Name: Subtyp-selektive Elektroporation kortikaler Inter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Erfahren Sie die subtyp-selektive Elektroporation kortikaler Interneuronen in der sich entwickelnden Maus-Vorderhirn. Diese Methode ermöglicht gezielte Genexpression in spezifischen Interneuronen-Subtypen für die Entwicklungsneurobiologie.

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Wir sind dankbar, dass Lihong Yin für technische Unterstützung. NVD ist ein Empfänger einer NARSAD Young Investigator Award und wird auch durch Zuschüsse aus NIH (5 K99 MH095825-02) unterstützt. Forschung im Labor Fishell wird durch das National Institute of Health, National Institute of Mental Health (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (5 R01 NS081297-02 unterstützt, 1 P01 NS074972 -01A1) und der Simons Foundation.

Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften und Richtlinien des Institutional Animal Care und Use Committee der New York University School of Medicine behandelt. Mausstämme Swiss Webster-Mäuse von weiblichen TACONIC bereitgestellt wurden für diese Experimente verwendet. Um gezielt oberflächliche Schicht Inter wurden E15.5 Embryonen verwendet. Hinweis: Die in dieser Arbeit (Dlx5 / 6.eGFP Plasmid 3 ug / ul) wurde unter Verwendung von Standardtechniken erzeugt Klonen verwendete Plasmid. Die eGFP-cDNA wurde in einer Dlx5 / 6-Pmin-Poly-A-Plasmid kloniert. Dieses Plasmid ist auf Anfrage erhältlich (demarn02@nyumc.org). 1. Herstellung der Mikroinjektion Pipetten <ol><li> Stellen Sie den Abzieher Heat # 2-860. </li><li> Ort und sichern die Glaskapillare in der Nähe des Filaments. Überprüfen Sie, dass der Außendurchmesser (OD) der Pipette ist in etwa 30 um. </li><li> Drücken Sie die Taste &quot;Pull&quot;. </li><li> Die Kapillare vorsichtig entfernen. Der untere Teil ist die Nadel. Entsorgen Sie den oberen Teil. </li></ol> 2. Anästhesieverfahren <ol><li> Bereiten Sie eine Isofluran enthaltenden Kammer. Hinweis: Isofluran ist die bevorzugte Betäubung, durch die schnelle Wirkung und geringe Inzidenz von Nebenwirkungen. Pentobarbital ist eine weitere Option; jedoch ist die Toleranz dieser Droge variabel und kann auf eine höhere Mortalität als Isofluran führen. </li><li> Stellen Sie den Durchfluss von Isofluran zu 4-5% in 0,5-1 l / min O 2. </li><li> Stellen Sie sicher, dass das Ventil für die Kammer ist offen, während die Ventiladapter für den Kopf ist geschlossen. </li><li> Platzieren Sie die Maus schwanger in der Kammer. </li><li> Lassen Sie die Maus, um unter der Wirkung der Narkose zu gehen. Dies wird etwa 2-3 Minuten dauern. Überprüfen Sie die Atemfrequenz. Wenn die Maus beginnt zu hyperventilieren, senken Sie die Dosis von Isofluran. </li><li> Nachdem die Maus betäubt, umgehend entfernen es aus der Kammer. Legen Sie sie Bauchseite auf dem Heizkissen und ichnsert den Kopf in der Maske, die weiterhin in der gesamten Chirurgie Isofluran versorgen wird. Stellen Sie sicher, um den Fluss von Isofluran aus der Kammer in den Schlauch verbindet den Kopf Adapterstück zu wechseln. Geben Sie einen Tropfen Augen Schmiermittel in jedes Auge und schließen Sie die Augen. </li><li> Stellen Sie das Heizkissen auf 36 ° C Grad zu Unterkühlung zu minimieren. </li><li> Prüfen Sie, ob das Fehlen von Fuß und Schwanz Reflexe durch Kneifen Sie die hinteren Pfoten und den Schwanz. </li></ol> 3. Chirurgie <ol><li> Reinigen Sie die Haut, die den Bauch mit 70% Ethanol. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Haut nach oben ziehen. Nach jeder Operation, waschen alle Instrumente mit Reinigungsmittel und Wasser, und bei 72 ° CO / N sterilisiert. </li><li> Einen kleinen vertikalen Einschnitt (ca. 2 cm) entlang der Mittellinie ausgehend mittig zwischen der dritten und vierten Paare von Brustdrüsen. Verwenden Sie Fein Chirurgie Schere. Achten Sie auf die Bauchwand nicht beschädigen. </li><li> Trennen die Haut sanft von dem Bauchfell. </li><li> Visualisieren Sie die Arterienund Venen an der Bauchwand. Machen Sie eine weitere 2 cm vertikalen Schnitt durch die Bauchfell (Vermeidung der Gefäße), um die Bauchhöhle aus. </li><li> Klemmen Sie die Haut und