Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, funktionell aktivierende Liganden von Orphan G-Protein-gekoppelten Rezeptoren oder G-PCRs zu identifizieren. Dies wird durch die transiente Transektion von A-G-P-C-R von Interesse und die Durchtrennung eines promiskuitiven G alpha 16-Konstrukts in einem zellulären Expressionssystem erreicht, um eine vorübergehende heterologe Expression beider Proteine zu erhalten. In einem zweiten Schritt werden die transfizierten Zellen mit dem kalziumsensitiven Farbstoff flu oh four beladen, der die Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern durch eine Erhöhung des Fluoreszenzsignals bei Kalziuminteraktion nachweist.

Als nächstes wird der fluoreszenzbasierte Kalziummobilisierungsassay durchgeführt, indem der heterologe exprimierte Rezeptor mit einer Verbindungsbibliothek von Kandidatenliganden herausgefordert wird, um Verbindungen zu bestimmen, die den Rezeptor aktivieren und eine intrazelluläre Signalkaskade auslösen, die zur Freisetzung von Kalzium aus dem endoplasmatischen Retikulum führt, das als Fluoreszenzsignal gemessen werden kann. Es werden Ergebnisse erhalten, die eine Konzentrationsreaktionskurve mit der halbmaximalen effektiven Konzentration eines aktivierenden Liganden zeigen, die auf der Detektion unterschiedlicher Fluoreszenzsignale in Abhängigkeit von den dem zellulären Expressionssystem verabreichten Ligandenkonzentrationen basiert. Der Hauptvorteil der transienten Transfektion zur Erzielung einer temporären Expression Ihres GPCR gegenüber der Verwendung stabiler klonaler Zelllinien besteht darin, dass die zeitaufwändige Etablierung solcher stabil transfizierten Zelllinien nicht erforderlich ist.

Die Transfektion der promiskuitiven G-alpha-16-Untereinheit kann den intrazellulären Signalweg der meisten GPCRs in Richtung der Freisetzung von Kalzium umleiten, unabhängig vom nativen Signalweg in endogenen Umgebungen. Als solcher ermöglicht dieser Aufbau ein Screening von Hunderten von Verbindungen auf GPCRs von Interesse in kurzer Zeitspanne, was zeigt, dass das Verfahren gelbes Gas sein wird, ein Doktorand und Nick Su, ein Techniker aus unserem Labor Züchten Sie die HEK 2 93 T-Zellen in T 75-Kolben drei Tage bevor der eigentliche Kalziummobilisierungsassay stattfindet, Durchgang der Zellen, wenn ein Zusammenfluss von 80% erreicht ist. Es wird ein T 75-Kolben für die Transfektion mit dem Rezeptorkonstrukt und ein Kolben für die Transfektion mit einem leeren Expressionsvektor als Negativkontrolle vorbereitet.

Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius in einem mit 5 % CO2 befeuchteten Inkubator für 20 bis 24 Stunden, bis sich die Zellkulturen einer Konfluenz von 50 bis 70 % nähern, wie hier gezeigt. Als nächstes fügen Sie 3,9 Mikrogramm des Rezeptorkonstrukts oder leeren Vektors und 3,9 Mikrogramm des G alpha 16-Expressionskonstrukts in ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen hinzu. Fügen Sie 500 Mikroliter des Jet-Prime-Puffers hinzu.

Gut mischen, indem man die Tube vortext und dann kurz schleudert. Geben Sie dann 37,5 Mikroliter des Jet Prime Reagenz-Wirbels hinzu und drehen Sie ihn eine Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit herunter. Inkubieren Sie die Transfektionsmischung 10 Minuten lang.

Bei Raumtemperatur wird eine Zellpopulation als transfiziert mit dem Expressionsvektor markiert, wobei der interessierende GPCR und das G alpha 16-Konstrukt kodiert werden, und der zweite Kolben mit dem leeren Vektor und dem G alpha 16-Konstrukt. Nach der Inkubation geben Sie die Transfektionsmischung tropfenweise in das Zellkulturmedium, wobei Sie darauf achten, dass Sie direkt in das Medium pipettieren und den Kontakt mit den Wänden des Kulturkolbens vermeiden. Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius in einem 5%CO2-befeuchteten Inkubator für 20 bis 24 Stunden für den Kalziummobilisierungsassay.

