Subtyp-selektive Elektroporation kortikaler Inter

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mit Hilfe der In-vivo-Elektroporation Interneurone im sich entwickelnden Mausgehirn zu gezielt anzusteuern. Dies wird erreicht, indem zunächst die Injektionsnadeln vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die embryonalen Gehirne aus dem anesthetisierten Tier zu entnehmen.

Anschließend erfolgen DNA-Injektion und Elektroporation im Gehirn. Der letzte Schritt besteht darin, dem Tier eine Erholungsphase nach der Operation zu ermöglichen. Letztendlich wird die in utero-Elektroporation angewandt, um eine gezielte Ansteuerung spezifischer Interneuron-Subtypen zu ermöglichen.

Der Vorteil dieser Methoden im Vergleich zu unseren bestehenden Techniken, wie der unspezifischen elektropulsiven Operation in utero, liegt darin, dass sie die Möglichkeit bieten, eine zellautonome Analyse einer Untergruppe kortikaler Interneurone durchzuführen. Die hohen GFP-Expressionsniveaus ermöglichen die Visualisierung und Analyse einzelner Interneurone. Diese Methode kann helfen, grundlegende Fragen im Bereich der neurodevelopmentalen Forschung zu beantworten, beispielsweise welche Regeln die Integration ausreifender Interneurone steuern.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Mikroinjektionspipette vor, indem Sie eine Glas-Kapillare mit einem Pipettenzieher ziehen. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Kapillare und sammeln Sie die untere Nadel für die Mikroinjektion. Legen Sie nun eine anästhesierte trächtige Maus mit der Bauchseite nach oben auf die Heizplatte.

Bedeken Sie die Nase mit einer Maske, die während der gesamten Operation weiterhin Isofluran liefert. Tragen Sie dann Augenschmiermittel auf beide Augen auf. Stellen Sie die Heizplatte auf 36 Grad Celsius ein, um anschließend eine Hypothermie zu verhindern.

Überprüfen Sie das Fehlen von Fuß- und Schwanzreflexen, indem Sie die Hinterpfoten oder den Schwanz zwicken. Reinigen Sie anschließend die Bauchhaut mit 70 % Ethanol. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette nach oben.

Erstellen Sie dann einen zwei Zentimeter kleinen vertikalen Schnitt entlang der Mittellinie, beginnend in der Mitte zwischen der dritten und vierten Paarung der Milchdrüsen. Achten Sie darauf, die Bauchwand mit runden Pinzetten nicht zu beschädigen. Ziehen Sie die embryonale Kette vorsichtig von der Körperhöhle weg.

Lassen Sie die Kette auf den feuchten Tüchern ruhen. Beginnen Sie mit der Exposition einer Hälfte der Gebärmutter. Fahren Sie dann mit der Elektroporation der Embryonen fort, bevor Sie zur anderen Hälfte übergehen.

Bereiten Sie in diesem Verfahren eine DNA-Lösung vor, indem Sie das Pellet, das aus einer standardmäßigen Maxi-Präparation-Reinigungsprozedur erhalten wurde, in destilliertem Wasser auflösen. Fügen Sie anschließend Fast Green in einem Verhältnis von 1 zu 20 zur DNA-Lösung hinzu, um eine Sichtbarmachung während der Injektion zu ermöglichen. Schneiden Sie danach die Spitze einer vorgezogenen Mikropipette mit einer feinen Pinzette ab, sodass sechs Millimeter vom Anfang der Schulter bis zum Ende der Spitze verbleiben.

Beladen Sie danach die Mikropipette mit einem Mikroliter DNA-Lösung, die mit Fast Green für die Injektion versetzt wurde. Halten Sie den Kopf des Embryos mit runden Pinzetten fest. Führen Sie die Pipette im 45-Grad-Winkel in das Gehirn ein, wobei Sie auf das seitliche Ventrikel, das sich in der Nähe der Mittellinie befindet, zielen.

Wenn die Nadel durch das Ventrikel hindurchdringt, ziehen Sie die Pipette langsam zurück. Das Ventrikel sollte grün werden, sobald die Lösung es zu füllen beginnt. An diesem Punkt bewegen Sie die Pipette nicht weiter und injizieren ein Mikroliter DNA.

Ziehen Sie die Pipette dann vorsichtig zurück. Stellen Sie den ECM 830 auf acht 50-Millisekunden-Impulse von 45 Volt mit einem Intervall von 950 Millisekunden zwischen den Impulsen ein. Tauchen Sie die 5-Millimeter-Paddel-Elektroden in PBS ein, um eine effiziente Stromübertragung sicherzustellen.

Danach platzieren Sie die Elektroden-Paddel um den Kopf des Embryos, wobei sich das positive Paddel über dem Ventrikel befindet, der die DNA-Lösung enthält. Positionieren Sie das positive Paddel leicht unterhalb des negativen Paddels, um einen ventralen Stromfluss durch die Ganglienanhöhen zu erzeugen. Dadurch wird eine ektopische Expression in parametralen Zellen minimiert.

Jetzt geben Sie einen Impuls ab, indem Sie einmal das Fußpedal betätigen, entfernen Sie dann die Elektroden und wischen Sie diese sauber. Wiederholen Sie die Schritte für jeden der Embryonen. Nachdem alle Embryonen elektroporiert wurden.

Geben Sie drei Milliliter PBS in die Bauchhöhle und bringen Sie die Embryonen in die Bauchhöhle zurück. Anschließend nähen Sie die Bauchdecke mit einer gebogenen Nadel und einer 5-0-Seidennaht und danach die Haut. Tragen Sie Lidocain auf die Wunde auf und verabreichen Sie zunächst 120 Milligramm pro Kilogramm Aspirin zur Analgesie.

Entfernen Sie das Tier aus der Anästhesiesonde und lassen Sie es auf einem Papiertuch auf der Heizplatte auskurieren. Danach bringen Sie das Tier in den Käfig zurück. Halten Sie es weiterhin auf der Heizplatte bei 37 Grad Celsius und überwachen Sie den Gesundheitszustand.

In diesem Experiment werden elektroporierte Interneurone durch die Expression von Subtyp-Markern, die von CGE abstammen, abgegrenzt. Dieses Bild zeigt, dass die von CGE abstammenden Interneurone mit einem DLX5/6-EGFP-Plasmid elektroporiert wurden. Dieses Bild zeigt ein VIP-exprimierendes Interneuron am Tag P8.

Die EGFP-Expression grenzt den gesamten dendritischen Baum und den axonalen Verzweigungsapparat einzelner Neurone ab, und hier sehen wir einen NPY-exprimierenden Interneuronen am P8. Die NPY-Expression grenzt neurogliaform Zellen ab. Schließlich sehen wir hier einen NPY-exprimierenden Interneuronen am P15.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 20 Minuten durchgeführt werden. Durch die Kombination spezifischer Plasmide und genetisch veränderter Mauslinien ist es möglich, eine zeitliche und räumliche Kontrolle der Expression von Genen von Interesse zu erreichen. In einigen Experimenten verwenden wir das A-D-L-X-T-T-A-Plasmid, um die Expression AU-abhängiger Transgene zu induzieren.

In diesen Experimenten unterdrücken wir die Expression des Transgens durch die Gabe von Doxycyclin.