Bauchwand auf jeder Seite die Vermeidung von Einklemmen der Arterien. Hinweis: Wenn die Arterien versehentlich punktiert, opfern das Tier sofort, indem Genickbruch oder Isofluran Überdosis. </li><li> Vor erwärmen die sterile PBS auf 37 ° C. Decken Sie die Klemmen mit PBS feucht Kim wischt. </li><li> Befeuchten die freiliegenden Bauchhöhle mit PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt mehrmals während der Durchführung der Operation. </li><li> Verwendung von Rundzangen, ziehen Sie den embryonalen Kette (E15.5) weg von der Kavität. Lassen Sie die Kette auf den Rest Feuchttücher. Starten, indem die eine Hälfte der Gebärmutter zuerst. Sobald die Embryonen in ihr elektroporiert werden, bringen sie zurück nach innen, dann auf der zweiten Hälfte zu arbeiten. </li></ol> 4. Elektroporation <ol><li> Weiter Rundzange verwenden, um die Embryonen zu manipulieren. </li><li> Visualize die lateralen Ventrikel. Die lateralen Ventrikel entlang der Mittellinie (Abbildung 1b) laufen. </li><li> Hinzufügen Fast Green (Lager: 10% w / v) zu der DNA-Lösung 1:20 Mischung, um sie während der Injektion zu visualisieren. Bereiten Sie die DNA-Lösung durch Auflösen der aus einem Standard-Maxi-Prep-Reinigungsprotokoll in destilliertem Wasser erhaltenen Pellets. </li><li> Verwenden Sie vor gezogen Mikropipetten mit einem Stempel zu injizieren 1 ml DNA-Lösung (Dlx5 / 6-eGFP, 3 ug / ul) mit Fast Green. Schneiden Sie die Spitze der Mikropipette mit einer feinen Pinzette # 5 (Dumont) bis 6 mm Länge vom Anfang der Schulter bis zum Ende der Spitze der Nadel zu verlassen, bevor das Laden der Pipette. Halten Sie den Kopf des Embryos mit runden Pinzette. In das Gehirn mit der Pipette in einem 45 ° Winkel mit dem Ziel für den lateralen Ventrikel in der Nähe der Mittellinie angeordnet ist. Wenn die Nadel durch die Herzkammer dringt, langsam zurückziehen der Pipette, wie Sie den Kolben verwenden, um DNA zu injizieren. Der Ventrikel wird grün, wenn dieLösung beginnt, es zu füllen. An diesem Punkt nicht mehr bewegen die Pipette und spritzen 1 ml DNA. Sanft, ziehen Sie die Pipette. </li><li> Stellen Sie die CUY21 Elektroporator zu fünf 45V Impulse von 50 ms von 950 msec Abstand. </li><li> Verwenden Sie 5 mm Paddelelektroden für E15.5 Embryonen. Tauchen Sie die Elektroden in PBS, um eine effiziente Stromübertragung zu gewährleisten. </li><li> Platzieren Sie die Elektrode Paddel um den Kopf des Embryos mit der positiven Paddel auf der Herzkammer, die die DNA-Lösung. Leicht senken die positive Paddel mit Bezug auf die negative, eine ventrale Strom durch die Ganglien Eminenzen erstellen. Diese Manipulation wird ektopische Expression in Pyramidenzellen zu minimieren. </li><li> Nach der Platzierung der Elektroden, liefern einen Impuls, indem Sie das Fußpedal einmal. </li><li> Entfernen Sie die Elektroden und wischen Sie sie sauber. Wiederholen Sie die Schritte 4,6-4,9 mit jedem Embryo. </li><li> Nach Elektroporation alle Embryonen, pour 3 ml PBS in die Bauchhöhle und bringt sie in die Bauchhöhle. </li><li>Erste Naht der Bauchwand mit einer gebogenen Nadel und 5-0 Seidennaht und dann die Haut. Anwenden Lidocain (4%) auf die Wunde. Verwalten 120 mg / kg Aspirin inner Peritoneum zur Analgesie. Hinweis: Das gesamte Verfahren sollte in 20 min oder weniger durchgeführt werden. Es ist ratsam, dass Anfänger nur elektroporieren einige Embryonen, um die Betriebszeit kurz zu halten. Längerer Operationen wird die Überlebensrate der Embryonen zu verringern. </li><li> Nehmen Sie das Tier aus der Narkose Schläuche und eine Wiederherstellung auf dem Heizkissen auf einem Papier zu wischen. </li><li> Zurück Tier in den Käfig, halten Sie es auf dem Heizkissen bei 37 ° C und den Gesundheitszustand überwachen. Die Tiere in der Regel gut vertragen und die Operation beginnen sich langsam zu bewegen, kurz nachdem sie aus der Narkose Schlauch entfernt werden. Wenn übermäßige Blutungen oder Lethargie beobachtet wird, zu opfern das Tier sofort, indem IACUC genehmigt Euthanasie Verfahren wie Genickbruch oder Anästhesie Überdosis. </li><li> Zurück zu dem Käfig vivarium. Die Weibchen werden Geburt natürlich geben. </li></ol>