Die transfizierten Zellen werden gesammelt und in 96 Zellen ausgesät. Nun, schwarz gewandte, durchsichtige Bodenplatten. Beschichten Sie die Platten zunächst mit 60 Mikrolitern pro Vertiefung bei Raumtemperatur.

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Fibronektin. Inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit geschlossenem Deckel. Nehmen Sie die Lösung aus den Vertiefungen und inkubieren Sie die Platten erneut eine Stunde lang ohne Deckel bei Raumtemperatur.

Entferne in der Zwischenzeit das alte Wachstumsmedium von den Zellen. Spülen Sie abgestorbene Zellen mit drei Millilitern PBS ab und entfernen Sie das PBS. Fügen Sie dann drei Milliliter PBS-Tryin-EDTA bei Raumtemperatur hinzu und inkubieren Sie eine Minute lang, bevor Sie die Lösung entfernen.

Zu diesem Zeitpunkt ändert sich die Morphologie der Zellen von sternförmig zu kugelförmig. Lösen Sie die Zellen durch leichtes Klopfen vom Boden des Kolbens und sammeln Sie sie durch mehrmaliges Spülen mit 10 Millilitern Raumtemperatur. DM em Transfermedium.

Übertragen Sie die Zellen in ein 50 Milliliter Falkenröhrchen. Um die Anzahl der Zellen pro Milliliter zu zählen, geben Sie 100 Mikroliter der Zellkultur in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter Lysepuffer hinzu und mischen Sie, indem Sie auf das Röhrchen klopfen.

Zum Schluss 100 Mikroliter stabilisierenden Puffer hinzufügen und durch Klopfen mischen. Füllen Sie eine Nukleokassette mit der Zellsuspension und zählen Sie die Zellen mit dem Zähler. Die Nucleo View-Software multipliziert automatisch die Anzahl der Zellen mit drei, da die Zellen um den Faktor drei verdünnt wurden.

Bei der Zugabe des Lyse- und Stabilisierungspuffers verdünnen Sie die Zellen auf eine Endkonzentration von 600.000 Zellen pro Milliliter und säen Sie 150 Mikroliter der Zellen pro Vertiefung in die beschichteten Platten. Um eine Zelldichte von etwa 90.000 Zellen pro Vertiefung zu erhalten, vermeiden Sie Luftblasen und klopfen Sie auf die Platte, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Um eine zusammenhängende Zellschicht zu erhalten, inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius in einem 5%CO2-befeuchteten Inkubator für 16 bis 24 Stunden.

Entsorgen Sie das Medium aus den Zellen. Waschen Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern PBS pro Vertiefung und entfernen Sie das PBS. Beachten Sie, dass alle folgenden Schritte, die Operationen mit den Zellen beinhalten, im Dunkeln durchgeführt werden sollten, da die Zellen von diesem Zeitpunkt an mit dem Fluor-Vier geladen werden.

Fügen Sie 55 Mikroliter Ladepuffer pro Vertiefung hinzu, wickeln Sie die Platte in Aluminiumfolie ein, um eine Lichteinwirkung der Platte zu verhindern, und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Verwenden Sie anschließend Waschpuffer, um die getrockneten Peptide in silikonisierten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu lösen. Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe vor, um eine Konzentrations-Wirkungs-Analyse durchzuführen und den EC 50-Wert eines Liganden zu bestimmen.

Denken Sie daran, dass 50 Mikroliter eines Liganden aus der Verbindungsplatte während des Assays in eine Vertiefung mit 100 Mikrolitern Waschpuffer auf der Zellplatte überführt werden, bereiten Sie die Verbindungen also auf das Dreifache ihrer gewünschten Endkonzentration vor. Als nächstes fügen Sie 70 Mikroliter des Liganden in die entsprechende Vertiefung der Verbindungsplatte in dreifacher Ausfertigung hinzu. Fügen Sie positive und negative Kontrollen auf jeder Platte hinzu.

