 Stunden nach der Reperfusion. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein solides Verständnis dafür haben, wie man ein Modell der zerebralen Ischämie bei Ratten etabliert, FDG-PET-Bildgebungen an den Tieren durchführt und einen Hirn-Template-Atlas nutzt, um eine stringente VOI-Analyse der Daten durchzuführen.