<ol><li>Fishell, G., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+inhibition+within+the+telencephalon%3A+%26%2334%3Bwhere+the+wild+things+are%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of inhibition within the telencephalon: &#34;where the wild things are&#34;.</a> Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).</li>
<li>Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+distinct+progenitor+populations+in+the+lateral+ganglionic+eminence%3A+implications+for+striatal+and+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis.</a> J Neurosci. 23, 167-174 (2003).</li>
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<li>Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologically+distinct+temporal+cohorts+of+cortical+interneurons+arise+from+telencephalic+Olig2-expressing+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors.</a> J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).</li>
<li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Dlx-2+%28Tes-1%29+gene+is+expressed+in+spatially+restricted+domains+of+the+forebrain%2C+face+and+limbs+in+midgestation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos.</a> Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+Dlx-1%2C+Dlx-2+%28Tes-1%29%2C+Gbx-2%2C+and+Wnt-3+in+the+embryonic+day+12.5+mouse+forebrain+defines+potential+transverse+and+longitudinal+segmental+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries.</a> J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).</li>
<li>Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+a+member+of+a+new+family+of+murine+Distal-less+homeobox+genes+in+the+developing+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+biologist%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain.</a> The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).</li>
<li>Close, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb1+is+an+activity-modulated+transcription+factor+required+for+the+terminal+differentiation+and+connectivity+of+medial+ganglionic+eminence-derived+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons.</a> J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472, 351-355 (2011).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239(2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Grenzen der Technik Während diese Technik ermöglicht Zelle autonom Analyse von Zellprozessen, ist es nicht geeignet für die Populationsanalyse. Die Elektroporationen sind sehr spärlich mit weniger als tausend Zellen elektroporiert pro Gehirn. Als Folge kann die Technik nicht verwendet werden, um Verhaltenskonsequenzen durch die genetische Manipulation von CGE abgeleiteten Inter bewerten. Während Elektroporationen durchgeführt bei E13.5 E14.5-Ziel MGE-Subtypen abg...