Entsorgen Sie den Ladepuffer von der Zellplatte und geben Sie 100 Mikroliter Waschpuffer in jede Vertiefung, um Lichteinwirkung zu verhindern. Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Waschpuffer von der Zellplatte und fügen Sie jeweils 100 Mikroliter neuen Waschpuffer hinzu.

Inkubieren Sie die Zellplatte, die Verbundplatte und ein Spitzengestell 15 Minuten lang. Bei 37 Grad Celsius die gewünschte Protokolldatei mit der Software erstellen und laden und hier das Temperiergerät für die Lesekammer aktivieren. Die Kalziumreaktionen werden zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius gemessen, Reihe für Reihe mit einem Intervall von 1,52 Sekunden zwischen aufeinanderfolgenden Messwerten bei 525 Nanometern.

Stellen Sie die Anregung der Grippe oh vier auf 488 Nanometer ein und übertragen Sie ein Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern der Verbindung auf die Zellplatte. 18 Sekunden nach der Ablesung. Beginnen Sie mit einer Dosiergeschwindigkeit von 26 Mikrolitern pro Sekunde und einer Pipettenhöhe von 135 Mikrolitern.

Positionieren Sie die Compound- und Cell-Platte sowie das Spitzengestell in den entsprechenden Schubladen des Stationsgeräts. Führen Sie eine einmalige Ablesung der Zellplatte bei derselben Anregungs- und Emissionswellenlänge im Endpunktmodus durch, bevor Sie den eigentlichen Bildschirm im Flex-Modus starten. Starten Sie den Assay und fahren Sie mit der Analyse der Daten mit der abgebildeten Software fort.

Hier sind Diagramme, die einer von drei Repliken der Doofus-Short-NPF-Konzentrationsreihe entsprechen. Die Negativkontrolle induzierte kein Fluoreszenzsignal. Während die Positivkontrolle eine starke Aktivierung des endogenen Protease-aktivierten Rezeptors auslöste, führte der erste zu einem hohen Fluoreszenzsignal.

Die Software ermöglicht die Eingabe von Formeln, um unter anderem den Prozentsatz der Aktivierung oder die Standardfehler der verschiedenen Konzentrationen zu bestimmen. Die resultierenden Daten werden verwendet, um vorläufige Konzentrationsreaktionskurven zu erstellen, um die EC 50-Werte zu schätzen, wie sie für die vier kurzen NPF-Peptide der Speiseröhre gezeigt wurden. Die Kurven enthalten auch die Daten für die Negativkontrolle, bei der die Konzentrationsreihen der kurzen NPF-Peptide von Drosophila an Zellen getestet wurden, die mit einem leeren Vektor transfiziert wurden.

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Zugabe der Peptide zu diesen Zellen keinen Einfluss auf endogene Rezeptoren hat, sondern den interessierenden Rezeptor aktiviert. Es wurden vorläufige Konzentrationsreaktionskurven des fluoreszenzbasierten Calciummobilisierungsassays durchgeführt und die getesteten Konzentrationen angepasst, um den dynamischen Bereich der Kurve abzudecken. Die EC-50-Werte von Drosophila short npf 1, 2, 3 und vier sind ähnlich, was darauf hindeutet, dass sie nach diesem Verfahren gleich stark sind, um den Rezeptor zu aktivieren.

Andere Methoden wie Strukturaktivität, Beziehungsstudien können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Aminosäuren des Peptids für die Rezeptoraktivierung entscheidend sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine auf dem Fluer-Sinn basierende Kalziummobilisierung durchführen, um funktionell aktivierende Liganden von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu identifizieren. Dies beinhaltet die Aufrechterhaltung der solaren Expressionssysteme, gefolgt von der Transgender-Transfektion des Zellsystems durch den interessierenden Rezeptor.

Nach der starren Calciummobilisierung kann ein Assay stattfinden.