Der Großteil der kortikalen GABAergen Interneuronen stammen aus zwei transiente embryonale Strukturen nannte die medialen und Schwanzganglien Eminenzen (MGE und CGE jeweils) 4. Parvalbumin und Somatostatin exprimierenden Inter entstehen in der Erwägung, dass MGE Calretinin (Cr), Vasointestinal Peptid (VIP) und Reelin (Re) ausdrückt Inter stammen aus der CGE. Diese Intern Subtypen können durch ihre Geburtsdaten unterschieden werden. MGE abgeleitet Subtypen zwischen embryonalen Tag 9.5 (E9.5) und E16.5 5,6 geboren. Im Gegensatz dazu CGE abgeleitet Inter aus E12.5 E18.5 durch ihre Produktionshöchststand von 6 E15.5 geboren. Die genetische Targeting dieser spät geboren Bevölkerung bleibt jedoch unklar. Die murinen Distal-less (Dlx) Gene werden ausschließlich in den Entwicklungs ventralen Vorderhirn 3 ausgedrückt. GABAergen Interneuronen und Projektionsneuronen des Striatums, aber nicht Pyramidenzellen der Hirnrinde auszudrücken DLX1, 2,5, und 6 Gene in frühen Entwicklungsstadien 3. Tatsächlich sind die Deluxe, Gene in der MGE und CGE Subventrikularzone (SVZ) in allen GABAergen Vorläuferzellen exprimiert wird. Expression dieser Gene wird eingeschränkt, um Subtypen bei postmitotische Stufen 7-9 wählen. Vorherige experimentelle Beweismaterial zeigte, daß das Dlx5 / 6 Enhancer-Element ermöglicht die selektive Ausrichtung der GABAergen Linien in transgenen Mausmodellen 2. Wir haben die Verwendung von einer dieser Enhancer-Elementen im Rahmen der episomalen Expression in sich entwickelnden Maus-Gehirn. Wir Teil zusammen mit einem Minimalpromotor und dem enhanced green fluorescent protein (eGFP) in einen Bluescript (BS) Backbone-Plasmid (Figur 1) kloniert den Dlx5 / 6-Enhancer-Element. Wir haben das Plasmid durch Elektroporation in utero bei E15.5 selektiv auf Cr-, VIP-und Research-Subtypen 3,8,10. Unsere Technik ermöglicht spärlich Elektroporation, die erleichtertdie Rekonstruktion der morphologischen Merkmale singe Zellen. Darüber hinaus ist die außerordentlich hohe Genexpression in kortikalen GABAergen Neuronen ermöglicht funktionelle Studien. Wir führten Verlust und Gewinn von Funktionsprüfungen mit mehreren Wildtyp und dominant negative Gene 11.

<table><tbody><tr><td>Elektroporator&nbsp; mit Pedal</td><td>Protech International</td><td>CUY21</td><td></td></tr><tr><td>5 mm Paddelelektroden&nbsp&nbsp;</td><td>Protech International</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>DCT-15</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Instruments P30 Abzieher&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>3282322</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac Anästhesiesysteme</td><td>Harvard Apparat</td><td>726425</td><td></td></tr><tr><td>empfindliche Operationsschere 4,75" gerade scharf/scharf</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>SUT-1073-21</td><td></td></tr><tr><td>Micro Clip Applikationszange 5,5"</td><td>Roboz</td><td>RS-5410</td><td></td></tr><tr><td>2 Klemmschere</td><td>Roboz</td><td>RC-4894</td><td></td></tr><tr><td>Haltezange&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11031-15</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarrohre aus Glas&nbsp;</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td>Borosil 1,0 mm AD x 0,75 mm ID</td></tr><tr><td>Fast Grün</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Steril PBS</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr></tbody></table>

subtyp-selektive elektroporation kortikaler inter

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Die Studie des Zentralnervensystems (ZNS) Reifung beruht auf genetischer Ausrichtung der neuronalen Populationen. Allerdings hat die Aufgabe, die Beschränkung der Expression von Genen von Interesse spezifischen neuronalen Subtypen bemerkensanspruchs aufgrund der relativen Knappheit von spezifischen Promotorelemente bewährt. GABAergen Interneuronen bilden einen neuronalen Population mit umfangreichen genetischen und morphologischen Vielfalt. Tatsächlich haben mehr als 11 verschiedene Subtypen von GABAergen Interneuronen in der Maus Kortex 1 gekennzeichnet. Hier präsentieren wir ein angepasstes Protokoll für selektive Ausrichtung der GABAergen Populationen. Wir erreicht Subtyp selektive Ausrichtung von GABAergen Interneuronen mit Hilfe der Enhancer-Element des Homeobox Transkriptionsfaktoren Dlx5 und Dlx6, Homologen des Drosophila-Distal-less (DLL)-Gen 2,3, um die Expression spezifischer Gene durch in utero Elektroporation zu fahren.

Wir passten die in utero Elektroporation Technik, um Zelltyp-spezifische Ausrichtung der Reifung Neuronen zu erreichen. Um die Expression von eGFP in CGE-abgeleitete Inter zu fahren, haben wir die Dlx5 / 6 Enhancer-Element und beschränkt unsere Injektionen E15.5, die Bühne, wenn die Mehrheit der CGE-abgeleitete Inter erzeugt. Wir führten die Analyse auf P8 und P15 11 (Abbildungen 1 und 2). Wir bestätigten die ventrale Ursprung elektroporiert Neuronen durch C...

Dieses Verfahren zeigt, wie Interneuronen im sich entwickelnden Maus-Vorderhirn mittels in utero-Elektroporation gezielt angegriffen werden können. Diese Technik war besonders effizient, um eine selektive Genexpression in Interneuronen-Subtypen zu erreichen, die für die oberflächlichen Schichten des Kortex bestimmt sind.

Subtyp-selektive Elektroporation kortikaler Inter

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mit Hilfe der In-vivo-Elektroporation Interneurone im sich entwickelnden Mausgehirn zu gezielt anzusteuern. Dies wird erreicht, indem zunächst die Injektionsnadeln vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die embryonalen Gehirne aus dem anesthetisierten Tier zu entnehmen.Anschließend erfolgen DNA-Injektion und Elektroporation im Gehirn. Der letzte Schritt besteht darin, dem Tier eine Erholungsphase nach der Operation zu ermöglichen. Letztendlich wird die in utero-Elektroporation angewandt, um eine gezielte Ansteuerung spezifischer Interneuron-Subtypen zu ermöglichen.Der Vorteil dieser Methoden im Vergleich zu unseren bestehenden Techniken, wie der unspezifischen elektropulsiven Operation in utero, liegt darin, dass sie die Möglichkeit bieten, eine zellautonome Analyse einer Untergruppe kortikaler Interneurone durchzuführen. Die hohen GFP-Expressionsniveaus ermöglichen die Visualisierung und Analyse einzelner Interneurone. Diese Methode kann helfen, grundlegende Fragen im Bereich der neurodevelopmentalen Forschung zu beantworten, beispielsweise welche Regeln die Integration ausreifender Interneurone steuern.Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Mikroinjektionspipette vor, indem Sie eine Glas-Kapillare mit einem Pipettenzieher ziehen. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Kapillare und sammeln Sie die untere Nadel für die Mikroinjektion. Legen Sie nun eine anästhesierte trächtige Maus mit der Bauchseite nach oben auf die Heizplatte.Bedeken Sie die Nase mit einer Maske, die während der gesamten Operation weiterhin Isofluran liefert. Tragen Sie dann Augenschmiermittel auf beide Augen auf. Stellen Sie die Heizplatte auf 36 Grad Celsius ein, um anschließend eine Hypothermie zu verhindern.Überprüfen Sie das Fehlen von Fuß- und Schwanzreflexen, indem Sie die Hinterpfoten oder den Schwanz zwicken. Reinigen Sie anschließend die Bauchhaut mit 70 % Ethanol. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette nach oben.Erstellen Sie dann einen zwei Zentimeter kleinen vertikalen Schnitt entlang der Mittellinie, beginnend in der Mitte zwischen der dritten und vierten Paarung der Milchdrüsen. Achten Sie darauf, die Bauchwand mit runden Pinzetten nicht zu beschädigen. Ziehen Sie die embryonale Kette vorsichtig von der Körperhöhle weg.Lassen Sie die Kette auf den feuchten Tüchern ruhen. Beginnen Sie mit der Exposition einer Hälfte der Gebärmutter. Fahren Sie dann mit der Elektroporation der Embryonen fort, bevor Sie zur anderen Hälfte übergehen.Bereiten Sie in diesem Verfahren eine DNA-Lösung vor, indem Sie das Pellet, das aus einer standardmäßigen Maxi-Präparation-Reinigungsprozedur erhalten wurde, in destilliertem Wasser auflösen. Fügen Sie anschließend Fast Green in einem Verhältnis von 1 zu 20 zur DNA-Lösung hinzu, um eine Sichtbarmachung während der Injektion zu ermöglichen. Schneiden Sie danach die Spitze einer vorgezogenen Mikropipette mit einer feinen Pinzette ab, sodass sechs Millimeter vom Anfang der Schulter bis zum Ende der Spitze verbleiben.Beladen Sie danach die Mikropipette mit einem Mikroliter DNA-Lösung, die mit Fast Green für die Injektion versetzt wurde. Halten Sie den Kopf des Embryos mit runden Pinzetten fest. Führen Sie die Pipette im 45-Grad-Winkel in das Gehirn ein, wobei Sie auf das seitliche Ventrikel, das sich in der Nähe der Mittellinie befindet, zielen.Wenn die Nadel durch das Ventrikel hindurchdringt, ziehen Sie die Pipette langsam zurück. Das Ventrikel sollte grün werden, sobald die Lösung es zu füllen beginnt. An diesem Punkt bewegen Sie die Pipette nicht weiter und injizieren ein Mikroliter DNA.Ziehen Sie die Pipette dann vorsichtig zurück. Stellen Sie den ECM 830 auf acht 50-Millisekunden-Impulse von 45 Volt mit einem Intervall von 950 Millisekunden zwischen den Impulsen ein. Tauchen Sie die 5-Millimeter-Paddel-Elektroden in PBS ein, um eine effiziente Stromübertragung sicherzustellen.Danach platzieren Sie die Elektroden-Paddel um den Kopf des Embryos, wobei sich das positive Paddel über dem Ventrikel befindet, der die DNA-Lösung enthält. Positionieren Sie das positive Paddel leicht unterhalb des negativen Paddels, um einen ventralen Stromfluss durch die Ganglienanhöhen zu erzeugen. Dadurch wird eine ektopische Expression in parametralen Zellen minimiert.Jetzt geben Sie einen Impuls ab, indem Sie einmal das Fußpedal betätigen, entfernen Sie dann die Elektroden und wischen Sie diese sauber. Wiederholen Sie die Schritte für jeden der Embryonen. Nachdem alle Embryonen elektroporiert wurden.Geben Sie drei Milliliter PBS in die Bauchhöhle und bringen Sie die Embryonen in die Bauchhöhle zurück. Anschließend nähen Sie die Bauchdecke mit einer gebogenen Nadel und einer 5-0-Seidennaht und danach die Haut. Tragen Sie Lidocain auf die Wunde auf und verabreichen Sie zunächst 120 Milligramm pro Kilogramm Aspirin zur Analgesie.Entfernen Sie das Tier aus der Anästhesiesonde und lassen Sie es auf einem Papiertuch auf der Heizplatte auskurieren. Danach bringen Sie das Tier in den Käfig zurück. Halten Sie es weiterhin auf der Heizplatte bei 37 Grad Celsius und überwachen Sie den Gesundheitszustand.In diesem Experiment werden elektroporierte Interneurone durch die Expression von Subtyp-Markern, die von CGE abstammen, abgegrenzt. Dieses Bild zeigt, dass die von CGE abstammenden Interneurone mit einem DLX5/6-EGFP-Plasmid elektroporiert wurden. Dieses Bild zeigt ein VIP-exprimierendes Interneuron am Tag P8.Die EGFP-Expression grenzt den gesamten dendritischen Baum und den axonalen Verzweigungsapparat einzelner Neurone ab, und hier sehen wir einen NPY-exprimierenden Interneuronen am P8. Die NPY-Expression grenzt neurogliaform Zellen ab. Schließlich sehen wir hier einen NPY-exprimierenden Interneuronen am P15.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 20 Minuten durchgeführt werden. Durch die Kombination spezifischer Plasmide und genetisch veränderter Mauslinien ist es möglich, eine zeitliche und räumliche Kontrolle der Expression von Genen von Interesse zu erreichen. In einigen Experimenten verwenden wir das A-D-L-X-T-T-A-Plasmid, um die Expression AU-abhängiger Transgene zu induzieren.In diesen Experimenten unterdrücken wir die Expression des Transgens durch die Gabe von Doxycyclin.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

In utero Elektroporation ist eine wertvolle Methode zur Transfektion von neuronalen Vorläuferzellen in vivo. Abhängig von der Platzierung der Elektroden und der Entwicklungspsychologie Zeitpunkt der Elektroporation können bestimmte Teilmengen von kortikalen Zellen ausgerichtet werden. Gezielte Zellen können dann in vivo oder in vitro für die Auswirkungen der genetischen Veränderung untersucht werden.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle Gentransfer in eine räumlich-und zeitlich kontrollierten Art und Weise in den Entwicklungsländern das zentrale Nervensystem (ZNS). Hier beschreiben wir eine sehr anpassungsfähig in utero Elektroporation Protokoll, mit dem Ausdruck Konstrukte in mehreren embryonalen ZNS-Domänen, einschließlich der Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut liefern können.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

Dieses Video zeigt das Protokoll für die Einzelzell-Elektroporation von Genen sowohl in exzitatorischen als auch in inhibitorischen Neuronen in einer Reihe von in vitro hippokampalen Schnittkulturen. Die Technik ist nützlich, um spezifische molekulare und physiologische Funktionen von Neuronen zu untersuchen, einschließlich zellautonomer Mechanismen und transsynaptischer Proteininteraktionen.

Einzelzell-Elektroporation in organotypischen Hirnschnittkulturen: Eine In-vitro-Technik zur Verabreichung von Plasmiden in Zielneuronen in Hippocampus-Schnitten des Gehirns

Quelle: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Injektion eines Plasmidvektors, der das interessierende Gen trägt, in Interneuron-Vorläuferzellen in einem embryonalen Hirnschnitt, gefolgt von einer Elektroporation für den Plasmideintritt und die Genexpression. Diese modifizierten Vorläuferzellen können später zur Behandlung von Hirnerkrankungen...

Agarose-eingebetteter Elektroporations-unterstützter Gentransfer in kortikalen Interneuronen-Vorläuferzellen der Maus

Die Pia-Oberfläche ist eine einzigartige Vorläuferzone im ZNS, die Aufnahme wird immer mehr Aufmerksamkeit. Hier erläutern wir ein Verfahren für schnelle genetische Manipulation dieser Vorläuferzone unter Verwendung einer modifizierten Methode der Elektroporation. Dieses Verfahren kann für zelluläre und molekulare Untersuchungen der Zelllinien und Signalwegen in der Zelldifferenzierung beteiligt sind, verwendet werden, um das Schicksal und die Eigenschaften von Tochterzellen zu erklären.

Neonatal Pial Oberflächen Elektroporation

Dieses Manuskript enthält Protokolle , die in utero Elektroporation (IUE) verwenden , um die strukturelle Konnektivität von Neuronen in der Ebene einzelner Zellen und die Erregbarkeit von fluoreszenzmarkierten Neuronen zu beschreiben. Histologie verwendet dendritische und axonale Projektionen zu charakterisieren. Whole-cell recording in akuten Scheiben verwendet Erregbarkeit zu untersuchen.

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das entwickelt wurde, um die Aktivität kortikaler Interneureuritoren zu manipulieren, die in den Kortex von frühen postnatalen Mäusen transplantiert wurden.

Transplantation von chemogenetisch hergestellten kortikalen Interneureuren in frühpostnatale Maushirne

Die doppelte Utero-Elektroporation ermöglicht die Ausrichtung auf Zellpopulationen, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Diese Technik ist nützlich, um Wechselwirkungen zwischen diesen Zellpopulationen mit fluoreszierenden Proteinen unter normalen Bedingungen, aber auch nach funktionellen Experimenten zu visualisieren, um Gene von Interesse zu stören.

Double In Utero Elektroporation, um zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzuvisieren

Hier wird ein Protokoll für die Einzelzellelektroporation vorgestellt, das Gene sowohl in exzitatorischen als auch in inhibitorischen Neuronen über eine Reihe von In-vitro-Hippocampus-Schichtkulturaltern hinweg liefern kann. Unser Ansatz bietet eine präzise und effiziente Expression von Genen in einzelnen Zellen, mit denen zellautonome und interzelluläre Funktionen untersucht werden können.

Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Slice-Kulturen von Hippocampus-Exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen der Maus

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die virale Transduktion diskreter Hirnregionen mit optogenetischen Konstrukten beschreibt, um eine synapsenspezifische elektrophysiologische Charakterisierung in akuten Nagetierhirnschnitten zu ermöglichen.

Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex

Hier stellen wir die akute genetische Manipulation von geschnittenen menschlichen kortikalen Organoiden durch Elektroporation vor. Diese kortikalen Organoidmodelle eignen sich besonders gut für die Injektion, da ventrikelähnliche Strukturen nach dem Schneiden leicht identifiziert werden können, was die funktionelle Untersuchung der kortikalen Entwicklung des Menschen, neurologischer Entwicklungsstörungen und der kortikalen Evolution ermöglicht.

Elektroporation von geschnittenen humanen kortikalen Organoiden zur Untersuchung der Genfunktion

Erfahren Sie die subtyp-selektive Elektroporation kortikaler Interneuronen in der sich entwickelnden Maus-Vorderhirn. Diese Methode ermöglicht gezielte Genexpression in spezifischen Interneuronen-Subtypen für die Entwicklungsneurobiologie.

Subtyp-selektive Elektroporation kortikaler Inter

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